NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE TRONG PHÂN ĐOẠN H, K, N CỦA CAO ETHYL ACETATE TỪ THÂN CÂY DUỐI Ô RÔ (Streblus ilicifolius)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỮU QUANG TUYẾN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ENZYME TYROSINASE TRONG PHÂN ĐOẠN H, K, N CỦA CAO
ETHYL ACETATE TỪ THÂN CÂY DUỐI Ô RÔ

(Streblus ilicifolius)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HĨA PHÂN TÍCH

Thành phố Hồ Chí Minh 11/2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỮU QUANG TUYẾN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ENZYME TYROSINASE TRONG PHÂN ĐOẠN H, K, N CỦA CAO
ETHYL ACETATE TỪ THÂN CÂY DUỐI Ô RÔ
(Streblus ilicifolius)

Chun ngành: Hóa Phân tích
Mã số chun ngành: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HĨA PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS NGUYỄN THỊ THANH MAI

Thành phố Hồ Chí Minh 11/2019

i


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại phịng thí nghiệm bộ mơn hóa phân tích
I46, trường đại học Khoa học tự nhiên-Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Trước hết, với tấm lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
PGS. TS. Nguyễn Thị Thanh Mai, ThS. Nguyễn Xuân Hải đã tận tình hướng dẫn và
hỗ trợ tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm Kiểm nghiệm Dược
phẩm, Mỹ phẩm Long An đặc biệt là tập thể cán bộ trung tâm đã tạo điều kiện,
nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ trong bộ mơn Hóa phân tích-Trường
ĐH KHTN, ĐHQG TP.HCM đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập
tại trường. Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong q trình học
tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp, mặc dù đã cố gắng nhưng chắc
chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận được ý kiến
đóng góp, chỉ bảo của q thầy cơ.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng….năm…

Học viên
Lê Hữu Quang Tuyến

i


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực và chưa
từng được công bố trong bất kỳ một cơng trình nào khác.
Tác giả
Lê Hữu Quang Tuyến

ii


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

MỤC LỤC

Lời cảm ơn.................................................................................................................i
Lời cam đoan............................................................................................................ii

Danh mục chữ viết tắt...............................................................................................vi
Danh mục hình vẽ..................................................................................................viii
Danh mục bảng biểu .................................................................................................x
Danh mục sơ đồ.......................................................................................................xii
Lời mở đầu.............................................................................................................xiii
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây duối ô rô..............................................................................1
1.1.1. Phân loại thực vật............................................................................................1
1.1.2. Đặc điểm sinh thái...........................................................................................1
1.1.3. Phân bố............................................................................................................2
1.1.4. Dược lý............................................................................................................2
1.1.5. Thành phần hóa học.........................................................................................2
1.1.6. Hoạt tính sinh học trên cây Duối ơ rơ..............................................................3
1.1.6.1. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase .........................................................3
1.1.6.2. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.......................................................4
1.2. Tổng quan về melanin......................................................................................6
1.2.1. Giới thiệu melanin...........................................................................................6
1.2.2. Phân loại melanin............................................................................................6
1.3. Tổng quan về enzyme tyrosinase.....................................................................9
1.3.1. Khái niệm về enzyme......................................................................................9
1.3.2. Chất ức chế enzyme tyrosinase......................................................................12

iii


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

1.3.2.1. Chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc từ tự nhiên........................12

1.3.2.2. Chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp...........................19
1.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase.................................20
1.4.1. Nguyên tắc.....................................................................................................20
1.4.2. Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase................................................21
1.4.3. Giá trị IC50 và cách tính..................................................................................21
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI..............................................................................................22
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.........................................................................23
2.1.1. Hóa chất.........................................................................................................23
2.1.2. Dụng cụ.........................................................................................................23
2.1.3. Thiết bị........................................................................................................... 23
2.2. Phân lập các hợp chất từ thân và cành duối ơ rơ.........................................24
2.2.1. Ngun liệu, ly trích và điều chế cao thô.......................................................24
2.2.2. Phân lập hợp chất...........................................................................................24
2.2.2.1. Phân lập hợp chất từ phân đoạn H..........................................................25
2.2.2.2. Phân lập hợp chất từ phân đoạn K..........................................................28
2.2.2.3. Phân lập hợp chất từ phân đoạn N..........................................................31
2.2.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase............................................34
2.2.3.1. Chuẩn bị hóa chất...................................................................................34
2.2.3.2. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase..................................34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học.....................................................................36
3.1.1. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất..........................................................36

