Tìm hiểu và phương pháp phân tích VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
---  ---

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 9 NĂM 2021


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
---  ---

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 9 NĂM 202

2


MỤC LỤC

3

DANH MỤC ẢNH

4


DANH MỤC BẢNG BIỂU

5


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề.
Bệnh truyền qua thực phẩm là một mối lo tiềm ẩn đối với nhiều loại thực phẩm
khác nhau bao gồm cả hải sản. Một phân tích về các bệnh do thực phẩm liên quan đến hải
sản được báo cáo cho Hệ thống giám sát bùng phát dịch bệnh do thực phẩm của Hoa Kỳ
từ năm 1973 đến năm 2006. Trong khoảng thời gian 33 năm này, đã có 188 vụ bùng phát,
4.020 ca bệnh, 161 ca nhập viện và 11 ca tử vong được báo cáo là do các tác nhân vi
khuẩn, vi rút hoặc ký sinh trùng, trong đó hải sản được xác định là phương tiện thực
phẩm duy nhất. Khoảng 3/4 số vụ bùng phát này và 2/3 số ca bệnh được báo cáo là do tác
nhân vi khuẩn, 1/5 số vụ bùng phát và khoảng 1/3 tổng số ca bệnh do vi rút và dưới 5%
số vụ bùng phát và các bệnh tiếp theo là do ký sinh trùng.
Vibrio parahaemolyticus đã được xác định là một trong những tác nhân gây bệnh
do vi khuẩn thực phẩm quan trọng nhất trong những năm gần đây. V. parahaemolyticus là
tác nhân hàng đầu gây ra bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính ở người, chủ yếu sau khi tiêu
thụ các sản phẩm biển sống, nấu chưa chín hoặc chế biến sai cách. Chủng này lần đầu
tiên được xác định là nguyên nhân gây bệnh do thực phẩm ở Osaka, Nhật Bản vào năm
1950, nơi bùng phát 272 trường hợp viêm dạ dày ruột cấp tính sau khi ăn cá mồi trắng
(shirasu), dẫn đến 20 ca tử vong. Năm 1958, chủng vi khuẩn này được phân lập từ các
bệnh nhân liên quan đến một vụ ngộ độc thực phẩm ở Thượng Hải, Trung Quốc. Hội
chứng phổ biến nhất liên quan đến nhiễm V. parahaemolyticus là viêm dạ dày ruột, bệnh

tự giới hạn và mức độ nghiêm trọng trung bình. Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng có
thể được điều trị bằng kháng sinh uống. Tuy nhiên, nhiễm trùng có thể gây tử vong ở
những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hoặc ở những người có tình trạng bệnh từ trước,
chẳng hạn như bệnh gan hoặc tiểu đường.
Mục tiêu đề tài.

6


Hiểu rõ về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cũng như khả năng gây bệnh trên thực
phẩm.
Biết về các phương pháp, các nghiên cứu phát hiện Vibrio parahaemolyticus.
Bố cục tiểu luận gồm phần.
Phần 1: Mở đầu: trang 9 đến trang 10.
Phần 2: Tổng quan: trang 11 đến trang 15.
Phần 3: Phương pháp phát hiện Vibrio parahaemolyticus: trang 16 đến trang 28.
Phần 4: Kết quả và bàn luận: trang 29 đến trang 36.
Phần 5: Kết luận và kiến nghị: trang 37 đến trang 40.
Phần 6: Tài liệu tham khảo: trang 41 đến trang 42.

7


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus.
Vibrio parahaemolyticus, hay gọi khác là “Tả biển”, là một loại vi khuẩn Gram âm

hình cong, hình que, được tìm thấy ở biển và cửa sông, khi ăn vào sẽ gây bệnh đường tiêu

hóa ở người. V. parahaemolyticus dương tính với oxidase, hiếu khí một cách dễ dàng và
khơng hình thành bào tử. Giống như các loài khác của chi Vibrio, loài này có tính di
động, với một trùng roi phân cực, đơn lẻ.

Hình 1: Vibrio parahaemolyticus dưới kính hiển vi.

Sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong môi trường biển trên toàn thế giới làm
dấy lên lo ngại của con người về an tồn thực phẩm do vi khuẩn này có khả năng gây
bùng phát dịch bệnh tùy thuộc vào điều kiện môi trường. V. parahaemolyticus là một loại
vi khuẩn Gram âm ưa bóng, thuộc loại vi khuẩn chịu mặn, thường gặp phổ biến rộng rãi
ở môi trường xung quanh cửa sơng, biển và ven biển. Nó sống trong động vật hải sản như
cá, cua, tôm, nhuyễn thể… Chúng phát triển bình thường ở nhiệt độ 10 – 45°C, nồng độ
muối từ 0,5 – 10% và pH 4,5 – 9,6. V. parahaemolyticus nhạy cảm với nhiệt và dễ dàng
bị hủy diệt khi phơi khô thực phẩm. Khi xâm nhập vào cơ thể con người, sau 3 – 4 giờ, V.
parahaemolticus sẽ gây đau bụng, đau ruột.

8


Một số triệu chứng khi nhiễm Vibrio parahaemolyticus: tiêu chảy, đau bụng, buồn
nôn, nôn mửa, sốt và ớn lạnh.
Kháng nguyên của V. parahaemolyticus có 3 loại: kháng nguyên O, kháng nguyên
K và kháng nguyên H.
−

Kháng nguyên O là kháng nguyên màng tế bào bền với nhiệt, được chia thành

−
−

12 nhóm.
Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ chịu nhiệt kém, được chia thành 71 kiểu.
Kháng nguyên H là kháng nguyên tiêm mao, không quan trọng như hai loại
kháng nguyên trên.
Bảng 1: Các kiểu kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus.

Nhóm O
1
2
3
4
5
6

Kiểu kháng nguyên K
Nhóm O
Kiểu kháng nguyên K
1, 25, 26, 23, 28, 41, 56, 58a,
7
7, 19
64, 69
3, 28
8
8, 20, 21, 22, 39, 62, 70
a
a
4 , 5, 6, 7, 29, 30 , 31, 33, 37,
9
9, 23, 44
a

43, 45, 48, 54, 57, 58 , 59, 65
4a, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34,
10
19, 24, 52, 66, 71
42, 49, 53, 55, 63, 67
15, 17, 30a, 47, 60, 61, 68
11
36, 40, 50, 21, 56
6, 18, 46
12
52
a
: có cùng kiểu kháng nguyên K ở các nhóm O khác nhau.

Sự xuất hiện của chủng O3: K6 vào năm 1995 và sau đó lan rộng ra nhiều nước
gây ra một số bệnh tiêu chảy bùng phát, đánh dấu đại dịch đầu tiên của nhiễm trùng V.
parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus là một mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm, gây ra các vấn
đề về sức khỏe trên toàn thế giới. Việc ngăn ngừa nhiễm V. parahaemolyticus đối với
thực phẩm là một mối quan tâm sức khỏe cộng đồng quan trọng. Chính vì thế, để thiết lập
các biện pháp kiểm soát hiệu quả nhằm giảm nguy cơ nhiễm V. parahaemolyticus và đảm
bảo an toàn thực phẩm, phải có các phương pháp phân tích hiệu quả để phát hiện V.
parahaemolyticus trong thực phẩm và môi trường.

9


1.2.

Phương pháp thường quy.

1.2.1. Phương pháp PCR.
PCR là kỹ thuật chuẩn đoán được phát minh bởi một nhà khoa học Mỹ vào năm
1985 được sử dụng phổ biến rộng rãi trong ngành y học và vi sinh vật. Kỹ thuật này luôn
cho tốc độ, độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội. Nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA từ
mẫu ADN chọn lọc.
Ứng dụng của kỹ thuật PCR dùng để phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
được thể hiện ở:
−

TCVN 8710-19:2019 (Quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở
tơm).

1.2.2. Phương pháp real – time PCR.
Real – time PCR là một phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR). Sự tích lũy sản phẩm
PCR được ghi nhận nhờ fluorescence của sản phẩm. Giúp xác định sự hiện diện (định
tính) hoặc nồng độ ban đầu (định lượng) của trình tự DNA/mRNA quan tâm.
Ứng dụng của kỹ thuật real – time PCR dùng để phát hiện vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus được thể hiện ở:
−

ISO 21872:2017 (Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio

cholerae and Vibrio vulnificus).
− TCVN 11133:2015 (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản
ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát hiện và định lượng vi
sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung).
1.2.3. Phương pháp định lượng MPN.
Phương pháp định lượng là các phương pháp dùng để xác định hình dạng, định

danh và số lượng vi sinh vật có trong mẫu. Một số phương pháp định lượng thường gặp

10


là đếm trực tiếp trên kính hiển vi, phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp màng lọc,
phương pháp đo độ đục, phương pháp MPN…
Ở thí nghiệm này sử dụng chủ yếu là phương pháp MPN, còn gọi là phương pháp
pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ, dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật có
xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Việc định lượng này được thực
hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.
Ứng dụng của phương pháp định lượng dùng để phát hiện Vibrio
parahaemolyticus được thể hiện ở:
−

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8988:2012 về vi sinh vật trong thực phẩm – Phương
pháp định lượng V. parahaemolyticus.

