Tìm hiểu và phương pháp phân tích VIBRIO CLOLERA

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
----------oOo----------

BỘ MƠN PHÂN TÍCH VI SINH

Báo cáo tiểu luận
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VIBRIO
CLOLERA

Mục Lụ

Tp.Hồ Chí Minh, Tháng 9 năm 2021

Mục Lục...............................................................................................................2
Phụ lục hình ảnh.................................................................................................4
Phụ Lục Bảng......................................................................................................5
LỜI CẢM ƠN.....................................................................................................1
LỜI MỞ ĐẦU.....................................................................................................2
I. TỔNG QUAN..................................................................................................3


1.1. Tổng quan..........................................................................................................3
1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu Vibro cholerae.........................................3
1.3. Một số kỹ thuật dùng để phân tích Vibrio cholerae:..........................................4

II. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)..............................................8
2.1. Vật liệu và phương pháp....................................................................................8
2.1.1. Các chủng vi khuẩn.....................................................................................8

2.1.2. Chuẩn bị AND.............................................................................................8
2.1.3. Mồi PCR.....................................................................................................9
2.1.4. Giao thức PCR............................................................................................9
2.2. Kết quả...............................................................................................................9

III. Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)...................9
IV. Các Phương pháp.......................................................................................10
4.1. Phương pháp định tính:....................................................................................10
4.1.1 Phạm vi áp dụng:.......................................................................................10
4.1.2. Ngun tắc:...............................................................................................10
4.1.3. Mơi trường và hóa chất.............................................................................10
4.1.4. Các bước tiến hành....................................................................................11
4.1.5. Quy trình phân tích:..................................................................................12
4.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập.......................................................................15
4.2.1. Phạm vi áp dụng:......................................................................................15
4.2.2. Phương pháp tiến hành:.............................................................................15
4.2.3. Đọc kết quả:..............................................................................................16

V. Phân tích các phương pháp.........................................................................16
5.1. Phương pháp Elisa...........................................................................................16
5.2. Phương pháp PCR:...........................................................................................17
5.3. Phương pháp ni cấy phân lập:......................................................................18

VI. So sánh qui trình theo TCVN và ISO.......................................................18
Tài liệu tham khảo............................................................................................20


PHỤ LỤC HÌNH ẢNH
Hình 1 Vibrio cholerae.................................................................................................3
Hình 2 Khuẩn lạc Vibrio cholerae trên môi trường Thiosulohate Citrate Bile salt

Sucrose............................................................................................................................. 16


PHỤ LỤC BẢNG
Bảng 1 Mơi trường và hóa chất của phương pháp định tính......................................11
Bảng 2 Một số ứng dụng PCR phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Việt
Nam (PTN Công nghệ sinh học phân tử, trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc
gia TP.HCM)....................................................................................................................17
Bảng 3 Tiêu chuẩn TCVN và ISO của từng phương pháp..........................................18
Bảng 4 So sánh ưu nhược điểm của phương pháp PCR và Elisa..............................19


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên chúng em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô của trường Đại
Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM đã giúp chúng em mở mang kiến thức về ngành
cơng nghệ thực phẩm nói chung và mơn phân tích vi sinh nói riêng. Và đặc biệt chân
thành cảm ơn Thầy Nguyễn Thành Luân đã tận tình truyền đạt những kiến thức và hướng
dẫn chúng em làm bài tiểu luận này.
Do kiến thức còn hạn chế và nhiều yếu tố khách quan, chủ quan khác về vấn đề tìm
thơng tin về bài tài tiểu luận nên chúng em khơng thể trách khỏi những thiếu xót và sai
lầm. Nhưng chúng em sẽ cố gắng hết khả năng của mình để hồn thành đề tài được giao
một cách tốt nhất có thể. Vì vậy mong thầy góp thêm ý kiến để những bài tiểu luận sau
của chúng em được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

1


LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, xã hội càng phát triển thì vấn đề về sức khoẻ cũng được chú trọng hơn hết,

