Khảo sát đặc tính có lợi của Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ

The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CĨ LỢI CỦA BACILLUS ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ AO NI TƠM NƯỚC LỢ TẠI CẦN GIỜ
Lê Thị Phụng1,*, Trần Thị Mai Phƣơng2, Đinh Thị Thùy Trâm1, Nguyễn Văn Chí2
Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường,
236B Lê Văn Sỹ, phường 1, quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh
1

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP. HCM,
227 Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh
2

*

Email:
TĨM TẮT

Bacillus là nhóm vi khuẩn có lợi hiện diện trong đa số các chế phẩm sinh học được sử dụng
trong nuôi trồng thủy hải sản, đặc biệt là nuôi tôm. Khả năng cạnh tranh của Bacillus subtilis đối
với vi khuẩn gây bệnh trước tiên là ở số lượng tế bào vi khuẩn. Ngồi ra, Bacillus subtilis cịn có
khả năng tiết ra các chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế, cạnh tranh sự phát triển và tiêu
diệt một số loài vi khuẩn gây bệnh. Ở nước ta các chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy hải
sản đều phải nhập ngoại, giá thành cao. Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus phân lập từ các
ao nuôi tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ được khảo sát đặc điểm sinh trưởng của các chủng mang các
đặc tính có lợi làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học.
Từ khóa: Bacillus, chế phẩm sinh học, Vibrio parahaemolyticus, ao nuôi tôm, huyện Cần Giờ.
1. MỞ ĐẦU
Hiện nay, chất kháng sinh được sử dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực, chủ yếu được dùng
trong ngăn ngừa và điều trị các hình thức viêm nhiễm do vi khuẩn gây ra trên nhiều đối tượng khác
nhau bao gồm cả con người và trong nuôi trồng thủy sản. Số lượng các loại kháng sinh mới ngày

càng ít đi và đã bắt đầu thời điểm mà các kháng sinh hiện tại không đủ để điều trị những bệnh
nhiễm khuẩn trên các lồi thủy sản. Thêm vào đó là hội chứng hoại tử gan tụy cấp trên tôm do
Vibrio parahaemolyticus gây ra đang gây thiệt hại nặng nề cho ngành thủy sản hiện nay và chưa có
thuốc phịng trị đặc hiệu, nên cần có biện pháp phịng chống thích hợp.
Do đó, đòi hỏi các nhà khoa học phải liên tục nghiên cứu tìm ra các hướng đi mới hiệu quả
hơn và một tiềm năng mới đầy hứa hẹn là sản xuất ra chế phẩm sinh học có tác dụng thay thế chất
kháng sinh. Bacillus là nhóm vi khuẩn có mặt chủ yếu trong các chế phẩm sinh học vì có những đặc
tính có lợi như: tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học: vitamin, acid amin, kháng sinh, enzym
protease, α-amylase và một số enzyme có lợi khác. Nó cịn có khả năng làm ổn định pH, trung hòa
độc tố, cung cấp một số men cần thiết để giúp cho quá trình hấp thu dưỡng chất tốt hơn: Enzyme
amylase: thủy phân tinh bột và các sản phẩm chứa tinh bột thành đường glucose; Enzyme protease:
xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối
cùng là các amino acid; Lipase: xúc tác quá trình thủy phân liên kết ester của chất béo tạo thành
glycerol và acid béo [1].
Ngồi ra, Bacillus subtilis cịn có khả năng tiết ra các chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế,
cạnh tranh sự phát triển và tiêu diệt một số loài vi khuẩn gây bệnh như vi khuẩn Vibrio harveyi [2].