1.3.

Phương pháp không thường quy.

1.3.1. Phương pháp LAMP.
“LAMP” là phương pháp khuếch đại nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết
kiệm. Sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được thiết kế nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen
đích (target gene) và quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay thế
mạch. Khuếch đại và phát triển polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở
nhiệt độ cố định (khoảng 65°C). Phương pháp này cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng
DNA được khuếch đại đến 10 9 – 1010 lần trong vịng 15 – 60 phút. Bởi vì tính đặc hiệu
cao, sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng tỏ sự có mặt của đoạn gen quan

tâm.
Nguyên tắc của phản ứng dựa trên đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt
độ cố định khoảng 60 – 65°C trong vòng 45 – 60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ
ở nhiệt độ 80°C trong 2 – 10 phút.

11


1.3.2. Phương pháp DVC – FISH.
Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) là phương pháp cho phép phát hiện
và xác định các vi sinh vật (vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm men) ở loài hoặc
những cấp độ chi bằng cách sử dụng các đầu dò oligonucleotide nhằm vào rARN và được
đánh dấu huỳnh quang, được theo dõi bằng việc phân tích với kính hiển vi huỳnh quang.
Quy trình đếm khả năng sống trực tiếp (DVC) liên quan đến việc cho các tế bào vi
khuẩn hồi sinh môi trường có chứa chất kháng sinh ngăn cản sự phân chia tế bào. Sự kết
hợp của phương pháp DVC với FISH được thực hiện trên rARN có thể thấy khá hữu ích
trong việc phát hiện và xác định các tế bào sống sót trong hỗn hợp vi sinh vật.

12


CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS
2.1.

Phương pháp thường quy.

2.1.1. Phương pháp PCR.
2.1.1.1.

Mục đích.

Phương pháp phân tích này nhằm xác định ADN có hay khơng có mầm bệnh tồn
tại trong mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay
khơng.
Chuẩn đốn bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tơm (AHPND) do vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây ra. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho mẫu nước, bùn hay thức ăn
cho tôm.
2.1.1.2.

Chuẩn bị và tiến hành.

Nguyên liệu chọn để khảo sát.
Loại cảm nhiễm: Tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Tôm nuôi trong giai đoạn từ 4 đến
9 tháng xuất hiện bệnh nhiều nhất.
Triệu chứng lâm sàng:
−

Giai đoạn đầu, triệu chứng chưa rỏ ràng. Tôm chậm lớn, lờ đờ, bỏ ăn, tấp mé và

chết đáy.
− Giai đoạn tơm nhiễm nặng, tơm có hiện tượng mềm vỏ, ruột rỗng, màu sắc thay
đổi. Tôm sậm màu, gan tụy teo ,mềm nhũn, xuất hiện đốm trắng.

13


Hình 2: (A) Gan tụy có màu sẫn; (B) Gan tụy teo; (C) Gan tụy sậm màu, nhũn, ruột rỗng.

Lấy mẫu.

Tôm trưởng thành và tôm bố mẹ (lớn hơn 25 ngày). Thu nguyên con hoặc tụy, gan
và đầu. Mẫu có thể gộp từ 1 đến 5 mẫu. Ấu trùng hoặc hậu ấu trùng tôm (từ 1 ngày tuổi
đến 25 ngày tuổi), thu ngun nơcon ít nhất 1g/mẩu.
u cầu: mẩu tơm phải cịn sống hoặc vừa mới chết, mẫu khơng dập, được lấy vô
trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong túi hoạc lọ vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ từ
2°C đến 8°C không được để quá 24 giờ kể từ khi lấy mẩu đến lúc thực hiện thí nghiệm.
Xử lí mẫu.
Tiến hành cắt nhuyễn hoặc nghiền nát ít nhất 1g mẫu, trộn thành hỗn hợp đồng
nhất.
Phân lập vi khuẩn.
Cấy mẫu lên môi trường thạch TCBS, ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở 28°C đến 30°C
trong vòng 18 giờ đến 24 giờ. Lựa chọn khuẩn lạc phẳng, màu xanh lá đường kính 2mm3mm được cho là Vibrio parahaemolyticus tiếp tục cấy trên môi trường thạch TSA 1%
NaCl ủ ở 28°C đến 30°C trong vòng 24 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần thu được đi nhuộm
gram và kiểm tra hóa sinh.