iv


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

3.1.2. Biện luận cấu trúc của hợp chất 1..................................................................36
3.1.3. Biện luận cấu trúc của hợp chất 2..................................................................40
3.1.4. Biện luận cấu trúc của hợp chất 3..................................................................44
3.1.5. Biện luận cấu trúc của hợp chất 4..................................................................47
3.1.6. Biện luận cấu trúc của hợp chất 5..................................................................51
3.1.7. Biện luận cấu trúc của hợp chất 6..................................................................55
3.1.8. Biện luận cấu trúc của hợp chất 7..................................................................56
3.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase..........................................59
3.2.1. Kết quả thử hoạt tính của cao phân đoạn.......................................................59
3.2.2. Kết quả thử hoạt tính các cao phân đoạn của cao ethyl acetate......................59
3.2.3. Kết quả thử hoạt tính các hợp chất phân lập được.........................................61
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận...........................................................................................................63
4.2. Kiến nghị.........................................................................................................64
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.....................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................66
PHỤ LỤC...............................................................................................................70

v


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

DANH MỤC VIẾT TẮT

Ký hiệu
br.s

COSY
13
C-NMR

Broad singlet
Correlation Spectrocopy
Carbon-13 Nuclear Magnetic

d
dd
dt
DHI
DHICA
DMSO
DEPT

spectrocopy
Doublet
Doublet of doublet
Doublet of triplet
5,6-Dihydroxyindole
5,6-Dihydroxyindole-2-carboxylic acid
Dimethyl sulfoxide
Distortionless Enchancement by Polarisation

HR-ESI-

Transfer
High Resolution Electro Spray Ionization Mass

Phổ khối phân giải cao ion hóa

MS
1
H-NMR

Spectrocopy
Hydrogen-1 Nuclear Magnetic Resonance

bằng phun mù điện tử
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HMBC
HSQC
IC50
J
L-DOPA
NMR
MPLC
NOESY
MeOH
MBC
MIC

Spectrocopy
Heteronuclear Multiple Bond Coherence
Heteronuclear Single Quantum Correlation
The half maximal Inhibitory Concentration
Coupling constant
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine

Nuclear Magnetic Resonance
Medium Preparative Liquid Chromatography
Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy
Methanol
Minimum Bactericida Concentration
Minimum Inhibitory Concentration
Methicillin resistant Staphylococcus aureus

MRSA
m
PTLC
s
δ
t
UV
USA

Tên tiếng Anh
Resonance

Multiplet
Preparative Thin Layer Chromatography
Singlet
Chemical shift
Triplet
Ultraviolet
United State of America

vi

Tên tiếng Việt
Mũi đơn rộng
Phổ tương quan proton-proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
đồng vị 13
Mũi đôi
Mũi đôi đôi
Mũi đôi ba

Phổ DEPT

Phổ tương tác dị nhân đa liên kết
Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết
Nồng độ ức chế 50%
Hằng số ghép spin
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Sắc ký điều chế
Hiệu ứng NOE
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
Nồng độ ức chế tối thiểu
Nhiễm tụ cầu vàng kháng
methicillin
Mũi đa
Sắc ký lớp mỏng điều chế
Mũi đơn
Độ dịch chuyển hóa học
Mũi ba
Tia tử ngoại
Hợp chủng quốc Hoa Kỳ

Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cây Duối ơ rơ....................................................................................................1
Hình 1.2 Hoa và quả cây Duối ơ rơ..................................................................................2
Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ cao ethanol Duối ơ rơ............................3
Hình 1.4 Cấu trúc của enzyme tyrosinase......................................................................10
Hình 1.5 Cấu trúc của acid kojic....................................................................................13
Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo của tropolone.....................................................................19
Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo của resorcinol....................................................................20
Hình 3.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được...............................................................36

vii


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 1....................................................................37
Hình 3.3 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất 1.................................................39
Hình 3.4 Tương quan NOESY của hợp chất 1...............................................................40
Hình 3.5 Cơng thức cấu tạo của streblus F.....................................................................40
Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 2....................................................................41
Hình 3.7 Tương quan HMBC, COSY của hợp chất 2....................................................43
Hình 3.8 Tương quan NOESY của hợp chất 2...............................................................43

Hình 3.9 Cơng thức cấu tạo của streblus G....................................................................44
Hình 3.10 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 3..................................................................44
Hình 3.11 Tương quan COSY, HMBC của hợp chất 3...................................................46
Hình 3.12 Tương quan NOESY của hợp chất 3.............................................................47
Hình 3.13 Cơng thức cấu tạo của streblus H..................................................................47
Hình 3.14 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 4..................................................................48
Hình 3.15 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất 4...............................................50
Hình 3.16 Tương quan NOESY của hợp chất 4.............................................................51
Hình 3.17 Cơng thức cấu tạo của streblus I....................................................................51
Hình 3.18 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 5..................................................................52
Hình 3.19 Tương quan HMBC của hợp chất 5...............................................................53
Hình 3.20 Cơng thức cấu tạo của hợp chất acetyl-aloe-emodin.....................................55
Hình 3.21 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 6..................................................................55
Hình 3.22 Cơng thức cấu tạo của của hợp chất acid (E)-p-coumaric.............................56
Hình 3.23 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 7..................................................................56
Hình 3.24 Tương quan HMBC của hợp chất 7...............................................................58
Hình 3.25 Cơng thức cấu tạo của streblus J...................................................................59
Hình 3.26 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 4..................................................................62

viii


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của các cao Duối ơ rơ ở nồng độ
20µg/mL ........................................................................................................4

Bảng 1.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất
chiết xuất từ Duối ô rô....................................................................................4
Bảng 1.3 Giá trị MIC và MBC của các hợp chất tinh khiết với các vi khuẩn khảo
sát.................................................................................................................... 5
Bảng 1.4 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy
trong lá cây Dâu tằm trắng (Morus alba)........................................................13

ix


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Bảng 1.5 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy
trong thân cây Dâu tằm trắng (Morus alba)....................................................15
Bảng 1.6 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy
trong lá cây Dâu tằm Vân Nam (Morus mogolica).........................................17
Bảng 1.7 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy
trong thân cây Mít (Artocarpus heterophyllous).............................................18
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 1
trong dung môi acetone-d6......................................................................................................................................... 38
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 2
trong dung môi acetone-d6..............................................................................41
Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 3
trong dung môi acetone-d6......................................................................................................................................... 45
Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 4
trong dung môi acetone-d6......................................................................................................................................... 49
Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 5
trong dung môi chloroform-d1............................................................................................................................... 52

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 và acetyl-aloe-emodin trong dung môi
chloroform-d1........................................................................................................................................................................... 54
Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất 6 và acid (Z)-p-coumaric
trong dung môi acetone-d6......................................................................................................................................... 56
Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 7
trong dung môi acetone-d6......................................................................................................................................... 57
Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao phân đoạn........59
Bảng 3.10 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn ethyl
acetate.............................................................................................................60
Bảng 3.11 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 7 hợp chất phân lập
được …...........................................................................................................61

x


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quy trình sinh tổng hợp melanin.................................................................8
Sơ đồ 1.2 Phản ứng xúc tác bởi enzyme tyrosinase...................................................10
Sơ đồ 1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme tyrosinase trong quá trình phản ứng tạo
monophenol và diphenol..........................................................................11
Sơ đồ 1.4 Phản ứng tạo thành dopachrome................................................................20
Sơ đồ 2.1 Quy trình ly trích và điều chế cao thô từ thân cây Duối ô rô.....................24
Sơ đồ 2.2 Quy trình ly trích và điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate.............26