và quan tâm hơn nữa là các căn bệnh tả có gây ảnh hưởng đến tính mạng con người.
Bệnh tả (Cholera) là một loài đặc hữu ở Châu Á, Trung Đông, Châu Phi, Nam và
Trung Mỹ, và Bờ Vịnh của Hoa Kỳ. Các ca bệnh di chuyển vào châu Âu, Nhật Bản, và
Úc đã gây ra sự bùng nổ cục bộ. Ở những vùng lưu hành, sự bùng phát thường xảy ra
trong những tháng ấm áp. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở trẻ em. Ở những khu vực mới bị
ảnh hưởng, dịch bệnh có thể xảy ra trong bất kỳ mùa nào và mọi lứa tuổi đều dễ bị tổn
thương.
Vibrio cholerae là một loại vi khuẩn Gram âm (-) và cũng là tác nhân gây bệnh tả, một
bệnh tiêu chảy nặng, có thể xảy ra thành dịch hoặc bệnh lẻ tẻ, thành dịch và bệnh lưu
hành và nổi tiếng là gây tiêu chảy nghiệm trọng còn gây mất nước có thể dẫn đến tử vong
trong vịng 48 giờ nếu không được điều trị kịp thời. Vibrio cholerae là một mầm bệnh
ngoại bào của ruột non, đã được báo cáo trên toàn cầu chủ yếu ở các nước đang phát triển,
và nơi mà sự lây truyền ngày càg trầm trọng hơn do điều kiện vệ sinh kém và đói là
nguyên nhân dẫm đến hàng triệu ca tử vong mỗi năm.
Để đáp ứng được các thắc mắc về bệnh khuẩn tả ảnh hưởng đến tính mạng con người,
và điều mà mọi người ln quan tâm hơn hết là về sức khoẻ,nhóm sẽ đưa ra nhiều phương
pháp để nhận biết và cách khắc phục bệnh tả do “Vibrio cholerae” gây nên.

2


I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan
Vibrio – phẩy khuẩn, là vi sinh vật hình que và trơng như dấu phẩy, gram (-), có khả
năng di động và là lồi kỵ khí tùy tiện. Tuy nhiên, gây bệnh cho người thì chỉ có 4 lồi là:
V. culnificus, V. cholerae, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. Để làm rõ khả năng gây
bệnh của loài này thì nhóm chọn V. cholerae để phân tích.
V. cholerae là loài vi sinh vật đặc biệt hơn 3 loài cịn lại do nó có thể sinh sống cả ở
vùng nước ngọt trong khi 3 lồi kia thì cần muối cho sự sinh trưởng của bản thân nên chỉ
xuất hiện ở các vùng ven biển. Do vậy, khả năng gây bệnh của V. cholerae cũng cao hơn 3

loài kia do sự phân bố của nó rộng hơn. V. cholera có phản ứng oxidase (+) và arginine
dehydrolase (-), có thể sinh trưởng và phát triển trong canh trypton 420C, có khả năng lên
men được sucrose, khử NO3 thành NO2. Tuy nhiên, chúng khơng thể phát triển ở mơi
trường có nồng độ muối cao nhưng ở nồng độ muối 0 – 3% thì chúng có thể phát triển
bình thường.

Hình 1 Vibrio cholerae
1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu Vibro cholerae

3


Virio cholerae là nguồn nguyên nhân gây ra bệnh tả, nếu nghiêm trọng hơn thì nó có
thể thành đại dịch và để lại nhiều hậu quả cho con người. Bệnh tả là một loại tiêu chảy
cấp tính qua nhiều thế kỷ và nó đã ảnh hưởng đến hàng triệu người trên thế giới. Các đợt
bùng dịch tả thường đi kèm theo thiên tai, chiến tranh, biến đổi khí hậu và sự gia tăng
tồn cầu hóa. Đây là một vấn đề tồn cầu và mang tính dai dẳng hơn so với thập kỷ trước
(Colwell 1996). Trong lịch sử, bệnh tả nằm ở mức nghiêm trọng và có rất ít bệnh có thể
so sánh với nó. Là một bệnh ở người và có thành phần số lượng trong mơi trường khá
đáng kể. Bệnh bắt đầu khi con người ăn phải thức ăn hoặc nguồn nước có chứa vi khuẩn
gây bệnh. Nó bắt đầu đi đến ruột non và bám vào đó rồi tiết ra độc tố vi khuẩn tả (CT).
Sau đó, chúng ta sẽ bị tiêu chảy nghiêm trọng khi hàm lượng độc tố đủ ngưỡng gây độc
rồi nó lại tiếp tục theo phân con người ra môi trường tiếp tục 1 vịng tuần hồn mới gây
lây lan trên diện rộng. Vi khuẩn Virio cholerae sống ở hai mơi trường đó là hệ sinh thái
dưới nước và ký sinh ở vật chủ là con người.
Do vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn này đóng một vai trị rất quan trọng đối với con
người. Giúp chúng ta vạch ra chiến lược ngăn chặn dịch tả xuất hiện, đưa ra biện pháp
điều trị cho bệnh nhân tả, giảm tỷ lệ tử vong tới mức thấp nhất, có phương hướng giải
quyết khi dịch tả bùng phát bên cạnh đó chúng ta có thể nghiên cứu sâu hơn để khai thác
những lợi ích của con vi khuẩn này đem lại. Bên cạnh đó cũng giúp con người chúng ta