86


Hội nghị Khoa học Công nghệ lần thứ 4 - SEMREGG 2018
Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi của chủng Bacillus phân lập từ các ao nuôi
tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho tôm.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tơi thực hiện khảo sát đặc tính có lợi sinh ra bởi
10 chủng Bacillus sp. được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ của phịng thí nghiệm Bộ
mơn Sinh Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM.
Chủng vi sinh vật gây bệnh: Chủng Vibrio parahaemolyticus Vp2 gây hoại tử bệnh gan tụy

cấp trên tôm được cung cấp bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II.
2.1.2. Thiết bị
Cân điện tử, Nồi hấp khử trùng Autoclave, Máy đo pH, Microplate reader, Tủ cấy vô trùng,
Máy lắc ổn nhiệt, Tủ ủ vi sinh, Máy quang phổ kế, Máy ly tâm lạnh Z216MK, Tủ lạnh.
2.1.3. Vật liệu
Môi trường nuôi cấy Luria Bertani (LB): Trypton 10g, Yeast Extract 5 g, NaCl 10 g, Nước cất
vừa đủ 1 lít.
Mơi trường TSA (Tryptone Soy Agar): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy 1 g, Agar 26 g, Nước cất
vừa đủ 1 lít, pH 7,3
Mơi trường TSB 3 % NaCl (Tryptone Soy Broth): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy 1 g, NaCl
25 g, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3
Môi trường Landy: Glucose 20g, Cao nấm men 1g, L- sodium glutamate 5 g, MgSO4 0,5 g, KCl
0,5 g, KH2PO4 1 g, FeSO4 0,15 mg, MnSO4 0,5 mg, CuSO4 0,16 mg, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,0-7,6.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc tính có lợi
2.2.1. Khả năng sinh 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn
Nhằm tối ưu q trình thu nhận 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn, chúng tôi
tiến hành nuôi khảo sát chủng Bacillus subtilis trong mơi trường Landy có điều kiện pH, nhiệt độ,
tốc độ lắc, độ mặn môi trường ban đầu thay đổi để xác định được điều kiện thích hợp nhất cho ni
cấy. Chúng tôi tiến hành khảo sát bốn môi trường nuôi TSB, Landy, M9, Opt để thu được dịch
ngoại bào có khả năng kháng V. parahaemolyticus cao nhất. Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng
B. subtilis trong môi trường LB trong 12 giờ, sau đó bơm 1 % dịch ni sang các môi trường cần
khảo sát: TSB, Landy, M9, Opt. Dịch ni ở 37 oC, lắc 200 vịng/phút và trong 24 giờ. Sau 24 giờ
nuôi, thu dịch ly tâm ở 12000 vịng/phút, 5 oC, trong 10 phút [3].
Tiếp theo, chúng tơi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên V.
parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng khuẩn
theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp.
2.2.2. Khảo sát pH của môi trường nuôi cấy
Nhằm xác định khoảng pH tối ưu của mơi trường ni cấy lên hoạt tính kháng khuẩn của
Bacillus, chúng tôi tiến hành khảo sát pH của môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu thực hiện tăng sinh
chủng B. subtilis trong môi trường LB. Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với các pH như

sau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, các thành phần môi trường như nhau. Đem hấp khử trùng ở 121 ºC, 1 atm. Sau
87


The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018
đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là 1 % và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ lắc 200
vịng/phút. Thu canh trường ni cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC, 10 phút
thu dịch để loại tế bào [4].
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên
V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng
khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp.
2.2.3. Khảo sát nhiệt độ ni cấy
Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus, chúng tơi tiến hành
khảo sát nhiệt độ nuôi cấy. Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng B. subtilis trong môi trường LB.
Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy để nuôi cấy. Đem hấp khử trùng ở 121 ºC, 1 atm. Điều
chỉnh các nhiệt độ lần lượt như sau: 28 oC, 30 oC, 37 oC. Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là
1 % và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Thu canh trường nuôi cấy sau
18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4].
Tiếp theo, chúng tơi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên
V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng
khuẩn theo phương pháp pha lỗng hai lần liên tiếp.
2.2.4. Khảo sát độ mặn môi trường nuôi
Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus, chúng tôi tiến hành
khảo sát độ mặn môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu thực hiện tăng sinh chủng B. subtilis trong môi
trường LB. Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với các độ mặn như sau: 0,5 % NaCl, 1 %
NaCl, 1,5 % NaCl, 2 % NaCl, các thành phần môi trường như nhau. Đem hấp khử trùng ở 121 ºC,
1 atm. Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống là 1% và nuôi trong điều kiện lắc ở 37 ºC với tốc độ
lắc 200 vòng/phút. Thu canh trường nuôi cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm ở 12000 vòng/phút, 5 oC,
10 phút thu dịch để loại tế bào [4].
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của mẫu dịch thu được trên

V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt tính kháng
khuẩn theo phương pháp pha lỗng hai lần liên tiếp.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả của sinh 2,5 - Diketopiperazines

Bacillus sp.