14


Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc của chủng V. parahaemolyticus trên môi trường TCBS.

Nhuộm Gram
Nhỏ giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, chuyển khuẩn lạc vào mơi trường
TSA 1% NaCl rồi trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên cố định trên tiêu bản ngọn lửa đèn
cồn. Soi kính hiển vi cho thấy được hình thái của chủng vi khuẩn thu được có đặc điểm
như: hình que thẳng hoặc hơi cong ,phẩy khuẩn gram (-) bắt màu hồng ,không hình
thành bảo tử và có tiên mao.

Hình 4: Ảnh nhuộm gram của chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi (40x).

Kiểm tra hóa sinh

Xác định đặc tính hóa sinh dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản vi khuẩn gram âm, di
động và các chỉ tiêu hóa sinh trong bảng sau.
Bảng 2: Đặc tính hóa sinh của một số lồi vi khuẩn Vibrio.
Lồi

Tăng sinh trong canh
dinh dưỡng
0%NaCl
1%NaCl

Các chỉ tiêu hóa sinh
Oxidase

Nhóm 1

15

Nitrate

ADH

LDC

ODC


Vibrio cholera
Vibrio mimicus
Nhóm 2
Vibrio metschinikovii

Nhóm 3
Vibrio cinciatiensis
Nhóm 4+
Vibrio holisae
Nhóm 5
Vibrio damslae
Vibrio fluvisalis
Vibrio fumissil
Nhóm 6
Vibrio alginolyticus
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio vulnificus
Vibrio carchariae

+
+

+
+

+
+

+
+

-

+
+

+
+

-

+

-

-

v

v

-

-

+

+

+

-

v

-

-

+

+

-

-

-

-

+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+

+

v
-

-

-

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

-

+
+
+
+

v
+
v
-

Phương pháp ni cấy phân lập giúp định danh loài vi khuẩn Vibrio, nhưng khơng
thể kết luận được vi khuẩn đó có phải là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở
tơm.
Do vậy trong thực tế để chuẩn đốn hoặc giám sát tác nhân gây bệnh, xét nghiệm
viên cần thực hiện PCR hoặc phương pháp khác để tầm soát sự hiện diện của vi khuẩn
gây bệnh hoại tử cấp tính trong mẫu. những mẫu dương tính được tiến hành định danh và
tăng sinh trong peptone kiềm và xét nghiệm lại bằng kĩ thuật PCR. Chỉ những kết quả
PCR dương tính mới được kết luận là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tơm.
Tăng sinh vi khuẩn
Mẫu sau khi được xử lí được tăng sinh trong mơi trường pepton kiềm, theo tỉ lệ
1:10 ủ ở tủ ấm từ 28°C đến 30°C từ 18 giờ đến 24 giờ.
Tách chiết ADN
Mẫu sau khi tăng sinh được dùng để tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt
hoặc dùng bộ kit tách nhanh thích hợp. sau tách chiết, ADN được bảo quản ở 4°C nếu xét
nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở -20°C hoặc -80°C đến khi tiến hành thí nghiệm.
Tiến hành phản ứng PCR

16


Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan cấp tính sử dụng cặp
mồi AP3 ở nồng độ 10µm với nước tinh khiết.
Bảng 3: Trình tự các cặp mồi và đoạn dị.

Mồi

Trình tự ( 5’-3’)

Kích cỡ sản
phẩm bp

Mồi xuôi AP3-F
Mồi ngược AP3-R

ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC
GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA

336

Chuẩn bị phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy bằng phản ứng PCR theo hướng
dẫn sử dụng. Sau khi kết thúc chương trình chạy máy lấy các ống chứa sản phẩm ra khỏi
máy và giữ ở 4°C để điện di.
Bảng 4: Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen.

Nhiệt độ °C
94
94
53
72
72
Điện di sản phẩm

Thời gian
3 phút

30 giây
30 giây
40 giây
5 phút

Số chu kì
1
30
1

−

Chuẩn bị thạch Agarose 1,5 % pha trong dung dịch TBE 0,5X bổ sung chất nhuộm

−
−
−
−
−

gel.
Đổ thạch vào khn điện di (có lược).
Thạch khơ, rút lược ra cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.
Cho mẫu vào các giếng 10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch nạp mẫu.
Sử dụng thang chuẩn AND.
Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết

nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút.
− Sau khi điện di xong, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh
sáng UV thích hợp.