hiểu thêm một phần về giới vi sinh vật.
1.3. Một số kỹ thuật dùng để phân tích Vibrio cholerae:
Chỉ có nhóm huyết thanh O gây bệnh tả trong khoảng 140 nhóm huyết thanh của
phẩy khuẩn tả. Vi khuẩn tả gồm 3 loại: O1 (gây dịch tả); O139 (gây bệnh tả); không phải
O1 và không phải O139 (gây viêm ruột cấp tính). Có 2 biotype (tp sinh học) là vi
khuẩn tả cổ điển (do Robert Koch tìm thấy năm 1883) và tả El Tor (do Gotschlich tìm
thấy năm 1905 ở Eltor – Ai Cập) thuộc Vibrio cholerae. Mỗi tuyp lại chia ra 3 tuyp huyết
thanh Hikojima, Inaba và Ogawa. Năm 1816 – 1926 thì tả cổ điển đã gây ra 6 vụ đại dịch
tả trên thế giới. Bắt đầu từ năm 1961 đến nay tả Eltor gây ra đại dịch lần thứ 7. Tại miền
Nam Ấn Độ vào cuối năm 1992 phát hiện ra chủng O 139… Qua đó ta thấy vi khuẩn

4


Vibrio cholerae có nhiều biến thể gây bệnh. Tùy vào từng mục đích, yêu cầu, khả năng,
điều kiện mà chúng ta sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để phân tích Vibrio cholerae.
Chẳng hạn, để phát hiện trực tiếp vi khuẩn tả trong cơ thể người bệnh thì chúng ta
dùng phương pháp xét nghiệm nuôi cấy phân để phân lập vi khuẩn và gửi lên tuyến cao
để xác định chủng huyết thanh phục vụ cho việc điều trị. Để xác định đoạn gen đặc hiệu
của Vibrio cholerae thì chúng ta dùng kỹ thuật PCR (kỹ thuật di truyền phân tử). Xét
nghiệm ELISA thì dùng cho phát hiện và định lượng độc tố vi khuẩn… Hay để định danh
loài vi khuẩn thì ta cũng có phương pháp như thử nghiệm sinh hóa như thử nghiệm
decarboxylaza, thử nghiệm khả năng sinh indol,…
- Phương pháp nuôi cấy để phân lập vi khuẩn vẫn là phương pháp tiêu chuẩn trong
chuẩn đoán vi khuẩn thuộc đường ruột. Người ta dùng phương pháp này xác định tuyp
huyết thanh để làm kháng sinh đồ phục vụ điều trị. Do tính đặc hiệu, dụng cụ quan sát
đơn giản (kính hiển vi) sự sẵn có của dịng phân lập để dùng thử nghiệm bao gồm cả tính
nhạy cảm và dễ phát hiện vi khuẩn đường ruột nhờ vào xét nghiệm miễn dịch được lưu
hành trên thị trường mà phương pháp này được coi như là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên,
phương pháp này cũng có nhiều hạn chế như là độ nhạy kém, thời gian phát hiện mầm

bệnh lâu, nhân viên phải qua đào tạo chuyên sâu, phải có kinh nghiệm cho nên đôi khi
dẫn đến thiếu nguồn lực tại một vài nơi, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ trang thiết bị để có
thể phát hiện mầm bệnh và không phát hiện được tất cả mầm bệnh dựa vào các liều xét
nghiệm miễn dịch và chúng cũng có độ nhạy thấp.


Đối với phương pháp này thì mẫu được đưa trực tiếp vào thạch TCBS,

TTGA, hoặc CHROMagar Vibrio hoặc được làm giàu bằng peptone ở môi trường kiềm
rồi đánh dấu để phân lập trên 1 hoặc cả 3 loại thạch trên. Để cải thiện khả năng phát hiện
hoặc phân lập mẫu đối với các mẫu từ mơi trường thì nên làm giàu mẫu trước. Bắt đầu
phân lập V. cholerae sau thời gian ủ bệnh rồi xác nhận bằng PCR hoặc phân tích sinh
hóa.Tiếp đến, dùng xét nghiệm ngưng kết trên phiên kính bằng mồi PCR hoặc kháng
huyết thanh cho kháng nguyên O1 và O139 để phân nhóm huyết thanh O1, O130, hoặc
khơng phải O1/khơng phải O130. Sau đó, lưu trữ các phân lập này trong thạch dinh

