ĐỖ bá đại NGHIÊN cứu điều CHẾ và KHẢO sát một số CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ lá PHÈN ĐEN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ BÁ ĐẠI
Mã sinh viên: 1701070

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG
CAO KHƠ LÁ PHÈN ĐEN
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI – 2022


LỜI CẢM ƠN
Với lịng biết ơn và kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Thái Hà
Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội – người đã trực tiếp
hướng dẫn, dìu dắt tôi từ những ngày đầu nghiên cứu, giúp tôi hồn thành khóa luận
này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
ThS. Phạm Thị Linh Giang – Bộ môn Thực Vật và TS. Phạm Lê Minh – Bộ
mơn Hóa phân tích và độc chất, những người thầy luôn sẵn sàng giúp đỡ, giải đáp thắc
mắc, khó khăn mà tơi gặp phải.
Ban Giám Hiệu và các phịng ban, các thầy cơ giáo, các cán bộ nhân viên trường
Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi với nhiều kiến thức trong suốt 5 năm
học tại đây.

Các anh chị cao học làm thực nghiệm tại bộ môn Dược học cổ truyền đã ln
nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình làm nghiên cứu
và thực nghiệm. Các bạn cùng làm khóa luận khóa 72, bạn Đào Thị Hà Lan và các em
Ngô Thị Kim Ngân, Trần Văn Đức, Phạm Ngọc Châu, Đỗ Trang Ngân, Lý Phương
Linh trong nhóm nghiên cứu của bộ mơn Dược học cổ truyền, tất cả đã cùng giúp đỡ,
động viên, hỗ trợ nhau rất nhiều.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè
đã ln khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Do kiến thức bản thân cịn giới hạn nên luận văn khơng tránh khỏi những hạn chế
và thiếu sót. Tơi rất mong nhận được sự góp ý, chỉnh sửa của q thầy cơ, bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2022
Sinh viên

Đỗ Bá Đại


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .............................................................
DANH MỤC BẢNG .........................................................................................................
DANH MỤC HÌNH ..........................................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Tổng quan về cây Phèn đen ..................................................................................2
1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại .....................................................................2
1.1.2. Phân bố ..........................................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................2
1.2. Tổng quan về lá Phèn đen ....................................................................................3
1.2.1. Thành phần hóa học.......................................................................................3
1.2.2. Tác dụng sinh học ..........................................................................................7

1.2.3. Công dụng trong y học cổ truyền và dân gian .............................................10
1.3. Tổng quan về cao khô.........................................................................................11
1.3.1. Định nghĩa ...................................................................................................11
1.3.2. Phương pháp điều chế cao khô ....................................................................11
1.3.3. Yêu cầu chất lượng với cao khô ..................................................................12
1.4. Các phương pháp định lượng acid gallic ............................................................12
1.4.1. Phương pháp sắc ký khí...............................................................................12
1.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) .............................12
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......................................12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .....................................................................................14
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu .........................................................................14
2.1.2. Thiết bị, máy móc ........................................................................................14
2.1.3. Thuốc, hóa chất, chất chuẩn ........................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................15
2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn đen ..............15


2.3.2. Quy trình chiết xuất và định lượng acid gallic toàn phần chiết được trong
dược liệu lá Phèn đen ............................................................................................17
2.3.3. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất cao
khơ giàu acid gallic tồn phần từ lá Phèn đen .......................................................18
2.3.4. Phương pháp tối ưu hóa q trình chiết xuất cao khơ giàu acid gallic tồn
phần từ lá Phèn đen ...............................................................................................18
2.3.5. Điều chế cao khơ giàu acid gallic tồn phần theo các thơng số quy trình
chiết xuất đã được tối ưu hóa ................................................................................19
2.3.6. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao khô lá Phèn đen ...........................20
2.3.7. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................................21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................22

3.1. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần
trong lá Phèn đen .......................................................................................................22
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................22
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn đen
...............................................................................................................................23
3.2. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất..................26
3.2.1. Nhiệt độ chiết xuất.......................................................................................27
3.2.2. Thời gian chiết xuất .....................................................................................28
3.2.3. Nồng độ EtOH (tt/tt) ....................................................................................28
3.3. Kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu .............................................29
3.3.1. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm ...............................................29
3.3.2. Kết quả tối ưu hóa q trình chiết xuất .......................................................31
3.4. Kết quả điều chế cao khơ giàu acid gallic tồn phần theo các thơng số quy trình
chiết xuất đã được tối ưu ...........................................................................................33
3.5. Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô điều chế được ...........34
3.5.1. Cảm quan, thể chất, màu sắc, mùi vị ...........................................................34
3.5.2. Mất khối lượng do làm khơ .........................................................................34
3.5.3. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng..................................................................34
3.5.4. Định lượng acid gallic toàn phần ................................................................35
3.6. Bàn luận ..............................................................................................................36