xi

Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Sơ đồ 2.3 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn H...........................................27
Sơ đồ 2.4 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn H1.1.2...................................28
Sơ đồ 2.5 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K...........................................29
Sơ đồ 2.6 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K5.1.1.2.1.............................30
Sơ đồ 2.7 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K5.1.1.2.3.............................31
Sơ đồ 2.8 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N...........................................31
Sơ đồ 2.9 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N7.........................................32
Sơ đồ 2.10 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N4.......................................33
Sơ đồ 2.11 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N2.......................................34
Sơ đồ 2.12 Quy trình thử hoạt tính enzyme tyrosinase..............................................35

Lời mở đầu

Việt Nam thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật phong phú và
đa dạng. Tổng số loài thực vật đã ghi nhận cho Việt Nam là 15.986 loài thực vật,
bao gồm 4.528 loài thực vật bậc thấp, 11.458 loài thực vật bậc cao. Và theo số liệu
mới nhất, năm 2012 Võ Văn Chi đã công bố trong cuốn “Từ điển cây thuốc Việt
Nam” với gần 4.700 loài thực vật làm thuốc. [1] Số lượng cây thuốc mà chúng ta biết
được đã tăng rất đáng kể. Điều đó chứng tỏ nếu được điều tra đầy đủ hệ thực vật
làm thuốc ở Việt Nam có thể lớn hơn rất nhiều. Đây có thể coi là nguồn dược liệu
tiềm năng, cần đầu tư nghiên cứu trong thời gian tới.

xii

Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Việt Nam là một nước nhiệt đới nên có màu da sậm hơn so với màu da trắng
sáng ở các nước ôn đới. Phụ nữ Á châu nói chung và Việt Nam nói riêng chịu ảnh
hưởng của quan điểm rằng màu da trắng sáng là chuẩn mực của cái đẹp nên đều
mong muốn mình có được làn da trắng sáng. Chính vì lí do đó mà các hoạt chất
làm trắng da đang được sự quan tâm của các ngành công nghệ dược phẩm và mỹ
phẩm.
Hiện nay, nhiều sản phẩm làm sáng da, chống nám sử dụng hoạt chất là các
chất ức chế enzyme tyrosinase. Tuy nhiên những chất ức chế enzyme tyrosinase
như hydroquinone và arbutin lại có vấn đề về sự an tồn [2] nên con người có xu
hướng quay trở về với các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên hơn là sử dụng các
loại thuốc tổng hợp hay bán tổng hợp. Xu hướng này đã tác động đến việc sản xuất,
thu hái, chế biến, lưu thông, tiêu thụ và sử dụng các loại dược liệu thảo mộc. Một
số loài dược liệu thảo mộc có khả năng ức chế nhiều loại enzyme. Qua tham khảo
tài liệu nhóm nghiên cứu chúng tơi thấy cây Duối ơ rơ có hoạt tính ức chế enzyme
tyrosinase khá mạnh.[20] Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu cụ thể
về các hoạt tính sinh học, cũng như các nghiên cứu xác định thành phần hóa học có
khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ thân cây Duối ơ rơ.
Để đóng góp vào việc nghiên cứu và bổ sung các hợp chất có hoạt tính ức chế
enzyme tyrosinase từ thân cây Duối ơ rơ, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đề
tài nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase trên
thân cây Duối ô rô.

xiii

Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

xiv


CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

1.1. Tổng quan về cây duối ô rô
1.1.1. Phân loại thực vật [5]
Duối ơ rơ còn có tên gọi khác là Gai qt hay Duối núi, tên khoa học là
Streblus ilicifolius (S. Vidal) Corner. Duối ô rô được báo cáo lần đầu tiên vào
năm 1914 tại Lushai Hills (bang Mizoram ngày nay ở India) với tên
Balanostreblus ilicifolia Kurz. Đến năm 2008, Upadhaya G.K. đã đổi tên thành
Streblus ilicifolius (S. Vidal) Corner.
Giới
Ngành
Lớp
Bộ
Họ
Chi
Loài