Bảng 5: Kết quả điện di.

Giếng
Thang chuẩn ADN
Mẫu đối chứng dương

Vạch 336bp
Các vạch sáng rõ ràng
Có
17

Kết quả
Điện di tốt
Hỗn hợp phản ứng PCR


tốt
Mẫu đối chứng dương
hỏng hoặc enzyme
Bị tạp nhiễm
Không tạp nhiễm
Dương tính với AHPND
Âm tính với AHPND

Khơng
Mẫu đối chứng âm

Có
Khơng
Có

Khơng

Mẫu thử

−

Đánh giá kết quả: điều kiện phản ứng được ông nhận khi đối chứng dương có kích
thước vạch sáng 336bp so với thang chuẩn đối chứng âm không xuất hiện bất kì

−

vạch sáng nào
Mẫu dương tính là mẫu phát hiện đồng thời đối với chứng dương có cùng vạch
sáng có chiều dài 336bp so với thang chuẩn. Mẫu âm tính là mẫu khơng có vạch
sáng có chiều dài 336bp.

2.1.2 Phương pháp real – time PCR.
2.1.1.1.

Mục đích.

Phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh ở hàu làm giàu bằng real –
time PCR.
Một thử nghiệm phản ứng chuỗi real – time polymerase (PCR) đã được phát triển
và đánh giá để phát hiện sự hiện diện của gen tdh (thermostable direct hemolysin), một
dấu hiệu hiện tại của khả năng gây bệnh ở Vibrio parahaemolyticus.
2.1.1.2.

Chuẩn bị và tiến hành.

Chuẩn bị các mẫu DNA nuôi cấy tinh khiết để phân tích bằng real – time PCR.
Các chủng vi khuẩn trong Bảng 6 được nuôi qua đêm ở 35°C trong nước peptone
kiềm (APW) (1% peptone, 1% NaCl) và lắc. Sau đó được đun sơi trong một ống có nắp
chụp trong 15 phút. Các mảnh vụn tế bào được tạo thành viên bằng cách ly tâm ở 16.000
vòng/phút trong 30 giây và 2,5µl phần nổi lên trên bề mặt nước APW thu được được sử
dụng làm tiêu bản DNA cho real – time PCR.
Bảng 6: Tính đặc hiệu của thử nghiệm tdh bằng real – time PCR được dựa trên DNA của các vi khuẩn tổng hợp.
Tổng hợp các loài

Số lần được kiểm tra

18

Kiểu gen tdha

Số lượng dương tính tdh
bằng real-time PCR


Aeromonas hydrophila
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Listeria monocytogenes
Salmonella spp.
Vibrio alginolyticus
Vibrio cholerae
Vibrio fluvialis
Vibrio hollisae
Vibrio metschnikovii
Vibrio mimicus

Vibrio vulnificus
Vibrio parahaemolyticusc
Vibrio parahaemolyticusd
a

2
2
2
5
2
2
20
16
7
15
10
20
12
42

+b
+

Được xác định bằng đầu dò DNA phosphatase kiềm;

0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
42
b

Năm chủng tdh dương

tính; Đầu dị DNA và real – time PCR điều kiện tối ưu hóa để tránh bị phát hiện;

c

tdh

chủng âm tính; d tdh chủng dương tính.
Chuẩn bị mẫu hàu.
Chuẩn bị mẫu gồm 10-12 con hàu, pha loãng 1:1 trong nước peptone kiềm
(APW). Thêm 200ml AWP vào 50ml hỗn hợp đồng nhất hàu (hỗn hợp hàu đồng nhất
1:10) và làm giàu qua đêm ở 35°C. 10 ml hàu làm giàu (hỗn hợp hàu đồng nhất 1:10
được qua đêm ở 35°C) được đông lạnh ở -20°C cho đến khi được sử dụng để phân tích
bằng real-time PCR.
Phân tích mẫu hàu cho thấy sự hiện diện của V. parahaemolyticus dương tính tdh
bằng real – time PCR.
Sau khi rã đơng hàu: làm giàu APW ở nhiệt độ phịng, tiêu bản cho xét nghiệm
real – time PCR được chuẩn bị bằng cách đun sôi 1ml chất làm giàu trong 15 phút và sau

đó ly tâm nhanh trong máy ly tâm đặt trên bàn để tạo viên các mảnh vụn tế bào ; 2,5µl
của phần nổi phía trên được sử dụng làm mẫu cho real – time PCR.
Phân tích mẫu hàu để tìm sự hiện diện của V. parahaemolyticus dương tính tdh bằng
phương pháp streak plate/đoạn dò.