3.6.1. Về phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn đen ........36
3.6.2. Về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao khơ lá Phèn đen
giàu acid gallic toàn phần ......................................................................................37
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT....................................................................40
4.1. Kết luận...............................................................................................................40
4.1.1. Về xây dựng phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn
đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................40
4.1.2. Về tối ưu hóa quy trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ lá Phèn đen .....40

4.1.3. Về khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao khô lá Phèn đen giàu acid gallic
toàn phần điều chế được ........................................................................................40
4.2. Đề xuất ................................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DĐTQ

Dược điển Trung Quốc

DĐVN

Dược điển Việt Nam

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

TT

Thuốc thử

YHCT

Y học cổ truyền

OFAT

One factor at the time

CCD

Mơ hình phức hợp trung tâm

STT

Số thứ tự

tt/tt

Thể tích/thể tích

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

EtOAc

Ethylacetat

GA

Acid gallic


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả tính phù hợp hệ thống của phương pháp định lượng .......................23
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng acid gallic ..........................25
Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp định lượng ....................25
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng ............................26
Bảng 3.5. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm .................................................30
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mơ hình biểu thị mối tương quan
giữa hàm lượng acid gallic toàn phần chiết được trong dược liệu với các biến đầu vào
.......................................................................................................................................32
Bảng 3.7. Kết quả kiểm định mơ hình bằng thực nghiệm (n=3) ...................................33
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô ..................................34
Bảng 3.9. Kết quả định lượng acid gallic tồn phần trong cao khơ điều chế được .......35


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức của các tanin nhóm pyrogallic .......................................................3
Hình 1.2. Cơng thức của tanin nhóm pyrocatechic .........................................................4
Hình 1.3. Cơng thức acid gallic .......................................................................................4
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của một số flavonoid trong lá ............................................5
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của triterpenoid trong lá Phèn đen ....................................5
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của một số sterol trong lá ..................................................6

Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của p-coumaric ..................................................................6
Hình 1.8. Công thức cấu tạo của một số thành phần khác ..............................................7
Hình 2.1. Quy trình điều chế cao khơ lá Phèn đen giàu acid gallic tồn phần ..............20
Hình 3.1. Hình ảnh phổ của acid gallic trong khoảng 230 – 350 nm ............................22
Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và mẫu thử ......................................................23
Hình 3.3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng GA.................24
Hình 3. 4. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết xuất.............................................................27
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất ............................................................28
Hình 3.6. Kết quả khảo sát nồng độ ethanol (tt/tt) ........................................................29
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic toàn phần chiết
được trong dược liệu với các biến đầu vào....................................................................31
Hình 3.8. Hình ảnh cao khơ điều chế được ...................................................................34
Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC của cao khơ lá Phèn đen (T) và chất đối chiếu acid gallic (C).35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Phèn đen là một loài cây mọc hoang rất phổ biến ở Việt Nam, trong dân gian lá
Phèn đen được biết đến là một dược liệu quý với tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát
khuẩn, tiêu viêm, chữa mụn nhọn, chữa tiêu chảy, giun sán,... Các nghiên cứu thực
nghiệm hiện đại cũng đã chỉ ra các tác dụng sinh học tiềm năng của lá Phèn đen về tính
kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa. Điều này cho thấy Phèn đen là một loại dược
liệu tiềm năng để phát triển các dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy
hóa từ thiên nhiên với giá thành rẻ. Tuy nhiên hiện nay loại dược liệu có số lượng dồi
dào và giá thành rẻ này lại chưa được khai thác đúng tiềm năng.
Thành phần hóa học của lá Phèn đen được xác định chứa các nhóm chất tanin,
flavonoid, đường khử, sterol. Trong đó, các tanin gallic và acid gallic là thành phần
chính mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm cho lá Phèn đen. Tiêu chí để đánh
giá hàm lượng các thành phần này đó là dựa vào hàm lượng acid gallic toàn phần trong
lá Phèn đen.
Để hướng tới phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm từ lá Phèn đen,

việc nghiên cứu điều chế dạng bào chế cho dịch chiết dược liệu này là cần thiết, trong
đó cao khơ là dạng bán thành phẩm trung gian để tiếp tục chuyển sang dạng bào chế
khác như dung dịch, viên nang, viên nén, kem, gel,... Việc chiết xuất để thu được hàm
lượng acid gallic tồn phần tối ưu đóng vai trị quan trọng quyết định chất lượng của cao
khô. Đồng thời việc xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô là rất cần thiết để
đảm bảo chất lượng cho chế phẩm này trong quá trình lưu hành trên thị trường.
Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu điều chế và khảo sát một số chỉ tiêu
chất lượng cao khô lá Phèn đen” được đề xuất nghiên cứu với 4 mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá
Phèn đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất theo hướng tối ưu về hàm lượng acid gallic
toàn phần chiết được trong dược liệu lá Phèn đen.
3. Điều chế cao khô lá Phèn đen giàu acid gallic theo các thơng số quy trình chiết
xuất đã được tối ưu hóa.
4. Khảo sát một số chỉ tiêu: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, định tính, định
lượng acid gallic tồn phần của cao khơ lá Phèn đen giàu acid gallic điều chế được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Phèn đen
1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir. [4]
Tên đồng nghĩa:

Phyllanthus multiforus Willd. [11]
Anisonema multiflora (Willd.) Wight. [40]
Kirganelia reticulata (Poir.) Baillon. [40]
Cicca microcarpa Benth. [40]

Kirganelia multiflora Baillon ex Thw. [40]
Kirganelia lineata (Willd.) Alston. [40]

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009), cây
Phèn đen thuộc chi Diệp hạ châu (Phyllanthus), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Sơ ri
(Malpighiales), lớp thực vật hai lá mầm (Magnoliopisida), ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae).
1.1.2. Phân bố
Phèn đen là loài cây nhiệt đới, phân bố khá phổ biến ở các nước vùng Đông –
Nam Á và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc hầu như ở khắp các tỉnh, từ vùng
đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp ở độ cao dưới 500m. Song các tỉnh có Phèn
đen mọc tập trung nhất lại ở vào vùng trung du Bắc Bộ, gồm Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh
Phúc, Phú Thọ, Hà Tây, Hịa Bình [4].
Phèn đen là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường mọc thành bụi lớn dọc theo các bờ
nước, ở ven rừng núi đá vôi, bờ nương rẫy và lẩn trong các lùm bụi quanh làng. Cây có
khả năng phân cành nhiều ngay từ gốc, ra hoa quả nhiều hàng năm. Nước và chim là
những tác nhân phát tán hạt giống đi khắp nơi. Cây có khả năng tái sinh cây chồi khỏe
sau khi bị chặt [4].
1.1.3. Đặc điểm thực vật [4], [16]
Cây nhỏ, mọc thành bụi, cao 2-4m. Cành mềm, màu nâu nhạt, lúc đầu có lơng
màu xám, sau nhẵn. Lá mọc so le, phiến mỏng, hình trái xoan hoặc bầu dục, gốc và đầu
tù hoặc hơi nhọn, dài 1,5-3 cm, rộng 0,6-1,2 cm, hai mặt nhẵn, gần như cùng màu hoặc
mặt trên hơi sẫm hơn mặt sau; cuống rất ngắn 2-5mm; lá kèm hình tam giác hẹp.

2


Hoa mọc ở kẽ lá, đơn độc hoặc 2-3 cái mơi; hoa đơn tính cùng gốc; hoa đực có 5
lá dài, 5 nhị, 3 cái dính nhau và 2 cái rời nhau; hoa cái có đài giống hoa đực nhưng to
hơn, bầu 6-12 ơ, mỗi ơ có 2 nỗn.

Quả mọng, hình cầu thn, rộng 4-6 mm,khi chín màu đen, hạt màu nâu nhạt.
Hạt hình tam giác, 1,6-2 mm màu nâu.
Mùa hoa quả: tháng 8-10.
1.2. Tổng quan về lá Phèn đen
1.2.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học trong lá Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) gồm các
nhóm chất: tanin, flavonoid, triterpenoid, sterol, cumarin, acid phenolic,...
1.2.1.1. Tanin
Tanin trong lá gồm 2 nhóm: tanin pyrogallic và tanin pyrocatechic
 Tanin pyrogallic:
Dịch chiết methanol phát hiện có corilagin [34], methylmyricetin
rhamnoside-gallate [50].

Corilagin

methylmyricetin rhamnoside-gallate

Hình 1.1. Cơng thức của các tanin nhóm pyrogallic
 Tanin pyrocatechic:
Dịch chiết methanol phân lập được methyl este của acid geraniinic ((5R*,
6R*) - 4, 6 – dimethoxycarbonyl – 5 - [2′ ,3′ ,4′ - trihydroxy – 6 ′(methoxycarbonyl) phenyl] - 5, 6 – dihydro - 2H – pyran – 2 - one) [41].

3


(5R* ,6R* )-4,6-Dimethoxycarbonyl-5 [2′
,3′ , 4′-trihydroxy-6′-(methoxycarbonyl)
phenyl]-5,6 dihydro-2H-pyran-2-one
Hình 1.2. Cơng thức của tanin nhóm pyrocatechic
1.2.1.2. Acid phenolic

Acid gallic [35], [41], [48]

Hình 1.3. Cơng thức acid gallic
1.2.1.3. Flavonoid
Có 8 flavanoid glycosid được tìm thấy trong các phân đoạn của dịch chiết
methanol: isoquercitrin (quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid); quercitrin (quercetin 3-Oα-L-rhamnopyranosid); astragalin (kaempferol 3-O-β –D glucopyranosid) [3], [35], ;
kaempferol

-

3-rutinoside

(kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(6→1)-β-D-

glucopyranosid) [35], [48], rutin (quercetin - 3-O-rutinosid) [3], [17], [35], [48] (hàm
lượng 2.503 % [17]); icariin; isomyricitrin; rhapontin; silybin [50].

