KIỂM NGHIỆM Coliforms VÀ E.coli TRONG THỰC PHẨM

Trường Đại Học Tiền Giang
Khoa Nông Nghiệp – Công Nghệ Thực Phẩm
HP PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH

KIỂM NGHIỆM Coliforms VÀ E.coli TRONG THỰC PHẨM

GVHD:
TS.TRƯƠNG QUỐC TẤT

Lớp: ĐH CNSH 19
Nhóm 3:
Phan Thị Ngọc Hân: 019142002
Đỗ Nhựt Ý: 01914200


1.1. Nguyên tắc
Đồng nhất mẫu, cấy một lượng nhất định lên mơi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sao khi ủ ở
o
37 C trong 24 – 48 giờ. Ngồi lactose, mơi trường chọn lọc cho Coliforms cịn chứa muối mật ức chế vi khuẩn Gram dương và chât chỉ thị pH như neutral red, crystal
violet. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật. Quy trình khẳng định được thực hiện bằng cách
ni cấy trên môi trường BGBL


1.2.
Phương pháp
Đồng nhất 23gmẫu thịt cá tra và pha loãng mẫu bằng 200ml SPW

o
Hút 1ml dung dịch mẫu vào đĩa petri, bổ sung thêm 10 – 15ml môi trường VRB, để đông, ủ 37 C trong 24 – 48 giờ.

Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đậm, có vịng tủa muối mật, đường kính ≥ 0.5mm

o
Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào môi trường BGBL lỏng, ủ 37 C trong 24 – 48 giờ.

Đếm số ống có sinh hơi, tính tỉ lệ khẳng định Coliforms.

Hình 4.1: Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc.


2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
2.1. Nguyên tắc
o
Mẫu đã đồng nhất được cấy một lượng nhất địnhh trên môi trường thạch chọn lọc chứa lactose, ủ ở 44 C trong 24 giờ.
Trên môi trường VRB, đếm các khuẩn lạc đặc trưng Coliforms, khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.


2.2.
Phương pháp

Đồng nhất 23g mẫu thịt cá tra và pha loãng mẫu bằng 200ml SPW

o
Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào đĩa petri, bổ sung 10 – 15 ml môi trường EMB, để đông, ủ 37 C trong 24 – 48 giờ.

Đếm các khuẩn lạc trịn dẹt, hình dĩa, có màu ánh kim xanh, đường kính ≥ 0,5mm

o
Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào môi trường EC lỏng, ủ 44 C trong 24 – 48 giờ.

Chọn ống nghiệm có sinh hơi, cấy sang môi trường tryptone lỏng, MRVR, SCA

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống nghiệm cho kết quả IMViC + + - Tính tỉ lệ khẳng định E.Coli

Mật độ E.coli

Hình 4.2: Quy trình định lượng E.coli bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc.


3. Kết quả
3.1 Thử nghiệm Coliforms trong mẫu thịt cá tra
Sau 48 giờ ủ, trên các mơi trường VRB có xuất hiện các khuẩn lạc màu đỏ đến đậm hình 4.3

Hình 4.3 Kết quả cấy trang mẫu trên mơi trường VRB
-2
-3
-4
tại các nồng độ 10 , 10 , 10 (theo thứ tự từ trái sang)
Tính kết quả: do số khuẩn lạc ở nồng độ cao nhất thấp hơn 25 nên kết quả là số trung bình cộng các khuẩn lạc đã đếm tính ra cho 1g hoặc 1ml mẫu.

2
2
CFU/g=(21/3)10 = 7.10


Ống Durham

Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hơi của Coliforms trên mơi
trường BGBL

Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hơi của vi khuẩn (nguồn Internet)


3.2Thử nghiệm E.coli trong mẫu thịt cá tra
-2
-3 -4
Mẫu thịt cá tra sau khi đồng nhất và pha loãng ở các nồng độ 10 , 10 , 10 và cấy trang trên môi trường đặc trưng EMB sau 24 giờ ủ xuất hiện các khuẩn lạc trịn dẹt, hình dĩa, có màu ánh
kim xanh. Hình 4.6

Hình 4.6 Kết quả cấy trang mẫu trên môi trường EMB
-2
-3
-4
tại các nồng độ 10 , 10 , 10 (theo thứ tự từ trái sang)


3.2.1. Thử nghiệm Indole
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thểbịoxi hóa bởi một sốvi sinh vậtcó hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện
bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứ a p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màuđỏtrên bềmặtmôi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đơi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol,
tạo ra.

Hình 4.8 Kết quả thử nghiệm Indole (nguồn Internet)


3.2.2. Thử nghiệm Methyl red

+

Nguyên tắc: chỉthị đỏmethyl red giúp phân biệt nồngđộH hiện diện trong môitrường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ; pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu
vàng.
Đọc kết quả: (+) mơi trường có màuđỏsau khi bổsungthuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm.

Hình 4.9 Kết quả thử nghiệm Methyl red (nguồn Internet)


3.2.3. Thử nghiệm Citrate
Nguyên tắc: sựbiến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽtạo ra CO làm kềm hóa mơitrường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng

2

dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH

3

làm kiềm hóa mơi trường. Sự gia tăng giá trị pH này

được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trườngchuyển sang màu xanh dương. (-) khi khơng có khuẩn lạc và mơi trường giữ nguyên màu xanh lục.

Hình 4.10 Kết quả thử nghiệm Citrate (nguồn Internet)


3.2.4. Thử nghiệm VP
Nguyên tắc: môi trường được sử dụng là môi trường lỏng MR-VP, pH 6.9. Dùng que cấy vịng cấy vào các ống mơi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng
thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Sử dụngthuốc thử Barrittư(dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồntuyệt
đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH).

Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ.
Đọc kết quả: Salmonella cho phản ứng âm tính khi có hiện tượng khơng đổi màu trên bề mặt mơi trường, dương tính khi có màu đỏ trên bề mặt mơi trường.

Hình 3.6 Kết quả thử nghiệm VP (nguồn Internet)