Thực vật (Plantae)
Thực vật Hạt kín (Agiosperms)
Thực vật hai lá mầm (Eudicots)
Hoa hồng (Rosales)
Dâu tằm (Moraceae)
Duối (Streblus)
Streblus ilicifolius

1.1.2. Đặc điểm sinh thái [5]
Cây nhỏ mọc thành bụi, có gai, rất nhẵn, với gai to, dài tới 25mm. Lá hình
ngọn giáo hay thn, dài 3-10cm, rộng 2-4,5cm, nhọn ở gốc và nhọn nhiều hay ít ở
đầu, dai, bóng ở trên, có răng dạng gai to, cuống dài 3-5mm (Hình 1.1).

Hình 1.1 Cây Duối ơ rô

Hoa đực thành bông dày đặc, dài 1-4cm, rộng 4mm; hoa cái xếp 1-3 cái ở
nách lá, không cuống. Quả có đường kính 8cm, bao bởi các lá đài đồng trưởng và
nạc với vỏ quả ngoài mỏng và dễ vỡ. Hạt đơn độc, hình cầu, màu vàng vàng, có
khía nâu (Hình 1.2).

1


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Hình 1.2 Hoa và quả cây Duối ô rô

1.1.3. Phân bố [5]

Duối ô rô phân bố ở Myanmar, China, Laos, Cambodia, Thailand, Malaysia,
Indonesia, Philippines. Cây Duối ô rô gặp ở nhiều nơi của nước ta, nhưng phổ biến
ở miền Bắc Việt Nam, thường tạo thành những quần thể nhỏ ở chân các thung lũng
đá vơi, từ Lạng Sơn, Hồ Bình, Hà Nội, Nam Hà, Ninh Bình, Bình Định, Quảng Trị,
Thừa Thiên Huế, Khánh Hồ, Ninh Thuận, Đồng Nai tới Hồ Chí Minh.
1.1.4. Dược lý [5]
Hiện nay, cây Duối ô rô chưa được sử dụng nhiều trong các bài thuốc. Trong
dân gian vỏ cây Duối ô rô được dùng làm thuốc tiêu độc mụn nhọt.
1.1.5. Thành phần hóa học
Năm 2016, Sukanya Dej-adisai cùng cộng sự đã tiến hành phân lập các hợp
chất từ thân Duối ô rô, được thu thập ở tỉnh Rajjaprabha Dam và tỉnh Surat Thani
của Thailand. Thân cây được nghiền nhỏ, ly trích lần lượt với các dung mơi
petroleum ether, ethyl acetate, ethanol và nước. Từ cao ethanol đã phân lập được 5
hợp chất tinh khiết là 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde, trans-resveratrol,
methyl p-hydroxybenzoate, umbelliferone và moracin M (Hình 1.3). [20]

2,4-Dihydroxy-3-geranylbenzaldehyde

trans-Resveratrol

2


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Umbelliferone

Moracin M

Methyl p-hydroxybenzoate

Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ cao ethanol Duối ơ rơ

1.1.6. Hoạt tính sinh học
1.1.6.1. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase trên cây Duối ơ rơ
Năm 2016, Sukanya D. cùng cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế
enzyme tyrosinase của các cao chiết của thân Duối ô rô: cao petroleum ether, cao
ethyl acetate, cao ethanol, cao nước với chất đối chứng dương là acid kojic. Các
mẫu cao này cũng được thử nghiệm cùng với 3 hợp chất tinh khiết 2,4-dihydroxy-3geranylbenzaldehyde, methyl p-hydroxybenzoate và moracin M. Quy trình này sử
dụng chất nền là L-DOPA, enzyme tyrosinase chiết xuất từ nấm Agaricus bisporus
và độ hấp thu quang được đo ở bước sóng 495 nm.[20]
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase với các cao chiết cho thấy khả
năng ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất là cao ethanol với phần trăm ức chế là
75.52 ± 5.42% ở nồng độ 20 µg/mL, gần bằng chất đối chứng dương acid kojic
(80.86 ± 2.62%). (Bảng 1.1).[20]