Isoquercitrin

Quercitrin
4


Rutin

Astragalin

Kaempferol-3-rutinosid
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của một số flavonoid trong lá
1.2.1.3. Triterpenoid

Dịch chiết dầu hỏa của lá có Fiedelin, golchinonol, friedelan-3β-ol, acid betulinic
[22], epifriedelanol [12]. Trong dịch chiết methanol có lupeol, lupeol acetat [48].

Friedelin

Friedelan-3β-ol

Lupeol

Golchidonol

Lupeol acetate

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của triterpenoid trong lá Phèn đen
5


1.1.1.4. Sterol
Lá Phèn đen có các sterol: β-sitosterol và β-sitosterol-3-O-β-glucoside [35];
stigmasterol [24], [32], và stigmasterol-3-O-β-glucoside [35]; stigmast-22-en-3-ol và
stigmast-5-en-3-ol [35]; prirosinol [46].

β-sitosterol

Stigmasterol

Sitosterol-3-O-β-glucoside

Stigmasterol-3-O-β-glucoside

Stigmast-22-en-3-ol

Stigmast-5-en-3-ol

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của một số sterol trong lá
1.1.1.5. Comarin
Acid p-coumaric [25], [38]

Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của p-coumaric

6


1.1.1.6. Các thành phần khác
Acid ellagic [34], [38], [48], acid metylellagic [41], acid 2,7-Di-O-methylellagic
[34]; Phân đoạn dịch chiết dichloromethane có acid 3,3',4-tri-O-methylellagic [46],
methyl gallate [34], [41].

Acid ellagic

Acid 2,7-Di-O-methylellagic

Methyl gallate

Acid 3,3',4-tri-O-methylellagic

Hình 1.8. Công thức cấu tạo của một số thành phần khác
1.2.2. Tác dụng sinh học
1.2.2.1. Tác dụng kháng khuẩn
Các cao chiết từ lá của Phèn đen thể hiện khả năng kháng khuẩn cao hơn so với

cao chiết xuất từ thân hoặc rễ [25].
Các cao chiết methanol, ethanol, chloroform, hexan, ether của lá Phèn đen được
nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn in vitro bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên các vi
khuẩn gram dương (Sarcina lute, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus-β-haemolytica) và vi khuẩn
gram âm (Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Shigella
sonnei) [7], [19], [28], [47], [49].
Các vùng ức chế của các cao chiết methanol, chloroform, hexan lần lượt là 9,0730,18 mm; 8,17-24,57 mm và 5,60-14,67 mm [47]. Trong đó, cao chiết methanol thể
hiện tính kháng khuẩn tốt nhất [47], [49].
Cả 2 cao chiết methanol và nước đều cho vùng ức chế 11 mm đối với vi khuẩn
Gram dương (Staphylococus aureus), trong khi đó vùng ức chế của kháng sinh tiêu
chuẩn Gentamincin là 16 mm. Điều này được coi là sự thể hiện khả năng kháng khuẩn
7


mạnh đối với vi khuẩn gram dương của cao chiết methanol và nước. Đối với vi khuẩn
gram âm (Salmonella paratyphi), cao chiết methanol và nước cũng cho vùng ức chế 910 mm. Cao chiết nước còn thể hiện khả năng chống lại vi khuẩn Escherichia coli (vùng
ức chế 7 mm) [19].
Cao chiết ethanol, cloroform, ether của lá có tác dụng chống lại vi khuẩn gram
dương (Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Shigella
sonnei)

và vi khuẩn gram âm (Sarcina lute, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus-β-haemolytica). Trong đó dịch
chiết ethanol có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều chủng vi khuẩn, đặc biệt là chủng S.
aureus – vi khuẩn kháng Methicillin và P. aeruginosa – một loại vi khuẩn đa kháng.
Vùng ức chế của Tetracyclin thấp hơn nhiều so với vùng ức chế của dịch ethanol [7].
Cao chiết xuất ethanol, methanol và nước của lá có khả năng diệt khuẩn đối với
E. coli, P. aeruginosa, S. Aureus ngoại trừ các loài Klebsiella pneumoniae. Trong đó