19


Đĩa thạch TCBS (Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose), một loại thạch chọn lọc và
phân biệt sau đó được đánh dấu từ q trình làm giàu hàu 1:10 và ủ qua đêm ở 35°C.
Ngày hơm sau, 48 khuẩn lạc nghi ngờ có màu xanh lá cây (âm tính với sucrose) được
chọn và mỗi khuẩn lạc được cấy vào 100µl APW trong tấm 96 – well. Sau đó, tấm 96 –
well được ủ 4 – 6 giờ và sao chép lên đĩa VVA (Vibrio Vulnificus Agar), sử dụng bộ sao
chép 48 ngạnh.

Hình 5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu vi sinh để phân tích bằng real – time PCR và phương pháp streak plate/đoạn dò.

2.1.2. Phương pháp định lượng MPN.
2.1.2.1.

Mục đích.

Phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hoại tử gan tụy tôm bằng phương
pháp định lượng.
Mục đích của thí nghiệm là xác định được hình dạng, định danh vi khuẩn chủ yếu
qua phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống và các phản ứng sinh hóa. Ngồi ra cịn
xác định được số lượng vi khuẩn V. parahaemolyticus có trong mẫu, mật độ vi sinh vật
được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.
2.1.2.2.

Chuẩn bị và tiến hành.

Chuẩn bị mẫu: mẫu tôm bị nhiễm bệnh cịn sống được thu tại ao ni.

20


Một phần mẫu tôm sẽ được cắt nhỏ, xay nhuyễn đến khi đồng nhất. Sau đó cân
50g mẫu vừa đồng nhất vào bình nón đã chứa sẵn 450ml canh thang STB có chứa 3%
NaCl, lắc đều 2 – 3 phút để thu được huyền phù ban đầu 10 -1. Tiếp tục quy trình pha
lỗng để được dung dịch pha lỗng thập phân tiếp theo 10-2, 10-3, 10-4…
Bề mặt ngoài của tơm cịn lại được khử trùng bằng cồn 70° và lau sạch. Dùng pen
tách bỏ phần giáp đầu ngực, khử trùng bề mặt gan tụy tơm rồi dùng nhíp tiệt trùng lấy
một ít gan tụy tơm phết đều lên lame sạch có sẵn một giọt dung dịch Davidsion (khơng có
glacial acetic acid), để khơ ở nhiệt độ phịng. Phần gan tụy này sẽ được mang đi quan sát
dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.
Lưu ý: Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy.
Lấy 10ml huyền phù ban đầu, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml môi trường
GSTB nồng độ kép và 1ml huyền phù ban đầu cho vào 10ml môi trường GSTB nồng độ
đơn. Mỗi độ pha loãng cấy 3 ống.
Lấy 1ml dung dịch mẫu thử từ các độ pha loãng 10 -2, 10-3, 10-4, cho vào ống
nghiệm chứa sẵn 10ml GSTB nồng độ đơn. Mỗi độ pha loãng cấy vào 3 ống GSTB. Ủ
ấm ở 350C trong 18 – 24 giờ.
Phân lập và định danh.
Lấy dịch cấy từ ống canh thang có độ pha lỗng cao nhất cấy sang các đĩa thạch
TCBS. Ria cấy để tạo được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Ủ ấm ở 35 oC trong 18-24 giờ.
Lấy 5 khuẩn lạc điển hình, mỗi khuẩn lạc cấy đồng thời vào canh thang TSB để
xem di động và hình thể, cấy vào thạch TSA để thử khẳng định sinh hóa. Ủ ấm các mơi
trường đã ni cấy ở 35oC từ 18-24 giờ.

Thử nghiệm sinh hóa.
21


Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8988:2012 về
vi sinh vật trong thực phẩm – Phương pháp định lượng V. parahaemolyticus.
Tính số lượng vi khuẩn V. parahaemolyticus có trong mẫu.
Khuẩn lạc điển hình trên mơi trường TCBS tương ứng với nồng độ pha lỗng lớn
nhất của mơi trường GSTB có vi khuẩn phát triển và tính chất sinh hóa phù hợp theo các
phép thử khẳng định. Tra bảng MPN [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007)] ở nồng
độ tương ứng để tính số khuẩn lạc có trong mẫu thử.
2.2.