Bảng 1.1 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của các cao

Duối ô rô ở nồng độ 20 µg/mL
Cao chiết
Petroleum ether
Ethyl acetate
Ethanol
H2O
Acid kojic (*)
(*)

Phần trăm ức chế (%)

2.45 ± 5.90
24.38 ± 1.04
75.52 ± 5.42
3.17 ± 5.24
80.86 ± 2.62

Chất đối chứng dương

3


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Đối với các hợp chất tinh khiết, moracin M cho thấy có hoạt tính ức chế
enzyme tyrosinase mạnh nhất với giá trị IC 50 là 67.69 µg/mL so với chất đối chứng
dương acid kojic (giá trị IC50 là 38.67 µg/mL) (Bảng 1.2).[20]
Bảng 1.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các

hợp chất chiết x́t từ D́i Ơ rơ
Hợp chất
2,4-Dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde
Methyl p-hydroxybenzoate
Moracin M
Acid Kojic (*)
(*)

IC50 (µg/mL)
> 200

> 200
67.69
38.67

Chất đới chứng dương

1.1.6.2 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Năm 2016, Sukanya D. cùng cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm của thân Duối ơ rơ với các dòng vi khuẩn Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Staphylococcus
aureus kháng methicillin (MRSA), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, các
dòng nấm Candida albicans (loại nấm phổ biến gây nhiễm trùng miệng và âm đạo),
Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum và Trichophyton mentagrophytes (các
loại nấm gây bệnh ngồi da).[20]
Thí nghiệm của Sukanya D. đối với các cao chiết được thực hiện bằng phương
pháp khuếch tán trên đĩa thạch nhằm sàng lọc sơ bộ. Các chất đối chứng dương
được sử dụng là oxacilllin cho vi khuẩn gram dương (riêng Staphylococcus aureus
kháng methicillin dùng vancomycin), norfloxacin cho vi khuẩn gram âm,
amphotericin B cho Candida albicans và ketoconazole cho nấm cịn lại.[20]
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, với các mẫu cao chiết, chỉ có cao
ethanol có hoạt tính trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và Staphylococcus
epidermidis, khơng có hoạt tính trên các vi khuẩn và nấm còn lại. Đối với vi khuẩn
Staphylococcus aureus, cao ethanol có đường kính vịng kháng khuẩn quanh miệng
giếng trên đĩa là 8.47 ± 0.31 mm, thấp hơn chất đối chứng dương (18.73 ± 0.73
mm). Đối với vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, cao ethanol có đường kính

4


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

vòng kháng khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa là 9.25 ± 0.56 mm, thấp hơn chất đối
chứng dương (28.01 ± 0.55 mm). Các mẫu cao cịn lại khơng có hoạt tính.
Từ kết quả trên, nhóm Sukanya D. tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
của 3 hợp chất tinh khiết là 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde, methyl phydroxybenzoate

và

moracin M với vi khuẩn

Staphylococcus

aureus,

Staphylococcus aureus kháng methicillin và Staphylococcus epidermidis thông qua
giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ diệt vi khuẩn tối thiểu MBC.[20]
Kết quả cho thấy, hợp chất 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde có hoạt tính
kháng khuẩn mạnh nhất ở cả 3 vi khuẩn. Tuy nhiên, vẫn yếu hơn chất đối chứng
dương. Hai hợp chất cịn lại có hoạt tính rất yếu so với chất đối chứng dương (Bảng
1.3).[20]
Bảng 1.3 Giá trị MIC và MBC của các hợp chất tinh khiết với các

vi khuẩn khảo sát

Hợp chất

Staphylococcus

Staphylococcus

Methicillin-resistant

epidermidis

aureus

Staphylococcus aureus

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

(µg/mL)