V.parahaemolyticus

V.parahaemolyticus

Bacillus sp. Bac 4

88

Bacillus sp.

Bacillus sp. Bac 6


Hội nghị Khoa học Công nghệ lần thứ 4 - SEMREGG 2018

Bacillus sp.

V.parahaemolyticus

V.parahaemolyticus

Bacillus sp.

Bacillus sp. Bac 7

Bacillus sp. Bac 10
Bacillus sp.

Bacillus sp. Bac 2

V.parahaemolyticus

V.parahaemolyticus

Bacillus sp.

Bacillus sp. Bac 3

Hình 1. Khả năng đối kháng giữa các chủng Bacillus đối với Vibrio parahaemolyticus.
Hình 1 cho thấy khả năng sinh 2,5 - Diketopiperazines đối kháng giữa các chủng Bacillus đối
với Vibrio parahaemolyticus, trong đó, Bacillus sp. Bac 6 có khả năng ức chế sự phát triển của
Vibrio parahaemolyticus lớn hơn so với Bacillus sp. Bac 4, Bacillus sp. Bac 7 và Bacillus sp. Bac
10. Bacillus sp. Bac 2 và 3 khơng có khả năng ức chế sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus.
Đây là đặc tính hết sức quan trọng và có ý nghĩa của Bacillus phân lập từ tự nhiên và ứng dụng
trong việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh và cải thiện môi trường nuôi tôm.
3.2. Khả năng chịu pH
Sau khi thu nhận chế phẩm 2,5-DKP từ môi trường Landy với 6 độ pH khác nhau là 4, 5, 6, 7,
8, 9 sau 18 giờ nuôi cấy, chúng tôi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm này đối với vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và xác định hoạt
tính kháng khuẩn (AU/ml) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp. Kết quả thu được:
Kết quả từ hình 2 hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của Bacillus subtilis 6 tại các pH: 5, 6,
7 là 400 AU/ml, còn tại pH 8 và pH 9 là 100 AU/ml, tại pH4 thì Bacillus subtilis 6 khơng thể phát
triển. Nên ta có thể kết luận rằng tại khoảng pH 5, 6, 7 là tốt nhất cho Bacillus subtilis 6 phát triển

và sinh 2,5-DKP có hoạt tính cao. So sánh với khoảng pH trong điều kiện ao nuôi tôm nước lợ ở
nước ta là 7,5 - 8,2, điều này cho thấy chủng Bacillus subtilis 6 có khả năng chịu khoảng pH rộng
phù hợp với điều kiện ao ni tơm nước ta, thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học.
89


The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018

Hình 2. Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các pH khác nhau.
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ
Tiến hành khảo sát tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau: 28 oC, 30 oC và 37 oC. Thử nghiệm
khả năng kháng khuẩn trên chủng Vibrio parahaemolyticus. Kết quả thu được:

Hình 3. Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các nhiệt độ khác nhau.
Từ những kết quả trên, hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus của Bacillus subtilis Bac 6 tại
37 oC là 400 AU/ml, còn tại 28 oC và 30 oC là 200 AU/ml. Kết quả này tương đồng với kết quả của
một nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn bằng giếng thạch [5] cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất cho
q trình ni cấy Bacillus subtilis sinh 2,5-DKP kháng Vibrio parahaemolyticus là 37 oC. Nên ta

90


Hội nghị Khoa học Công nghệ lần thứ 4 - SEMREGG 2018
có thể kết luận rằng tại 37 oC là nhiệt độ thích hợp nhất cho Bacillus subtilis Bac 6 phát triển và sinh
2,5-DKP có hoạt tính cao.
3.4. Khả năng chịu mặn của Bacillus
Tiến hành khảo sát tại các nồng độ muối trong các môi trường nuôi cấy khác nhau: 0.5 %, 1 %,
1.5 %, 2 %. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên chủng V. parahaemolyticus, kết quả thu được:

Hình 4. Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của Bacillus subtilis tại các độ mặn khác nhau.