Phương pháp không thường quy.

2.2.1. Phương pháp LAMP.
2.2.1.1.

Mục đích.

Sử dụng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian (LAMP) để xác định
nhanh chóng các vi khuẩn. LAMP được phát triển để tổng hợp một lượng lớn axit nucleic
bằng cách sử dụng bốn đoạn mồi nhận biết sáu vị trí cụ thể trên DNA. Phản ứng tự động
hóa được thực hiện bằng cách sử dụng DNA polymerase, và các phân tử DNA được
khuếch đại kết hợp magie pyrophosphate dẫn đến độ đục của dung dịch có thể được phát
hiện bằng máy đo độ đục hoặc mắt thường. Một thử nghiệm LAMP đã được thực hiện để
phát hiện V. parahaemolyticus bằng cách sử dụng gen tlh làm mục tiêu, và kỹ thuật này
đã xác định được 143 chủng V. parahaemolyticus, nhưng không phát hiện được 33 chủng
Vibrio khác và 56 chủng không phải chủng Vibrio. Chen và Ge (2010) đã phát triển một
thử nghiệm LAMP khác nhắm vào gen toxR có khả năng phát hiện chính xác 36 chủng V.

parahaemolyticus và khơng tạo ra phản ứng dương tính giả với 39 vi khuẩn khác. Các thử
nghiệm LAMP cũng đã được phát triển để phát hiện các chủng V. parahaemolyticus gây
bệnh cho người chứa các gen tdh, trh1 và trh2, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus,
Campylobacter spp và Salmonella spp. Trong môi trường nuôi tôm, một xét nghiệm
LAMP được thiết kế và xác nhận phù hợp có thể được sử dụng để xác định nhanh chóng
V. parahaemolyticus AHPND chỉ cần sử dụng nồi cách thủy hoặc khối nhiệt đặt ở 60 –
65°C.
22


2.2.1.2.

Chuẩn bị và tiến hành.

Chủng vi khuẩn.
V. parahaemolyticus, V. furnissii, V. fluvialis, V. vulnificus, V. mimicus, V.
alginolyticus, V. harveyi, V. metschnikovii, V. cholerae, V. campbellii, V. cincinatiensis, V.
splendidus, V. gazogenes, V. mytili, Grimontia hollisae, Photobacterium damselae phân
loài damselae, chủng Aeromonas, chủng Pseudomonas, Escherichia coli, chủng
Plesiomonas và Listeria đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Ba mươi ba chủng V.
parahaemolyticus AHPND phân lập được từ gan tụy và ruột của tôm bị bệnh (nuôi thả từ
Bộ môn Vi sinh, Khoa Khoa học, Đại học Prince of Songkla, Thái Lan).
Tiến hành thí nghiệm.
Thí nghiệm LAMP được thực hiện trong 25µl khối lượng thể tích chứa 2µl chiết
xuất DNA, 1,6µM mồi FIP và BIP, 0,8µM mồi F3 và B3, 0,2µM mồi LF và LB, 1µl Bst
DNA polymerase (NEB) trong 2µl dung dịch đệm [0,25 M Tris – HCl (pH 8,8), 0,125 M
KCl, 0,125 M (NH4) 2SO4, 2,5% Tween 20], 16 mM MgSO4, 1,6M Betaine (SigmaAldrich) và 2,8 mM dNTP. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy đo độ đục thời gian thực
Loopamp (Eiken) trong 60 phút ở 65°C và bị bất hoạt trong 2 phút ở 80°C. Các phản ứng
được coi là dương tính khi độ đục đạt 0,1 trong vịng 60 phút. Sự hiện diện của V.
parahaemolyticus trong tất cả các ống dương tính được xác nhận bằng cách sử dụng xét

nghiệm LAMP nhắm vào gen tlh.
2.2.2 Phương pháp DVC – FISH.
2.2.2.1.

Mục đích.

Tối ưu hóa DVC – FISH như một phương pháp phát hiện V. parahaemolyticus,
đặc biệt ở các loài hai mảnh vỏ như hàu và con trai. Ngoài ra, một số kỹ thuật phân tử đã
được so sánh để xác định khả năng tồn tại và sự phát triển của các mầm bệnh như vậy
trong các mẫu hai mảnh vỏ được gửi ở các nhiệt độ khác nhau.

23


2.2.2.2.

Chuẩn bị và tiến hành.

Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc
hiệu cần nhận biết.
Mẫu chuẩn bị là hàu và trai được mua ở siêu thị, với trọng lượng của trai 12 – 16g
và 7 – 11g đối với hàu. Thịt được chiết xuất và để dưới ánh sáng tia cực tím (260nm)
trong khoảng 45 phút cho vắng mặt của vi khuẩn V. paraheamolyticus. Một phần của mẫu
được đồng nhất trong bộ đệm PBS (1:10) và sau đó 100µL được trải trên các đĩa và ủ ở
37°C trong 24 giờ trong điều kiện hiếu khí. Phân tích FISH được thực hiện bằng cách sử
dụng V. parahaemolyticus 16S rRNA oligonucleotide – đầu dò cụ thể (VP612: 5
-TGCAATTCCGAGGTTGAGCCCCGG-3).
Cố định mẫu nghiên cứu.
Các mẫu được cố định bằng paraformaldehyde (PFA) 4%, và 10 µL mẫu cố định
được đặt trên phiến kính phủ gelatin, làm khơ trong khơng khí, khử nước (50, 80, 100%

etanol) và được lai với các đầu dò rRNA VP612 và EUB338 16S.
Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu.
Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt nhằm
kết hợp chính xác các đầu dị đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung. Để xác
định tính hữu ích của phương pháp DVC-FISH trong các nghiên cứu về sự sống sót của
Vibrio, một thử nghiệm đã được thực hiện để mô phỏng các mẫu bị ô nhiễm từ việc mua
ở siêu thị cho đến khi bảo quản lạnh tại nhà.
5 mL môi trường nuôi cấy qua đêm V. parahaemolyticus được thêm vào 5g hàu và
trai cả hai đều được xử lý dưới tia cực tím và được ủ ở 20°C. Ở 0, 10 và 20 phút, thể tích
1mL của chất cấy mẫu đã được giới thiệu trong các ống khác nhau có chứa 9 mL PBS 1X
và việc làm lạnh sản phẩm thực hiện tại nhà trong điều kiện khác nhau cũng được làm
theo (4°C và 8°C). 1mL dịch cấy qua đêm của V. paraheamolyticus được thêm vào 12
ống, mỗi ống chứa 1g hàu và trai được xử lí dưới tia cực tím và được ủ ở 20 oC. 6 ống
24


trong đó được ủ ở 4°C và 6 ống cịn lại ủ ở 8°C. Ở các thời điểm 0, 1, 5, 24, 48 và 96 giờ
ủ, toàn bộ được đưa vào các bình khác nhau chứa 9 mL PBS. Cuối cùng 4mL được lấy từ
mỗi huyền phù PBS: 1mL để phân tích FISH, 1 mL để phân tích bằng DVC – FISH, 1mL
để tách chiết DNA và 1mL được định vị thành số thập phân nối tiếp pha loãng trong dung
dịch sinh lý để xác định CFU/mL (đơn vị hình thành khuẩn lạc). 100µL của mỗi độ pha
lỗng thập phân được mạ trên môi trường mTSA (NaCl 2%) bổ sung 0,1% natri pyruvate
để hồi sinh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thể sống được nhưng không thể nuôi
cấy tế bào với điều kiện cảm ứng ở nhiệt độ thấp.

Hình 6: Ảnh hiển vi FISH cho thấy sự lai tạp của các tế bào V. parahaemolyticus.

Quan sát và xử lý tín hiệu.
Các mẫu lai ghép được hình dung bằng kính hiển vi Olympus huỳnh quang BX50
được trang bị các bộ lọc kích thích U-MWB, U-MWIB và U-MWIG. Ảnh vi màu là được

chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Olympus DP-10. Kết quả được so sánh với kết quả thu
được khi áp dụng đưa mẫu cấy vào đĩa thạch mTSA để phát hiện vi khuẩn sống
được. Các điều kiện khác nhau là được mô phỏng để xác định động học phát triển của V.
parahaemolyticus trong hàu bị ô nhiễm và trai cho đến khi đến tay người tiêu dùng. Quá
trình được gọi là “vận chuyển”, được xác định thời gian trôi qua từ khi mua thực phẩm
cho đến khi bảo quản trong tủ lạnh, là được mô phỏng đối với hàu và trai ở 22°C trong
10, 20 và 30 phút. Như đã trình bày trong Bảng 7, chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus
ban đầu trong hàu và trai chứa 1,7 × 107 cfu/mL và 1,3 × 106 cfu/mL, tương ứng. Số
lượng đĩa vi khuẩn tăng lên trong cả hai mẫu trong suốt thời gian. Xu hướng tương tự
25