(µg/mL)

(µg/mL)

(µg/mL)

(µg/mL)

(µg/mL)

8

32

4

16

8

64

256

> 256

> 256

> 256

> 256

> 256

Moracin M

64

> 256

128

> 256

64

> 256

Oxacillin *

0.5

-

0.25

-

-

-

Vancomycin *

-

-

-

-

0.25

-

2,4-Dihydroxy-3-geranyl
benzaldehyde
Methyl p-hydroxybenzoate

(*) Chất đối chứng dương
(-) Không khảo sát
1.2. Tổng quan về melanin
1.2.1. Giới thiệu về melanin [16]
Melanin là một sắc tố rất phổ biến trong tự nhiên. Nó được tìm thấy trong
hầu hết các sinh vật. Ở động vật, melanin là dẫn xuất acid amin của enzyme
tyrosinase. Melanin giữ vai trò và chức năng quan trọng trong các lồi sinh vật khác
nhau. Melanin có tác dụng bảo vệ các sinh vật, chẳng hạn như các loại vi khuẩn và

5


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

nấm, melanin có chức năng bảo vệ chúng chống lại các tổn thương từ tia cực tím và
các chất oxy hóa. Melanin cịn bảo vệ chúng chống lại những tác động từ bên ngồi
như nhiệt độ cao, hóa chất (chẳng hạn như các kim loại nặng và các chất oxy hóa
trong tự nhiên) và các mối đe dọa sinh hóa (chống lại các vi khuẩn có hại xâm nhập
vào cơ thể). Trong các lồi động vật khơng xương sống, melanin có liên quan tới hệ
thống miễn dịch trong cơ thể của chúng. Vài phút sau khi bị nhiễm bệnh thì các vi
sinh vật được bao bọc trong melanin và chúng hỗ trợ cho các q trình tiêu diệt các
lồi vi khuẩn có hại. Hiện tượng trái cây, nấm bị hóa nâu khi để ngồi khơng khí
cũng là một minh chứng cho sự tạo thành melanin.
Ở con người, melanin là yếu tố quyết định chính tới màu sắc của da. Melanin
cũng được tìm thấy trong tóc, các tế bào cơ bản của mống mắt, mô não. Melanin là
yếu tố quan trọng trong việc bảo vệ da tránh khỏi tổn thương của tia tử ngoại. Mặc
dù, melanin có vai trị quan trọng trong việc bảo vệ làn da khỏi ánh sáng mặt trời
nhưng sự tích lũy khơng bình thường melanin tại một vùng da nào đó trên cơ thể sẽ
làm mất đi vẻ thẩm mỹ của con người.
1.2.2. Phân loại melanin
Sự hình thành sắc tố melanin được tạo thành ở giai đoạn đầu khi oxy hóa
tyrosin thành dopaquinone với sự xúc tác phản ứng của enzyme tyrosinase. Tiếp
theo, dopaquinone sẽ biến đổi thành L-DOPA và dopachrome. Sau đó, L-DOPA trở
thành chất nền của tyrosinase và thực hiện phản ứng oxy hóa dopaquinone để giải
phóng lại enzyme tyrosinase. Tiếp theo, eumelanin (nâu, đen) được hình thành
thơng qua chuỗi phản ứng oxy hóa sản phẩm của phản ứng dopachrome là
dihydroxyindol (DHI) và acid dihydroxyindol-2-carboxylic (DHICA) (Sơ đồ 2.1).
Sự có mặt của cystein hoặc glutathion, dopaquinone sẽ biến đổi thành cysteinyldopa
hoặc glutathionyldopa. Sau đó, dạng thứ 2 của melanin là pheomelanin (màu vàng
ánh đỏ) được hình thành (Sơ đồ 1.1). Khi pha trộn dạng eumelnin và pheomelnin sẽ
tạo ra melanin. Cả hai loại melanin là pheomelanin và eumelanin đều được tìm thấy
trong da và tóc, nhưng eumelanin là dạng melanin có nhiều nhất trong con người.[6]
[7]