5


dưỡng 0,5% NaCl phủ bằng dầu khống vơ trùng hoặc glycerol dự trữ ở - 700C. Để đảm
bảo khả năng sống và độ tinh khiết của mẫu cần phân lập lại theo định kỳ.
- Phương pháp PCR thì được dùng để chuẩn đoán nhiều loại bệnh ở người, nhiều
loại phân tích và thí nghiệm. Người ta dùng phương pháp này để xác định đoạn gen đặc
hiệu của vi khuẩn tả dựa vào khn DNA sau đó khuếch đại, nhân số lượng nhờ cặp mồi
và enzyme polymerase đặc hiệu. Là phương pháp rất quan trọng trong việc hỗ trợ chuẩn
đoán bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm di truyền. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên,
phương pháp này yêu cầu phải có các thiết bị đắt tiền mà khơng phải phịng thí nghiệm
nào cũng có khả năng mua như máy tuần hoàn nhiệt, khay khuếch tán agargel, bộ tách
DNA… Để thực hiện được phương pháp này thì nhân viên phải được đào tạo, phải có
trình độ và kinh nghiệm. Nhưng phạm vi chuẩn đốn hạn chế, tốn kém và khơng phải ai

cũng có khả năng thực hiện. Khơng những thế, phương pháp này sẽ bị giảm độ nhạy và
độ đặc hiệu khi xuất hiện kết quả dương tính giả và âm tính giả do khơng phân biệt được
tế bào sống và chết.


Mồi chuyên biệt của phương pháp này là những đoạn DNA ngắn bắt cặp

được với một đầu của mạch khuôn.

Để có thể nhìn thấy được sau khi nhuộm, thu nhận được và thao tác được
gen thì cần khuếch đại trình tự gen. Q trình khuếch đại:

Thơng tin mồi bổ sung chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu DNA DNA
giữa 2 mồi được khuếch đại.

Có 3 bước trong 1 chu kỳ, nhiều chu kỳ như vậy lặp lại tạo thành phản ứng
PCR và mỗi lần như vậy thì số lượng mẫu tăng theo cấp số nhân. 3 bước đó là:
o

Bước 1 (biến tính): DNA biến tính trong 30 – 60 giây ở 94 – 950C, mạch

đơn được tạo thành từ việc tách mạch đôi.
o
Bước 2 (bước lai): mạch khuôn bắt cặp với mồi trong 30 – 60 giây ở 40 –
700C.
o

Bước 3 (bước tổng hợp): nâng nhiệt độ lên 720C để DNA polymerase thực

hiện việc tổng hợp khoảng 30 giây đến vài phút.

o
Sau đó, các DNA sẽ được nhuộm ethidium bromide rồi quan sát bằng tia
UV () thông qua điện di sản phẩm trong gel agarose.
6




Ở Việt Nam, quy trình được được đưa ra như sau:

o

Bước 1: tăng sinh khoảng 10 – 20 giờ (tùy đối tượng) khơng hoặc ít chọn

o

Bước 2: thu dịch ni cấy, ly tâm loại tạp chất và gộp sinh khối, huyền phù

lọc.
tế bào trong 10 phút ở 1000C trong với V = trong dung dịch TE (10 mM Tris HCl; pH =
8,0; 1 mM EDTA).
- Phương pháp ELISA – phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme, dùng để
phát hiện và định lượng độc tố của vi khuẩn tả chỉ sau vài giờ khi vi sinh vật bắt đầu tăng
sinh. Đây cũng là một phương pháp được sử dụng khá nhiều vì dễ thực hiện, đơn giản
(hiện nay nhờ vào bộ kit) và có thể mở rộng quy mơ xét nghiệm phục vụ khi có lượng lớn
bệnh phẩm hay khi bùng dịch tả. Đồng thời, độ nhạy với hầu hết các kháng nguyên của
phương pháp này cũng khá cao.


Nguyên tắc:

Kháng thể thu kháng nguyên + kháng nguyên kháng nguyên trên bề mặt giếng +
enzyme có cơ chất đặc hiệu


Với phương pháp thử nghiệm sinh hóa thì người ta dùng để dịnh danh lồi

vi sinh vật. Dựa vào đặc tính của từng loại để phát hiện nó trong vơ số các lồi khác.
Chẳng hạn:

Thử nghiệm decarboxylase: trong điều kiện kỵ khí, ở một số axit amin, CO2
hoặc diamide bị loại bỏ nhóm –COOH do enzyme carboxylase. Có 3 loại thử nghiệm
decarboxylase trong kiểm nghiệm vi sinh là ornithin, arginine và lysine decarboxylase. Ở
đây, nhóm chọn thử nghiệm ornithin decarboxylase (ODC) để phân tích và sản phẩm khi
phân tích là CO2 và putrescine và ở đây CO2 sinh ra được dùng làm chỉ thị pH.

