Improved rifamycin b production by nocardia mediterranei MTCC 14 under solid state fermentation through process optimization

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HỐ HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài 2: Cải tiến sản xuất kháng sinh Rifamycin B
nhờ Nocardia mediterranei MTCC 14 trong quá trình lên
men ở trạng thái rắn thơng qua tối ưu hóa quy trình.

(Improved Rifamycin B Production by Nocardia mediterranei MTCC 14 under Solid-State
Fermentation through Process Optimization)

8/27/22

1


NỘI DUNG

VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP

TỔNG KẾT
8/27/22

1

GIỚI THIỆU

3

KẾT QUẢ VÀ
BÀN LUẬN

2

4
2


Phần 1: GIỚI THIỆU

Rifamycin B
Được phân tách lần đầu tiên tại Italia
năm 1959 bởi nhà khoa học Sensi và
các đồng nghiệp.
Được phân tách trong dịch lên men
của Amycolatopsis mediterranei trong
điều kiện lên men đặc biệt, có sự có
mặt acid diethylbarbituric.
Rifamycin B có cấu trúc hố học
được xác định năm 1964.

8/27/22

3


Phần 1: GIỚI THIỆU

Chức năng kháng sinh

Được sản xuất bởi chủng Nocardia mediterranei 
Kháng khuẩn mạnh, ít độc, dễ phân huỷ sinh học
Ansamycin

Ức chế tổng hợp RNA bằng liên kết với RNA polymerase.
Phương thức chính trong điều trị bệnh lao, bệnh phong,
AIDS, nhiễm trùng.

8/27/22

4


Phần 1: GIỚI THIỆU

Sản xuất Rifamycin B

Lên men chìm (SmF)
Lên men rắn (SSF)

8/27/22

Ưu điểm

• Mơi trường lên men gần giống với mơi trường
tự nhiên
• Tận dụng phế phẩm nơng nghiệp để làm chất
nền cung cấp Carbon và năng lượng

Nhược điểm

• Khó kiểm sốt về điều kiện về độ ẩm, nhiệt độ.

5


Phần 1: GIỚI THIỆU

Bánh dầu hoa hướng dương

Số lượng lớn do hạt hướng dương là nguồn
cung cấp dầu ăn lớn thứ hai thế giới.
Nguồn nguyên liệu đa dạng, giá thành rẻ
Giàu Nito, Carbon, khoáng chất.

8/27/22

6


Phần 1: GIỚI THIỆU

Phương pháp tm bề mặt đáp ứng và thiết kế Placket-Burman (RSM) 
Phương pháp
bề mặt đáp ứng

• Tìm giá trị của các yếu tố
Xi để Y đạt giá trị tốt
nhất

Thiết kế PlacketBurman

• Cho phép chọn yếu tố có
ảnh hưởng lên hàm Y

Hiệu quả cao
Ít tốn thời gian
Đơn giản
8/27/22

Được sử dụng rộng
rãi trong tối ưu hố
q trình lên men

7


Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu
- Nocardia mediterranei MTCC14 thu được từ Ngân hàng Gen, Chandigarh, India.
- Nguyên liệu thơ: dầu hướng dương(sấy khơ, xay nhỏ với kích thước hạt 200 –
500 µm) từ Raja Fat và Feeds Private Limited, Rapura, Punjab, India.


Ni cấy vi sinh vật
MƠI TRƯỜNG RẮN PH = 8.0, DUY TRÌ Ở 48 0 C
Thành phần

Lượng (g/L)

Dextrose

20

Glycerol

20

Cao nấm men

5

Casein hydrolysate

3

Peptone

2.5

Mạch nha

1

Agar

20

Thu bào tử sao cho đạt 2.106 bào tử/mL, giữ trong nước

cất chứa 0,01% Tween 80


Lên men tạo Rifamycin B

Barnital : 1, 2, 3, 4, 5 (%)
Bánh dầu
hướng dương

pH: 7; 7.5; 8; 8.5; 9

Môi trường
Nguồn C (5%):
glucose, maltose,
galactose, ribose và
xylose

Độ ẩm: 40, 45, 50, 55, 60 (%)
Nguồn N (7%): cao thịt bò, bột
đậu phộng, bột đậu nành
(NH4) 2SO4, NH4Cl.