cao0 chiết xuất từ nước có ít hoạt tính nhất [6].
1.2.2.2. Tác dụng chống viêm
Dịch chiết từ lá Phèn đen đã được báo cáo có tính chống viêm [8], [26], [31],
[45], [47]. Trong mơ hình phù chân chuột do carrageenan gây ra, dịch chiết ether dầu
hỏa và dịch chiết methanol ở mức liều 300 mg/kg cho thấy khả năng ứng chế lần lượt là
94,9% và 81,57% [26]. Dịch chiết methanol ở mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg gây
tác dụng chống viêm đáng kể khi so với thuốc đối chứng Diclofenac [31]. Dịch chiết
methanol 80% cho thấy tác dụng chống viêm ở mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg khi
so với thuốc đối chứng Idomethacin [8]. Liều 300 mg/kg của dịch chiết ethyl acetat,
tương đương với 30 g lá/kg thể trọng chuột có tác dụng giảm viêm 60,49% [31].
1.2.2.3. Tác dụng khác
1.2.2.3.1. Tác dụng giảm đau
 Tác dụng giảm đau ngoại vi:
Trong thử nghiệm quằn quại do axit axetic gây ra trên chuột, dịch chiết metanol
ở liều 250 mg/kg thể trọng chuột, dịch chiết ether ở liều 500 mg/kg và dịch chiết
dichloromethane ở liều 500 mg/kg cho thấy kết quả có hoạt tính giảm đau mạnh (tương
ứng là 74%, 77% và 65% ức chế) [19]. Dịch chiết Methanol 80% của lá ở mức liều 100
mg/kg và 200 mg/kg có khả năng ức chế quằn quại lần lượt là 40,19%, 51,95% [52].
Chiết xuất ethyl acetate của các bộ phận trên mặt đất của Phèn đen với liều lượng 150
và 300 mg/kg thể trọng chuột cho thấy khả năng ức chế quằn quại lần lượt là 51,23% và
65,12% [45].
 Tác dụng giảm đau trung ương:

8


Dịch chiết methanol của lá có tác dụng giảm đau theo cơ chế ức chế thành kinh
trung ương trên chuột nhắt trắng với liều tương đương khoảng 30 g lá/kg. Thời gian
phản ứng lại của chuột trong nhóm uống dịch chiết methanol khoảng 6,2-6,7 giây
(60,49%); trong khi ở nhóm tiêm morphin 2 mg/kg dưới da là 5,82 giây (96,7%) (p<

0,01) [31].
1.2.2.3.2. Tác dụng trên cholesterol máu
Dịch chiết nước và methanol của tồn cây Phèn đen được đánh giá hoạt tính hạ
lipid máu ở liều 500 và 750 mg/kg thể trọng chuột, được thực hiện so với thuốc tiêu
chuẩn hạ lipid máu là Atorvastatin (0,4 mg/kg). Các dịch chiết xuất làm giảm đáng kể
cholesterol toàn phần (P <0,001), triglycerid (P <0,001) và chỉ số xơ vữa (P <0,001) khi
so sánh với nhóm chứng. Mức HDL cũng tăng rõ rệt [43]. Dịch chiết nước của các bộ
phận trên mặt đất có tác dụng hạ cholesterol máu. Tại liều 250 mg/kg và 500 mg/kg
tương đương với 1,6 g và 3,2 g dược liệu đều có tác dụng hạ tổng lượng cholesterol,
VLDL-cholesterol, triglycerid (TG), LDL-cholesterol; trong khi đó làm tăng nồng độ
HDL-cholesterol (p<0,05) [36].
1.2.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết nước của Phèn đen được thử nghiệm trên các mơ hình chống oxy hóa
cho thấy hiệu quả với các liều lần lượt là 20,36 μg/ml (loại bỏ gốc DPPH), 42,59 μg/ml
(loại bỏ gốc ABTS), 32 μg/ml (hoạt động chelat hóa sắt) và 41,91 μg/ml (peroxy hóa
lipid) 122,8 μg/ml (loại bỏ gốc oxit nitric) và 2,57 μg/ml (DMSO kiềm). Trong thử
nghiệm tổng khả năng chống oxy hóa, 1 mg dịch chiết tương đương với 51 μg acid
ascorbic. Nó cho thấy ức chế 66,64% q trình glycosyl hóa hemoglobin. Trong tất cả
các thử nghiệm, tồn tại một mối tương quan đáng kể giữa nồng độ của chất chiết xuất
và tỷ lệ phần trăm ức chế các gốc tự do, thải sắt hoặc ức chế peroxy hóa lipid. Đặc tính
chống oxy hóa có thể liên quan đến polyphenol trong dịch chiết [18].
Dịch chiết metanol từ thực vật cho thấy hiệu quả khả quan trong việc ức chế
DPPH. Ở nồng độ 400 μg/ml, tác động diệt gốc tự do của các dịch chiết khác nhau của
toàn bộ cây đối với gốc DPPH tăng lên theo thứ tự: dịch chiết ethanolic (73%) < dịch
chiết methanol (82,4%). Dịch chiết methanol của tồn bộ cây cho thấy hoạt tính ức chế
gốc tự do cao hơn, tương đương với hoạt tính của BHT tiêu chuẩn (85%) ở 400 μg/ml
[37].
1.2.2.3.5. Tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Các dịch chiết methanol của các bộ phân lá, rễ, thân cây được tiến hành nghiên
cứu tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum trên mơ hình invitro.