Thử nghiệm indol: và indol là chất phản ứng với thuốc thử p –
Dimethylaminobenzen tạo phức chất có dạng màu đỏ gọi là quinone.
Qua các diễn giải trên, chúng ta thấy được là không phải phương pháp nào cũng có
thể sử dụng mà phải tùy vào trường hợp, điều kiện cơ sở vật chất, con người, mục đích,

7


yêu cầu, những mặt ưu và hạn chế của phương pháp phân tích,… mà lựa chọn phương
pháp để thực hiện cho phù hợp.
II. KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Kỹ thuật này được dùng để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA giúp
khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai đoạn DNA nhờ vậy nhận được hàng triệu bản
sao và được sử dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh, mầm bệnh vi sinh vật đặc biệt là

Vibrio cholerea có trong thực phẩm.
2.1. Vật liệu và phương pháp
2.1.1. Các chủng vi khuẩn
Vibro cholerae O139 và Vibrio cholerae O1 El Tor được sử dụng để đối chứng dương
tính. Cịn Vibrio cholerae O108 dùng làm đối chứng âm tính để phát triển xét nghiệm
PCR.Tất cả các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường LB; đều được bổ sung
1% NaCl để nuôi cấy trong canh và môi trường thạch.
2.1.2. Chuẩn bị AND
Tất cả các chuẩn vi khuẩn đều được nuôi cấy trong môi trường LB ở 370C. Sau khi
tăng trưởng qua đêm, thì dịch cấy được pha lỗng 10 lần trong đệm Tris-HCl và sau đó
đem đun sôi khoảng 10 phút. Tiếp đến đem đi ly tâm, xuất hiện phần nổi phía trên được
sử dụng làm mạch khuôn cho PCR. Thực hiện ở mật độ quang học là 0,6 ở bước sóng 600
nm để xác định độ nhạy của các vi khuẩn được nuôi cấy. Đồng thời, để có thể định lượng
Vibrio cholerae O139 và O1 trong mẫu pha loãng thực hiện bằng cách xác định số lượng
khuẩn lạc còn sống trên thạch LB.
2.1.3. Mồi PCR
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt, mồi là các đoạn DNA
ngắn và có khả năng bắt cập bổ sung với một đầu của mạch khuôn và sẽ được nối dài để
hình thành mạch mới. Để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch cần phải có các thơng
tin tối thiểu về trình tự của DNA. Khi đã được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu thì sẽ

8


có hàng triệu bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Các đoạn mồi O1 và O139 rfb
được tổng hợp trên bộ tổng hợp DNA Oligo 1000M (Beckman, Hoa Kỳ) và được tinh
sạch bằng HPLC pha đảo ngược.
2.1.4. Giao thức PCR
Khuếch đại với ba cặp mồi được thực hiện đồng thời trong các ống ly tâm siêu nhỏ
0,2 ml. Điều kiện khuếch đại được sử dụng là 5 phút ở 940C để biến tính DNA ban đầu và

35 chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm 1 phút ở 940C, 1 phút ở 550C, 1 phút ở 720C, với một
vòng kéo dài cuối cùng. Trong 7 phút ở 720C trong Bộ tuần hoàn nhiệt độ Gradient của
DNA Robo Cycler (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Sau khi khuếch đại, các DNA sẽ
được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể dễ dàng phát hiện nhờ điện di trên gel.
2.2. Kết quả
Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm PCR đa mồi
Các mồi đặc hiệu Vibrio cholerae O1 và O139 được thiết kế từ các vùng cụ thể của
cụm rfb của hai nhóm huyết thanh. Xác định độ nhạy của xét nghiệm PCR đa mồi được
kiểm tra bằng cách thay đổi tỷ lệ nghịch lượng DNA khuôn mẫu của cả O1 và O139. Để
phát hiện tối thiểu của kỹ thuật PCR đa mồi cũng được thiết lập bằng cách kiểm tra các
mẫu cấy vi khuẩn Vibrio cholerae O1 và O139 được pha loãng trong nước. Giới hạn phát
hiện của Vibrio cholerae O1 và O139 lần lượt là 65 cfu và 200 cfu cho mỗi lần xét
nghiệm.
III. KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY)
Có một số xét nghiệm hấp thụ miễn dịch được liên kết với hạt ELISA nhằm phát hiện
và định lượng được độc tố tả (hay còn gọi là choleragen và được viết tắt là CTX) do
Vibrio cholerae tạo ra trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Khi môi trường đệm và pH tối
ưu thì các hạt ELISA có thể phát hiện liên tục 40pg/ml CTX. Để đánh giá độ nhạy và độ
đặc hiệu của hạt ELISA được thực hiện bằng cách sử dụng 239 chủng Vibrio cholerae.
Các chủng này sẽ được cấy vào 2ml nước dùng Cassmino, acid – Yeast Extract và được
nuôi cấy ở 370C trong 18 giờ. Sau đó các chủng này sẽ được qua một bộ lọc màng và bảo
quản ở -800C cho đến khi sử dụng.
9


Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau lên hạt ELISA: Tất cả các môi trường được
sử dụng để nuôi cấy Vibrio cholerae đều được kiểm tra để xác định các thành phần mơi
trường nào có ảnh hưởng đến khả năng phát hiện CTX của hạt ELISA.
IV. CÁC PHƯƠNG PHÁP
4.1. Phương pháp định tính:

4.1.1 Phạm vi áp dụng:
Được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO/ TS 21872-1:2007). Tiêu chuẩn được
quy định phương pháp phát hiện hai loài Vibrio gây bệnh đường ruột ở người là Vibrio
cholerae và Vibrio parahaemolytius.
Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
- Các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi.
- Các mẫu môi trường trong khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm.
4.1.2. Nguyên tắc:
Để phát hiện Vibrio cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một
lượng mẫu xác định được nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được
cấy chuẩn sang môi trường rắn chọc lọc. Các khuẩn lạc giống Vibrio cholerae sẽ được
tiến hành thử nghiệm bằng phản ứng sinh hóa.
4.1.3. Mơi trường và hóa chất
Bảng 1 Mơi trường và hóa chất của phương pháp định tính
Mơi trường và hố chất

Mục đích

APW ( Alkaline Phosphat Water)

Tăng sinh chọn lọc

TCBS (Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose)

Phân lập

Ornithine decarboxylase

Thử nghiệm sinh hóa
để khẳng định

TW ( Trypyone Water)
Kowacs

Thuốc thử Indol

10


4.1.4. Các bước tiến hành

11


Đồng nhất 25g mẫu với 225ml APW và ủ trong 6h ± 1h

Ở 41,50C ± 10C đối với sản
phẩm tươi

Ở 370C ± 10C đối với sản
phẩm đông lạnh sâu hoặc khô

Phân lập trên môi trường
TCBS, ủ trong 24h ± 3h ở 370C

Ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình trên từng mơi trường
Nếu ít nhất 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc

Thạch dinh dưỡng muối ủ trong
370C trong 24h ± 3h

Khẳng định sinh
hóa

Thử nghiệm
decarboxylase

Thử nghiệm Indol

4.1.5. Quy trình phân tích:

12


Đồng nhất 25g mẫu với 225ml APW

Tăng sinh lần 1

Phân lập trên TCBS

Tăng sinh lần 2

Ủ ở 37,0 ± 0.50C trong 24h

Ornithin
(decarboxylaza)

Indol

Cấy dung dịch muối

lỏng dưới bề mặt

Cấy 5ml môi trường
muối tryton-tryptophan

Thêm 1ml dầu
khống vơ trùng

Ủ ở 370C trong 24h

Ủ ở 370C trong 24h

Thêm 1ml thuốc thử
Kovac's

Vibrio cholera : hình
thành vịng màu đỏ

Vibrio cholera: màu
tím

13


 Thử nghiệm khẳng định đối với Vibrio cholerae:
a. Phát hiện ornithin tách nhóm Cacboxyl (Decarboxylaza ) – ODC:
Nguyên tắc:
Các loài vi khuẩn đường ruột khác nhau ở mức độ cảm ứng sẽ tạo thành các enzyme
carboxylase đóng vai trị làm xúc tác phản ứng để loại bỏ nhóm Cacboxyl ở một vài acid
amin để tạo amine hoặc là diamine và CO2 trong điều kiện kỵ khí. Phản ứng sẽ được xúc

tác do Lysine decacboxyl và loại bỏ CO2 ra khỏi lysine và giải phóng CO2 sẽ tạo thành
cadaverine. Khi CO2 được sinh ra sẽ làm tăng pH môi trường, đồng thời ghi nhận sự đổi
màu của chỉ thị pH.
Phương pháp tiến hành:
Cấy dung dịch muối lỏng ngay dưới bề mặt. Thêm khoảng 1ml dầu khống vơ trùng
lên mặt mơi trường. Ủ trong 370C trong 24 h ± 3 h. Oxi tan trong môi trường sẽ được vi
khuẩn sử dụng để tăng trưởng đồng thời làm môi trường trở nên cạn kiệt oxi. Khi đó các
enzyme decacboxylase sẽ được cảm ứng do có hiện diện của cơ chất và phản ứng chuyển
hóa có thể được diễn ra. Sau đó quan sát sự tạo màu trong môi trường.
Đọc kết quả:
Khi môi trường có màu tím hoặc trở nên đục là thử nghiệm dương tính (+) vì có vi
khuẩn mọc và có sự tách nhóm decacboxyl của ornithin. Thử nghiệm âm tính (-) khi môi
trường xuất hiện màu vàng.
b. Phát hiện Indol:
Nguyên tắc:
Các sản phẩm có chứa gốc indol được tạo nên từ Trytophan (là một acid amin có thể
bị oxi hóa do một vài vi sinh vật có hệ là enzyme tryptophanase) và sản phẩm trung gian
của phản ứng oxi hóa tryptophan là indolpyruvic acid IPA và bị biến đổi theo hướng loại
nhóm deamination thành indol.
Phương pháp tiến hành:
Ở thử nghiệm này môi trường sử dụng là môi trường muối trypton – tryptophan.
Thuốc thử là Kovacs.
Cấy khuẩn vào ống chứa 5ml môi trường muối tryton- tryptophan. Ủ ở 370C trong
24h. Sau khi ủ, có thể bổ sung 1ml ether rồi lắc đều chiết tách indol lên lớp dung môi hữu
cơ. Sau đó thêm 1ml thuốc thử Kovacs. Để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu trong lớp
dung môi hữu cơ.
14