6


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Eumelanin là một dạng liên kết chuỗi bao gồm nhiều liên kết 5,6-dihydroxy
và 5,6-dihydroxyindol-2-acid carboxylic. Eumelanin được tìm thấy trong mắt,
quầng vú, da, màu tóc (màu vàng, nâu, xám, đen). Ở người, eumelanin được tìm
thấy nhiều trong những người da đen. Có 2 loại khác nhau của eumelanin là
eumelanin màu đen và eumelanin màu nâu. Sự có mặt của eumelain màu đen cùng
với sự thiếu hụt một số loại sắc tố khác làm cho mái tóc có màu xám. Trong khi đó
thì sự có mặt của eumelanin màu nâu khi thiếu hụt một số loại sắc tố khác làm cho
mái tóc có màu vàng.
Pheomelanin cũng được tìm thấy trong da và tóc ở cả người sáng da và cả
những người có màu da sậm hơn. Pheomelanin là sắc tố có thể tìm thấy nhiều ở
những người có mái tóc màu đỏ. Nó có thể trở thành chất gây ung thư khi tiếp xúc
với các tia cực tím của ánh sáng mặt trời.[8]
Glutathione or Cysteine

TYR

Tyrosine

Dopaquinone

TYR

Cysteinyldopa

L-DOPA

-CO2

DHI

TYR

HBT
A

Leukodopachrome

Dopachrome

TRP-2

Pheomelanin
TRP-1
IQ

ICAQ

DHICA

Eumelanin

Melanin

7


Luận văn thạc sĩ

HV: Lê Hữu Quang Tuyến

Sơ đồ 1.1 Quy trình sinh tổng hợp melanin

Sự hình thành melanin ở biểu bì da giúp chống lại tác động gây hại của tia tử
ngoại mặt trời, tuy nhiên khi tích tụ một lượng lớn sẽ gây ra hiện tượng sạm da,
nám da [6].Qua quá trình trên cho thấy nếu giảm được sự hình thành dopachrome thì
có thể hạn chế sự tạo thành của eumelanin, từ đó giảm sự tạo thành sắc tố melanin
trong cơ thể. Một biện pháp được nhiều nhà khoa học hiện nay quan tâm để điều trị
nám da là ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase.
Có 6 nhóm chất ức chế tổng hợp melanin:[6]
 Nhóm chất khử như acid ascorbic khử dopaquinone thành dopa trì hỗn sự
tạo thành dopachrome và melanin.
 Nhóm chất phản ứng với dopaquinone như glutathione, cysteine, …
 Nhóm cơ chất thay thế tyrosine, vẫn có sự tạo thành quinone nhưng khơng
phải dopaquinone như các hợp chất phenol.
 Nhóm chất bất hoạt enzyme tyrosinase khơng đặc hiệu ví dụ như acid hoặc
base, phá hủy cấu trúc các loại protein trong đó có enzyme tyrosinase.
 Nhóm chất ức chế enzyme tyrosinase đặc hiệu, thuận nghịch. Enzyme
tyrosinase có thể phục hồi sau khi bị ức chế, vẫn có sự tạo thành dopaquinone
nhưng tốc độ phản ứng chậm lại.
 Nhóm chất ức chế enzyme tyrosinase đặc hiệu, khơng thuận nghịch, enzyme
tyrosinase bị biến đổi cấu trúc và bị bất hoạt vĩnh viễn.
1.3. Tổng quan về enzyme tyrosinase
1.3.1 Khái niệm về enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Quá trình
trao đổi chất là tập hợp của rất nhiều phản ứng hóa học khác nhau. Enzyme là các
phân tử protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó nên enzyme cịn được gọi là
chất xúc tác sinh học. Chất ức chế enzyme là chất làm giảm hoạt tính của enzyme
do làm giảm ái lực của enzyme với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp
với cơ chất.[3]

8