Kết quả cho thấy dịch chiết lá cho tác dụng tốt nhất chống lại Plasmodium falciparum
với IC50 ≤ 10 microgam/ml [39].
9


1.2.2.3.6. Tác dụng cầm tiêu chảy
Dịch chiết methanol lá Phèn đen đã được tiến hành thử nghiệm đặc tính chống
tiêu chảy. Chuột bị gây tiêu chảy theo hai phương pháp: dầu thầu dầu và magie sulfat.
Thuốc đối chiếu là loperamid. Liều 200 mg/kg và 400 mg/kg thể trọng chuột của dịch
chiết methanol cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc kiểm soát tiêu chảy [33].
1.2.2.3.7. Tác dụng hạ glucose máu
Hoạt động hạ glucose máu được thử nghiệm trên chuột nhắt trắng, chuột được
gây tăng đường huyết và đái tháo đường do alloxan. Dịch chiết xuất methanol của lá
Phèn đen được sử dụng ở liều 150 mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột theo đường
uống. Kết quả thử nghiệm trong thời gian 7 ngày liên tục cho thấy hoạt động hạ đường
huyết có ý nghĩa ở cả 2 mức liều so với thuốc chứng là Metformin hydroclorid (100
mg/kg) [44].
Tác dụng hạ đường huyết phụ thuộc liều. Dịch chiết methanol của lá ở các mức
liều 100, 200, 400 mg/kg thể trọng chuột đều cho tác dụng hạ đường huyết đáng kể so
với thuốc chứng là glibencalmide với liều 10 mg/kg thể trọng. Trong đó, liều 400 mg/kg
cho tác dụng hạ đường huyết tối đa là 35,0% [42].
Dịch chiết ether dầu hỏa và ethanol của lá với liều tương đương 18 g dược liệu/
kg chuột nhắt trắng có tác dụng giảm đường huyết rõ rệt (giảm khoảng 40%) [33].
1.2.2.3.8. Tác dụng bảo vệ gan
Phân đoạn hữu cơ của chiết xuất ethanol của các bộ phận trên không của diệp hạ
châu đã được thử nghiệm về hoạt động bảo vệ gan ở chuột chống lại tổn thương gan do
CCl4 gây ra. Hoạt động bảo vệ gan thể hiện rõ qua những thay đổi đáng kể về thời gian
ngủ do pentobarbital gây ra, những thay đổi về nồng độ sGPT, sGOT, sALP và bilirubin
trong huyết thanh và cả những thay đổi về mô bệnh học so với những con chuột bị say
CCl4 [15].

1.2.2.3.9. Tác dụng điều hịa miễn dịch
Trong nghiên cứu sử dụng mơ hình loét dạ dày do ethanol gây ra ở chuột. Dịch
chiết methanol thể hiện hoạt động điều hòa miễn dịch do điều hòa làm giảm đáng kể
mức độ biểu hiện mRNA của TNF- α và IL-8 [23].
1.2.3. Công dụng trong y học cổ truyền và dân gian
Theo y học cổ truyền Việt Nam, lá Phèn đen có tác dụng thanh nhiệt, giải độc,
sát trùng [1]. Trong dân gian thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do
đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt; còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và
rắn cắn [4].
Ở Malaysia, nhân dân dùng lá Phèn đen xát lên ngực để làm giảm hen, dùng nước
sắc lá trị viêm họng. Ở Phylippin, nước sắc lá là thuốc lợi tiểu, hồi phục chức năng, lọc
10


máu, làm mát, chữa đau răng, và lá giã đắp vào bụng chữa giun kim. Ở các nước Lào,
Campuchia, lá Phèn đen được dùng chữa đậu mùa và giang mai [4].
Ở Ấn Độ, lá khô được dùng làm thuốc sắc chữa bệnh đậu mùa, ngồi ra có tác
dụng làm mát, lợi tiểu [27]. Người ta dùng dịch lá làm viên với long não và màng tang...
để trị lợi răng bị thương. Nước ép từ lá cũng được dùng trị ỉa chảy cho trẻ em. Ở Nepal,
nhân dân dùng dịch ép của cây bôi trị nhọt [4].
Ở Đông Phi, dịch lá được sử dụng như chất lợi tiểu, chất làm se bên ngoài vết
loét, vết bỏng, mụn nước và chữa hoa liễu ở người trưởng thành [20]. Ở Nam Phi, lá
Phèn đen khô tán bột rắc lên vết thương giúp mau lành [4]. Ở Tây Phi, nước sắc phần
trên mặt đất cây Phèn đen trị ngứa da. Ở Tanzania, nước lá Phèn đen tươi hoặc khô được
uống để diệt giun, sán [13], [29], điều trị hen suyễn, sốt rét [13].
1.3. Tổng quan về cao khô
1.3.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy
định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung mơi thích
hợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy

khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa
men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách
dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác [5].
Cao khơ là khối bột hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khơ khơng
được có độ ẩm lớn hơn 5% [5].
1.3.2. Phương pháp điều chế cao khô
Giai đoạn 1: Chiết xuất
Chiết xuất dược liệu bằng các dung mơi thích hợp. Tùy theo bản chất của dược
liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mơ sản
xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất: Ngâm, hãm, sắc, ngấm
kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương
pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [5].
Giai đoạn 2: Cô đặc, sấy
Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất cịn lại khơng q
20 % được cao đặc, tiếp tục sấy khơ để độ ẩm cịn lại khơng q 5% thu được cao khô.
Để đạt đến thể chất quy định, q trình cơ đặc và sấy khơ dịch chiết thường được tiến
hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60oC. Nếu không có
các thiết bị cơ đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cơ cách thủy (khơng được cơ
trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80oC. Trường hợp muốn thu được cao

11


thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng các phương pháp thích hợp
tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [5].
1.3.3. Yêu cầu chất lượng với cao khô
 Mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong
chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng [5].
 Mất khối lượng do làm khô (nếu khơng có chỉ dẫn khác): khơng q 5% [5].
 Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu không có chỉ dẫn khác. Cách

tiến hành: Lấy 1,0 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8
– DĐVN V. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị
mẫu đối chiếu [5].
 Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn
hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong
Phụ lục 10.14 Xác định dung mơi tồn dư – DĐVN V [5].
 Dư lượng hóa chất bào vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục
12.17 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN V [5].
 Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới
hạn nhiễm khuẩn – DĐVN V [5].
1.4. Các phương pháp định lượng acid gallic
1.4.1. Phương pháp sắc ký khí
Dung dịch thử được bay hơi đến khơ, sau đó được thêm dichoromethane làm bay
hơi đến khô để loại bỏ nước cịn lại. Cặn khơ được đặt vào lị vi sóng, chiếu xạ ở cơng
suất cao. Sau đó pyridin và BSA được thêm vào để tạo dẫn xuất trimethysilyl của acid
gallic. Dẫn xuất này được phân tích bằng máy sắc ký khí [14].
1.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Bột dược liệu được đun hồi lưu với methanol, gộp dịch chiết, cơ đặc. Pha lỗng
với thể tích thích hợp thu được dung dịch thử. Triển khai trên bản mỏng silicagel với hệ
dung môi Toluen – ethyl acetat – acid formic – methanol (3: 3: 0,8: 0,2), sau đó hiện
màu bằng dung dịch FeCl3 5%. Bản mỏng sau khi hiện màu được đưa lên hệ thống máy
scanner TLC để phân tích [9].
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Bột dược liệu được thêm dung dịch HCl 4 M, thủy phân. Lọc và pha lỗng đến
thể tích thích hợp với dung dịch methanol 50% thu được dung dịch thử. Dung dịch này
được đưa vào phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện
sắc ký [5]:
- Cột thích thước (25 cm × 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh C (5 µm).
- Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 273 nm.
12

-

Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút – 2,0 ml/phút

-

Thể tích tiêm: 10 µl

-

Pha động: Methanol – dung dịch acid phosphoric 0,1% (15:85), điều chỉnh nếu
cần thiết.
Nhận xét: Trong 3 phương pháp trên, phương pháp sắc ký khí có q trình chuẩn

bị mẫu phức tạp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có độ nhạy và
độ phân giải khơng cao bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương
pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Lá Phèn đen được thu hái tại đường Cổ Linh, phường Long Biên, Quận Long
Biên, thành phố Hà Nội vào tháng 11/2021. Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là
Phyllanthus reticulatus Poir., Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Người giám định: ThS.
Nghiêm Đức Trọng. Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã tiêu Bản:

HNIP/18654/22 (Phụ lục 3).
Xử lý mẫu: Lá được rửa sạch, phơi khơ, bảo quản trong túi nilon kín nơi khơ ráo.
2.1.2. Thiết bị, máy móc
- Máy HPTLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5 và hệ thống
CAMAG REPROSTAR3 kết nối với máy tính.
-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản).
Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc
syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml
Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản).

-

Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg.

-

Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ).

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Máy cô quay chân khơng IKA® RV 8 (IKA, Đức).

-

Nồi cách thủy.

-

Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc).

-

Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ.

-

Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet...và các dụng cụ
thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích.

2.1.3. Thuốc, hóa chất, chất chuẩn
- Chất chuẩn: Chất chuẩn acid gallic có độ tinh khiết 98,5%: nguồn gốc từ công ty
TNHH khoa học và kỹ thuật VIETPHYTO.
-

Các dung môi: Methanol, acid hydrochloric đạt tiêu chuẩn phân tích. Các dung
mơi dùng cho HPLC, TLC được mua của hãng Merck.