Đọc kết quả:

Trên bề mặt mơi trường hình thành vịng màu đỏ là thử nghiệm dương tính (+). Vịng
màu nâu – vàng là thử nghiệm âm tính (-).
4.2. Phương pháp ni cấy phân lập
4.2.1. Phạm vi áp dụng:
- Chuẩn đốn vi khuẩn thuộc đường ruột.
- Xác định tuyp huyết thanh để làm kháng sinh đồ phục vụ điều trị
4.2.2. Phương pháp tiến hành:
Dùng que cấy vòng vừa chạm vào mẫu thành đường zich zắc trên bề mặt môi trường
tăng sinh chọn lọc lên bề mặt đĩa thạch Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS) để
phân lập khuẩn lạp đơn... Sau mỗi đường ria liên tục thì đốt khử trùng que cấy và làm
nguội que rồi thực hiện các thao tác tiếp theo. Sau khi thực hiện xong lật ngược đĩa và ủ
370C trong vòng 18 đến 22 giờ. Sau khi ủ, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của Vibrio
cholerae và đánh dấu các vị trí này dưới đáy đĩa. Sau đó, được cấy chuyền sinh khối từ
Vibrio cholerae trên môi trường phân lập sang môi trường không được chọn lọc và được ủ
qua đêm ở nhiệt độ 370C để thu sinh khối cho các thử nghiệm sinh hoá.

4.2.3. Đọc kết
quả:
Hình
2 Khuẩn lạc Vibrio cholerae trên mơi
trường Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose
Trên bề mặt mơi trường hình dạng Vibrio cholerae có đường kính khoảng 2 đến 3
mm, có màu vàng, hơi phẳng và xung quanh Vibrio cholerae có quầng trắng đục.

15


V. PHÂN TÍCH CÁC PHƯƠNG PHÁP
5.1. Phương pháp Elisa
Được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, y học, đặt biệt trong các quy trình kiểm

tra kiểm tra chất lượng các sản phẩm sinh học
- Trong y học:
Xét nghiệm HIV để xác định kháng nguyên p24.
Chuẩn đoán, điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C, bệnh ung thư...
- Trong thực phẩm:
Dùng để phát hiện độc tố có trong tảo.
Phát hiện vi khuẩn E.coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, sán lá gan… trong
thực phẩm.
Phát hiện chất chloramphennicol trong tôm, cá và sản phẩm thủy sản.
Kiểm tra dư lực kháng sinh trong thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ….
Ngoài ra, một ưu điểm khác biệt của Elisa hạt so với RPLA là khả năng của xét
nghiệm cũ để định lượng cholera toxin rất chính xác bằng cách ngoại suy lượng cholera
toxin được tạo ra từ đường cong chuẩn.Vì vậy, Elisa sẽ được lựa chọn trở thành phương
pháp phát hiện cholera toxin hơn trong các phịng thí nghiệm lâm sàng.
5.2. Phương pháp PCR:
Phương pháp PCR thì được dùng để chuẩn đốn nhiều loại bệnh ở người, nhiều loại
phân tích và thí nghiệm. Là phương pháp rất quan trọng trong việc hỗ trợ chuẩn đoán
bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm di truyền. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Được ứng dụng nhiều trong y học
Bảng 2 Một số ứng dụng PCR phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Việt
Nam (PTN Công nghệ sinh học phân tử, trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc
gia TP.HCM)
Vi sinh vật

Mẫu thực phẩm
Thời gian
phát hiện
(giờ)

16

ĐỘ nhạu
phản ứng
PCR
(CFU/phản
ứng)

Độ nhậu
phương pháp
thực hiện
(CFU/25kg
mẫu)


E. coli

Thị heo, sữa, rau
cá

12

90

10

E. coli (ETEC)

Thịt heo, sữa
tươi, rau cái

14

700

5

E. coli 0157:H7

Thịt thủy sản

16

90

10

Salmonella spp.

