Phát hiện nhanh salmonella typhi bằng RT PCR

I.

Vì sao phải sử dụng các phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác
nhau
Salmonella nói chung và S. Typhi nói riêng là một trong những mối quan tâm hàng

đầu của kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. chúng ta ln tìm mọi cách để tối ưu hóa
việc định danh, định tính hay xác định sự có mặt của chúng trong thực phẩm cũng
như nguồn nước. hiện nay có rất nhiều phương pháp phân tích đối tượng S. Typhi, từ
các phương pháp ni cấy truyền thống cho đến hiện đại như PCR, Multix – PCR,
Realtime – PCR,… Tuy nhiên,mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm khác nhau.
Tùy theo hoàn cảnh, thời gian, mục đích hay điều kiện kỹ thuật mà chúng ta có thể
đưa ra lựa chọn phương pháp phù hợp nhất.
II.

Phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trong trứng bị ô nhiễm bằng

cách sử dụng RT - PCR
1. Tổng quan:
RT – PCR (Realtime – PCR) là phương pháp phân tích dùng để khuếch đại phân tử
ADN in vitro, cho phép phát hiện sự tồn tại của Salmonella Typhy trong thực phẩm hay
không.
RT - PCR là một phương pháp thay thế để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh từ thực
phẩm trong đó có Salmonella Typhy. Phương pháp RT – PCR đucợ cho là có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao so với phương pháp PCR thông thường và thời gian cần thiết nhanh hơn
các phương pháp truyền thống hoặc phương pháp nuôi cấy (Dorak, 2006; Drahovská và
cộng sự, 2001; Liu, 2010).
Do đó, phương pháp này có thể được sử dụng cho các phịng thí nghiệm pháp y hoặc
phịng thử nghiệm thực phẩm với số lượng mẫu nhỏ và cung cấp kết quả nhạy, nhanh
chóng.
Năm 2019, Muktiningsih Nurjayadi cùng các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu: Phát

hiện nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trong trứng bị ô nhiễm bằng cách sử dụng RT PCR


2. Nguyên liệu nghiên cứu
Trứng là thực phẩm thường bị nhiễm khuẩn Salmonella Typhi do đặc tính là mơi
trường phù hợp cho chúng phát triển và sinh sản. S. Typhi từ đất xâm nhập vào bên trong
vỏ trứng, tại đây chúng được lòng trắng trứng bảo vệ khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng
khác (Buck và cộng sự, 2003).
3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
 Phân tích RT – PCR nhìn chung bao gồm các bước


Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng PCR với sự có mặt của mẫu dò huỳnh
quang



Gắn mẫu dò huỳnh quang trong mỗi chu trình khuếch đại



Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự kích thích trong mỗi chu trình



Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang



Phân tích số liệu (theo TCVN 11133:2015)

3.1 Chuẩn bị mẫu nuôi cấy

Các mẫu cấy vi khuẩn Salmonella Typhi được nuôi trong 24 giờ trong môi trường đặc
hiệu SSA (Merck) ở 37°C trong đĩa bằng phương pháp phết. Các dịng vi khuẩn được
hình thành khuẩn lạc sau đó được ni cấy qua đêm (18 giờ) trong môi trường Luria
Broth (Deben Diagnostics.Ltd) ở 37°C bằng cách sử dụng tủ ấm.
Đối với các mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn S. Typhi nhân tạo, pha loãng dung dịch từ
huyền phù qua đêm của S. Typhi. Để xác định số lượng khuẩn lạc bị nhiễm trong các mẫu
trứng, 1 mL huyền phù pha loãng ở các độ 10− 4, 10− 5 và 10− 6 được nuôi trong môi trường
SSA (Merck) bằng phương pháp đĩa phết và ủ ở 37°C trong 24 giờ.