-

Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck.

2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn
phần trong lá Phèn đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

14


Nội dung 2: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao khơ lá
Phèn đen giàu acid gallic tồn phần.
Nội dung 3: Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao khơ lá Phèn đen giàu acid gallic
tồn phần.
Nội dung 4: Điều chế cao khơ lá Phèn đen giàu acid gallic tồn phần theo các
thơng số quy trình chiết xuất đã được tối ưu hóa.
Nội dung 5: Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao khơ lá Phèn đen giàu
acid gallic tồn phần điều chế được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn đen
Xác định hàm lượng acid gallic toàn phần trong lá Phèn đen bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) tham khảo quy trình định lượng acid gallic toàn phần trong dược
liệu Ngũ Bội tử trong Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Việt Nam V [5].
2.3.1.1. Xử lý mẫu
Cân chính xác 0,5 g dược liệu phân tán vào bình nón nút mài khơ, thêm chính
xác 25 ml dung dịch HCl 4M, đun cách thủy trong 3,5 giờ để thủy phân. Làm nguội, cân
lại và thêm dung dịch HCl 4M đến khối lượng ban đầu. Lắc đều, lọc. Lấy chính xác 2,0
ml dịch lọc cho vào bình định mức 25 ml, thêm dung mơi methanol 50% vào đến vạch.
Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
2.3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký.
-

Cột sắc ký: Cột C18 Inersustain GL Sciences (250  4,6 mm; 5 m).

-

Chọn pha động: Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu
giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký. Qua nghiên tham khảo một
số tài liệu, hệ dung môi MeOH : acid phosphoric 0,1% (10 : 90) được lựa chọn
để khảo sát.

-

Chọn tốc độ dòng: tiến hành khảo sát trong khoảng 0,8 – 1,5 ml/phút để xác
định tốc dộ dòng phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu.

-

Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-Vis của acid gallic để xác định cực

-

đại hấp thụ.
Chọn thể tích tiêm: 20 µl.

2.3.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng.
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [21] về sự
phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và
độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên.
15


 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định
bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý.
Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch

thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết.
Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp
ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD ≤ 2,7% [21].
 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có
mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính đặc hiệu thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng không
xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chất cần
phân tích trong mẫu đối chiếu và mẫu thử. Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic của chất cần
phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.
Tiến hành: tiêm lần lượt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ
thống sắc ký, so sánh các sắc ký đồ thu được.
Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu
trắng, mẫu nền. [21].
 Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại
lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Kết quả
được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r.
Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi
là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 1 µg/ml đến 1000 µg/ml.
Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần
trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
bằng phương trình hồi quy tuyến tính.
u cầu: R2 > 0,99 (r > 0,995) [21].
 Kiểm tra độ chính xác của phương pháp phân tích
Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết
quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một
mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các
lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến cơng

đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.

16


Tiến hành: tiến hành phân tích trong 3 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử
riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. Độ lặp lại được
biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích của các mẫu trong
cùng 1 ngày và liên ngày.
Yêu cầu: RSD ≤ 2,7% [21].
 Kiểm tra độ đúng của phương pháp phân tích
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị
thực.
Cách xác định: pha mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử, thêm vào mẫu thử
những lượng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm
trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất
trong mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ
lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm
được so với lượng chất đối chiếu thêm vào.
Yêu cầu: độ tìm lại 97,0 – 103,0% [21].
2.3.2. Quy trình chiết xuất và định lượng acid gallic toàn phần chiết được trong dược
liệu lá Phèn đen
2.3.2.1. Quy trình chiết xuất
Lá Phèn đen được xay nhỏ đến bột thơ. Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu
cho vào bình nón nút mài. Thêm khoảng 10 ml dung mơi, dùng đũa thủy tinh trộn đều
cho dược liệu thấm đều dung môi trong thời gian 5 phút. Tiếp tục bổ sung vừa đủ 50 ml
dung môi, đậy nắp và chiết siêu âm trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định bằng
phương pháp chiết nóng. Lọc lấy dịch chiết.
2.3.2.2. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần chiết được trong dược liệu lá
Phèn đen

Xác định hàm lượng acid gallic toàn phần chiết được trong dược liệu lá Phèn đen
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
 Chuẩn bị mẫu thử:
Hút chính xác 10 ml dịch chiết lá Phèn đen thu được, cơ đến cắn. Thêm chính
xác 25 ml HCl 4M, đun cách thủy trong 3,5 giờ để thủy phân. Làm nguội, cân lại và
thêm dung dịch HCl 4M đến khối lượng ban đầu. Lắc đều, lọc. Lấy chính xác 2,0 ml
dịch lọc cho vào bình định mức 25 ml, thêm dung môi methanol 50% vào đến vạch. Lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử.
 Điều kiện sắc ký: như phương pháp đã được thẩm định ở mục 3.1.

17