Thịt thủy sản

12

200

3

Staphylococcus
aureus

Thịt hộp, sữa

tươi, rau cá, thịt
thủy sản

24

200

10

V. chalerae

Thịt thủy sản

14

30

10

V.
parahacmolyticus

Thịt thủy sản

16

370

10

- Phát hiện vi khuẩn kháng thuốc.
- Chuẩn đoán các tác nhân không nuôi cấy (virut viêm gan B.C, virut HIV, herpes, vi
khuẩn chlamydia, mycoplasma…).
Trong công nghệ sinh học: xét nghiệm sinh học phân tử được ứng dụng trong lập bản
đồ gen, giải mã trình tự ADN, phát hiện gen, dịng hóa gen,…
Trong ngành thực phẩm: phát hiện một số vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm.
5.3. Phương pháp ni cấy phân lập:
Là phương pháp quan trọng để phân tích nhiều loại bệnh ở người, nhiều loại phân
tích và thí nghiệm.
Thành tựu nổi bật như: “bắt” thành công virus SARS – CoV, virus cúm A/H5N1, mới
đây đã thành công phân lập được virus SARS – CoV – 2.
VI. SO SÁNH QUI TRÌNH THEO TCVN VÀ ISO
Bảng 3 Tiêu chuẩn TCVN và ISO của từng phương pháp
PHƯƠNG
PHÁP

TCVN

ISO

17


Theo TCVN 11134:2015 do Ban kỹ
thuật tiêu chuẩn quốc gia
TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và
lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học
và Công nghệ công bố.

PCR

TCVN 7607:2017 do Ban kỹ thuật tiêu
chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương
Kỹ thuật ELISA pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng
cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề
nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Nuôi cây phân
lập

TCVN 9716:2013 do Ban kỹ thuật tiêu
chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng
nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và
Công nghệ cơng bố.

ISO 22174:2005
hồn tồn tương
đương với TCVN
11134:2015

ISO 21572:2013
TCVN hồn tồn
tương đương
7607:2017
ISO 8199:2005
hoàn toàn tương
đương với TCVN
9716:2013

Bảng 4 So sánh ưu nhược điểm của phương pháp PCR và Elisa.
Phương pháp PCR

Ưu điểm

Phương pháp Elisa

Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường
không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét
nghiệm.
Xét nghiệm PCR cịn có thể cho ra kết
quả định lượng chính xác số bản copies
virus/ 1 ml máu. Từ đó hỗ trợ rất đắc lực
cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị,
cũng như tiên lượng giai đoạn bệnh.

18

Ưu điểm của phương
pháp này là độ nhạy cao
chỉ cần tạo một loại kháng
kháng thể mang enzyme để
nhận biết cho nhiều kháng
nguyên khác nhau


Nhược
điểm

Xét nghiệm PCR rất khó thực hiện được
một cách chuẩn mực tại các phịng thí
nghiệm lâm sàng.
Giá thành khá cao.
Địi hỏi trình độ của kỹ thuật viên, bác
sĩ phải là người có trình độ cao.
Địi hỏi trang thiết bị , máy móc kỹ
thuật hiện đại.

Tuy nhiên nhược điểm
của nó là tăng số bước thực
hiện do đó làm tăng việc
kiểm sốt các điều kiện,
quá trình thực hiện xét
nghiệm và kéo dài thời
gian chẩn đoán.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Asoke C. Ghose et al., 2011 Feb. Lessons from cholera & Vibrio cholerae. Indian Journal
of Medical Research
2. Kathryn L. Cottingham et al., 01 March 2003. Environmental microbe and human
pathogen: the ecology and microbiology of Vibrio cholerae. ESA Journals
3. Deborah A. Chiavelli et al., 01 July 2001. The Mannose-Sensitive Hemagglutinin of
Vibrio cholerae Promotes Adherence to Zooplankton. ASM Journals
4. Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế, 17/6/2016. Bệnh tả. Truy cập vào 9/8/2021, tại
/>5. Jordi Vila et al., 2016. New molecular diagnostic tools in traveller’s diarrhea. Journal of
Travel Medicine
6. Muhammad Amjad, 2019. An Overview of the Molecular Methods in the Diagnosis of
Gastrointestinal Infectious Diseases. International Journal of Microbiology.
7. MT Rahman et al., 2013. Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review. Modern

Medical College Journal
8. Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm (trường đại học Cơng nghiệp thực phẩm)
9. TCVN 9977:2013
10. “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm”. Trần Linh
Thước, Nhà xuất bản giáo dục
11. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884:2005 (ISO 4833 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm
và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch.

19