Huyền phù được chọn để tính tốn nồng độ vi khuẩn là huyền phù tạo ra một số
khuẩn lạc từ 30 đến 300 dựa trên tiêu chuẩn đếm đĩa của FDA BAM (Sổ tay phân tích vi
khuẩn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm).
Số lượng khuẩn lạc hình thành được tính bằng CFU/mL ni cấy.
3.2 Mẫu trứng nhân tạo nhiễm S. Typhi
Trứng được mua ở chợ, sau đó luộc chín và nghiền mịn vơ trùng. Chuyển mẫu trứng
sang đĩa và chiếu tia UV trong 30 phút. Mẫu trứng được làm nhiễm huyền phù vi khuẩn
theo tỉ lệ thể tích 1:1. Các mẫu thử nghiệm sử dụng huyền phù vi khuẩn ở độ pha loãng
10-6. Mỗi mẫu được ủ ở 37°C trong 18 giờ bằng tủ ấm.
3.3 Phân lập AND
Lấy mỗi nguồn ni cấy, mẫu đối chứng dương tính, mẫu thử nghiệm và mẫu đối
chứng âm tính 1mL và chuyển vào ống Eppendorf, ly tâm với tốc độ 5000/ phút trong 5
phút để tạo cặn. . DNA của vi khuẩn được phân lập từ các cặn hình thành bằng bộ kit
thương mại từ QIAamp DNA Mini Kit (ATL, AL, AW1, AW2, AE buffer).
Độ tinh khiết của DNA phân lập được đo ở tỷ lệ A260/A280 và nồng độ DNA bằng
máy quang phổ GE Nanovue Uv –Vis.
3.4 Tối ưu hóa nhiệt độ ủ
3.5 Tiến hành các thử nghiệm đo đạc



Kiểm tra xác nhận nuôi cấy vi khuẩn Salmonella Typhi



Thử nghiệm độ nhạy và độ đặc hiệu của mồi fim-C đối với Salmonella Typhi
từ nuôi cấy gốc



Kiểm tra xác nhận mồi của fim-C đối với mẫu trứng bị nhiễm bẩn

4. Kết quả
Độ tinh khiết và nồng độ của DNA được phân lập từ nuôi cấy gốc và các mẫu
trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi bằng cách sử dụng Máy quang phổ GE
Nanovue UV-VIS được trình bày trong Bảng 1.


Bảng 1. Độ tinh khiết và nồng độ DNA phân lập được của mẫu nuôi cấy gốc và mẫu
trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi.
Hình ảnh hóa các kết quả của quá trình mồi DNA trong quá trình khuếch đại. Các
dải DNA được tạo ra ở khoảng nhiệt độ 56°C đến 61°C khi so sánh với thang DNA có
kích thước bằng 95 cặp bazơ được thể hiện trong Hình 1.

Hình 1. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ ủ mồi của gen fimC Salmonella Typhi,
(1) Thang DNA 100 bp; (2) Kiểm soát tiêu cực;(3) Đoạn ADN ở nhiệt độ 56 ° C;(4) Đoạn DNA ở
nhiệt độ 57 ° C;(5) Đoạn DNA ở nhiệt độ 58 ° C;(6) Đoạn DNA ở nhiệt độ 59 ° C;(7) Đoạn DNA ở
nhiệt độ 60 ° C; (8) Nhiệt độ đoạn DNA 61 ° C.

Hình 2. Đường cong khuếch đại của ni cấy dự trữ vi khuẩn Salmonella typhi với mẫu DNA nồng
độ 56 nanogam và đối chứng âm tính

Hình 3. Đường cong nóng chảy (melting curve) của Salmonella typhi nuôi cấy với
mẫu DNA 56 nanogam
Kết quả cho thấy độ nhạy của cặp mồi Salmonella Typhi fimC-F (mồi thuận) và
fimC-R (mồi ngược) có thể phát hiện các mẫu DNA có nồng độ thấp nhất là 4528 pg /
μL và đường cong khuếch đại ở nồng độ nhỏ nhất. ở giá trị Ct 23,90 (Hình 4)


Hình 4.Đường cong khuếch đại và đường cong kiểm tra độ nhạy đối với gen fimC
Salmonella typhi.

Hình 5. Đường cong khuếch đại và đường cong nóng chảy trong đánh giá xác nhận
của fimC-F (mồi thuận) và fimC-R (mồi ngược) Salmonella Typhi với ba mẫu trứng.
5. Bàn luận
Việc có một phương pháp nhanh, nhạy và đặc hiệu để định danh vi khuẩn trong
tình huống ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn gây bệnh gây nên là vô cùng cần thiết.
Việc này giúp chữa trị cho nạn nhân hiệu quả và dễ dàng hơn bao giờ hết. RT – PCR
là một phương pháp tối ưu cho trường hợp trên. RT – PCR có thể phân tích nhanh và
phát hiện đối tượng vi khuẩn gây bệnh S. Typhi rất nhạy. Việc áp dụng phương pháp
này để phát hiện S. Typhi trong trứng có thể góp phần kiểm sốt các vụ việc ngộ độc
thực phẩm xảy ra.