Hình 4 cho thấy Bacillus subtilis 6 đều có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus trong khoảng
nồng độ muối từ 0,5-2,0 %, tại 0,5 % NaCl cho hoạt tính kháng V. parahaemolyticus là cao nhất.
Như vậy từ những kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng chủng vi sinh vật này tạo chế
phẩm sinh học có thể ứng dụng phịng chống bệnh hiệu quả trên tôm tùy theo nồng độ muối môi
trường nuôi.
4. KẾT LUẬN
Từ các chủng Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm tại huyện Cần Giờ, nghiên cứu đã chọn
được 04 chủng có khả năng kháng với V. parahaemolyticus, trong đó chủng Bacillus Bac 6 có khả
năng sinh 2,5-DKP kháng V. parahaemolyticus cao nhất. Đồng thời, 2,5-DKP có đặc điểm sinh
trưởng phù hợp với điều kiện nuôi tôm ở nước ta như khoảng chịu pH (5-7), chịu mặn tương đối
(0-2 %), nhiệt độ thích hợp cho q trình ni cấy và sinh 2,5-DKP là 37 oC. Việc nghiên cứu được
các đặc tính có lợi của Bacillus tuy chỉ là bước đầu trong phịng thí nghiệm nhưng có giá trị mang
tính ứng dụng cho việc nghiên cứu điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ trong nuôi tôm ở
nước ta.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Altan, A. - Isolation and Molecular Characterization of Extracellular Lipase and Pectinase
Producing Bacteria from Olive Oil Mills, İzmir Institute of Technology, 2004.
2. Nguyễn Thị Ngọc Huyền - Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio, Luận văn tốt
nghiệp, Ngành Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 2012.

91


The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018
3. Phạm Văn Ty - Công nghệ sinh học - công nghệ vi sinh và môi trường, 2006, Nxb. Giáo dục,
TP. HCM.
4. Arici, M., Bilgin, B., Sagdic, O. and Ozdemir, C. - Some characteristics of Lactobacillus
isolates from infant faeces, Food Microbiology (2004) 19-24.
5. S. Remya Reghunath và ctv, Isolation and Identification of Bioactive Molecules Produced by
Entomopathogenic bacteria, Acinetobacter calcoaceticus, 2017.

INVESTIGATION OF BENEFICIAL PROPERTIES OF BACILLUS ISOLATED
FROM BRACKISH WATER SHRIMP PONDS IN CAN GIO
Le Thi Phung1,*, Tran Thi Mai Phuong2, Dinh Thi Thuy Tram1, Nguyen Van Chi2
1

Ho Chi Minh University for Natural Resouces and Environment,
236B Lê Văn Sĩ Str., Dist Tân Bình, HCMC
2

University of Science, Vietnam National University HCMC,
227 Nguyen Van Cu Str., Dist 5, HCMC
*

Email:
ABSTRACT

Bacillus is a group of beneficial bacteria that presents in the majority of biological products for
aquaculture, especially for shrimp.Competitiveness of Bacillus subtilis towards the harmful bacteria
firstly is the number of bacterial cells. Beside, Bacillus subtilis is capable of secreting biological
antibiotics that inhibit the growth and destruction of some pathogenic bacteria. In our country,
microbial products used in aquaculture must be imported with a very high price. In this research, the
strains of Bacillus isolated from brackish shrimp ponds of Can Gio district were examined for the
growth characteristics of the strains with beneficial properties as the basic for the production of
biological products.
Keywords: Bacillus, probiotic, Vibrio parahaemolyticus, shrimp ponds, Can Gio district.

92