Lên men tạo Rifamycin B

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN
Thành phần

Lượng (g/L)

CaCO3

75

KNO3

100

MgSO4

1

Nước cất

Lượng xác định

1210C, 15 phút

Hấp khử trùng
p = 1kgf/cm2

Ủ
28±0.50C


Chiết và ước lượng Rifamycin B
Khuấy (1h,
200rpm)

Lọc

(vải mỏng)

Ly tâm
(2070 vòng
– 10 phút)

Rifamycin B
+ 5 mL đệm
acetate (pH =
4.63)

0.1
mL

0.1%
NaNO2

Đo ở bước
sóng 425 nm


Tối ưu hóa mơi trường lên men
Thiết kế thí nghiệm: phương pháp bề mặt đáp ứng
+ Thiết kế Plackett-Burman
+ Thiết kế cấu trúc có tâm (central composite design - CCD)

8/27/22

13

Tối ưu hóa mơi trường lên men
 
Thiết
kế Plackett-Burman

- Xác định các thơng số quy trình quan trọng để sản xuất rifamycin B từ Nocardia
mediterranei MTCC 14.
- Thử nghiệm thiết kế này giả định rằng khơng có tương tác giữa các thơng số
sản xuất khác nhau và dựa trên mơ hình bậc nhất:
Y=

(1)

Trong đó Y là hàm trực tiếp ước tính, β0 là hằng số tỷ lệ, βi là hệ số hồi quy và
xi là các biến.
8/27/22

14


Tối ưu hóa mơi trường lên men
Thiết kế Plackett-Burman

8/27/22

15


Tối ưu hóa mơi trường lên men

Thiết kế Plackett-Burman

8/27/22

16


Tối ưu hóa mơi trường lên men
Thiết kế Plackett-Burman

8/27/22

17


Tối ưu hóa mơi trường lên men
Thiết kế cấu trúc có tâm – CCD ( hay thiết kế Box-Wilson (BW))

- Xác định mức độ tối ưu của bốn thông số sản xuất quan trọng được
sàng lọc từ thử nghiệm thiết kế Plackett-Burman.
- Ảnh hưởng của bốn thông số đến việc sản xuất rifamycin B được
tính tốn ở năm mức thử nghiệm , -α, −1, 0 , +1 và +α, với α=2 n/4 ; ở
đây n là số lượng các biến và 0 tương ứng với điểm trung tâm.

8/27/22

18


Tối ưu hóa mơi trường lên men

Thiết kế cấu trúc có tâm – CCD ( hay thiết kế Box-Wilson (BW))

Mức mã hóa (coded level) được tính như sau:

Sản lượng Rifamycin B được phân tích bằng cách sử dụng
phương trình đa thức bậc hai. Phương trình mơ hình để
phân tích:

8/27/22

19


Tối ưu hóa mơi trường lên men
Phân tích dữ liệu
+ Chất lượng của sự phù hợp của phương trình
mơ hình đa thức được thể hiện qua hệ số xác
định R2.
+ Ý nghĩa thống kê của nó đã được kiểm chứng
bởi F-test. Mức ý nghĩa được đưa ra khi giá trị
Prob>F nhỏ hơn 0,1.

8/27/22

20


Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
 3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

SÀNG LỌC CÁC NGUỒN CACBON VÀ NITO, BARBITAL, ĐỘ
ẨM, pH ĐỂ SẢN XUẤT RIFAMYCIN B.
CÁC CHẤT DINH DƯỠNG BỔ SUNG VÀ CÁC THÔNG SỐ VẬT
LÝ THỰC SỰ TĂNG NỒNG ĐỘ RIFAMYCIN B CỦA MTCC14

8/27/22

21


Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
 3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

Nguồn cacbon, nito trong môi trường cơ bản ở mức 5% (w/w)
và 7% (w/w)
Barbital 1%, 2%, 3%, 4% và 5%
pH=7.0, 7.5, 8.0, 8.5 và 9.0
Độ ẩm 40%, 45%, 50%, 55% và 60%.

8/27/22

22


Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
 3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

Bảng 1: Mức độ của các thông số sản xuất để sản xuất Rifamycin B từ Nocardia mediterranei MTCC14
bằng cách sử dụng thử nghiệm thiết kế Plackett-Burman.

8/27/22

23


Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
 3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

Bảng 2: Sản lượng Rifamycin B từ Norcadia mediterranei MTCC14 sử dụng các mức biến sản xuất
khác nhau theo phương pháp Plackett-Burman.
�1 glucose, �2 maltose, �3 ribose, �4 galactose, �5 cao thịt bò, �6 bột đậu phộng, �7 ammonium
chloride, �8 ammonium sulphate, �9 barbital, �10 pH, và �11 độ ẩm.
 
8/27/22

24


Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
 3.1 Sàng lọc các nguồn cacbon và nitơ, Barbital, pH và độ ẩm để sản xuất Rifamycin B

Bảng 3: Dữ liệu kiểm tra thiết kế ANOVA của Plackett-Burman cho các thông số sản xuất quan trọng.

8/27/22

25