TÌM HIỂU VÀ PHÂN TÍCH PSEUDOMONAS AERUGINOSA

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-----o0o----

BÀI TẬP LỚN: HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH
TÊN ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Lớp Học Phần: 10DHTP12
Mã Học Phần: 0101003652

Giảng viên: Nguyễn Thành Ln
Nhóm: 2

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25, tháng 7 năm 2021


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-----o0o----

TÊN ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25, tháng 7 năm 2021

PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ
Trang này đính kèm phiếu giao nhiệm vụ của GVHD

ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................2
1. Tổng quan Pseudomonas aeruginosa..............................................................2
1.1 Hình thái, cấu tạo........................................................................................2
1.2 Cấu trúc tế bào............................................................................................2
1.3 Phân bố.......................................................................................................3
1.4 Đặc điểm nuôi cấy......................................................................................3
1.5 Cấu trúc kháng nguyên...............................................................................4
1.6 Độc lực.......................................................................................................4
1.7 Sinh bệnh học.............................................................................................5
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỦNG
PSEUDOMONAS AERUGINOSA..........................................................................7
I. PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA
TRONG NƯỚC – TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP............................................7
1. Phương pháp định lượng là gì ?....................................................................7
2. Mục địch.......................................................................................................7
3. Nguyên liệu nghiên cứu................................................................................7
3.1 Đối tượng nghiên cứu.............................................................................8
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu...........................................................8
3.3 Trang thiết bị, dụng cụ, môi trường.........................................................8
4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................10
4.1 Thiết kế nghiên cứu..............................................................................10
4.2 Hóa chủng chuẩn..................................................................................10
4.3 Thu mẫu...............................................................................................10
4.4 Bảo quản và vận chuyển......................................................................10
4.5 Lọc mẫu...............................................................................................11
4.6 Pha loãng mẫu......................................................................................11
4.7 Ủ mẫu...................................................................................................11
4.8 Điếm khuẩn lạc....................................................................................11
4.9 Các xác định để khẳng định kết quả.....................................................12

4.10 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả............................................13
4.11 Đánh giá kết quả.................................................................................14
5. Kết quả xét nghiệm chỉ tiêu Pseudomonas aeruginosa trong mẫu nước..15
6. Nhận xét.....................................................................................................20
7. Thảo luận, kiến nghị, so sánh phân tích.....................................................21
8. Tổng kết, kiến nghị....................................................................................22
II. PHƯƠNG PHÁP API 20NE..........................................................................22
1. Tổng quan..................................................................................................22
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử........................................................22
2.1 Thiết bị.................................................................................................22
2.2 Dụng cụ................................................................................................22
2.3 Hóa chất, thuốc thử...............................................................................22
3. Cách tiến hành............................................................................................23
4. Bổ sung thêm thuốc thử và đọc kết quả......................................................23
5. Kết quả........................................................................................................25
6. Nhận xét......................................................................................................26
7. Kết quả nghiên cứu.....................................................................................27
8. Thảo luận, kiến nghị...................................................................................27


III. PHÂN LẬP CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOẠT CHẤT
KHÁNG KHUẨN PYOCYANIN..........................................................................27
1. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu......................................................27
1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn..............................................................27
1.2 Phương pháp PCR...................................................................................28
1.3 Phương pháp định danh API theo Kit 20NE...........................................28
1.4 Phương pháp tách chiếc cơ học (Ly tâm)................................................28
2. Nguyên liệu..................................................................................................29
3. Cách thực hiện phương pháp.......................................................................29
3.1 Phân lập vi khuẩn....................................................................................29

3.2 Xác định các gen đặc trưng cho loài Pseudomonas aeruginosa..............29
3.3 Định danh vi khuẩn (theo Kit 20NE cho vi khuẩn Gram).......................30
3.4 Phương pháp tách chiếc xác định hàm lượng PYO (Essar, 1990)...........30
4. Kết quả nghiên cứu......................................................................................30
4.1 Phân lập vi khuẩn và đặc điểm hình thái của PYO các chủng Pseudomonas
.............................................................................................................................. 30
4.2 Kết quả PCR các đoạn gen đặc trưng cho loài của Pseudomonas aeruginosa
.............................................................................................................................. 31
4.3 Đặc điểm sinh hóa của chủng phân lập...................................................31
4.4 Chiết xuất và định lượng thành phần hiệu quả pyocyanin.......................32
4.5 Khả năng kháng khuẩn của pyocyanin của chủng Pseudomonas sp. PS39
.............................................................................................................................. 32
5. Kết luận những đóng góp của q trình nghiên cứu.....................................33
6. Nhận định, kiến nghị....................................................................................33
IV. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PSEUDOMONAS SP. CÓ KHẢ
NĂNG KHÁNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH HÉO
XANH Ở CÂY CÀ CHUA...................................................................................34
1. Tổng quan....................................................................................................34
2. Nghiên cứu và phương pháp........................................................................35
2.1 Đối tượng nghiên cứu.............................................................................35
2.2 Phương pháp nghiên cứu.........................................................................35
3. Kết quả và thảo luận....................................................................................36
3.1 Phân lập Pseudomonas sp. từ đất trồng cây cà chua...............................36
3.2 Khả năng đối kháng của Pseudomonas sp. và Ralstonia solanacearum37
3.3 Định danh các chủng vi khuẩn đã chọn.................................................39
4. Kết quả........................................................................................................41
5. Kết quả nghiên cứu cơng trình....................................................................41
V. ĐỊNH DANH CHỦNG ĐỐI KHÁNG CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA
TRONG HÀNH TÍM............................................................................................42
1. Tổng quan phương pháp..............................................................................42

1.1 Phương pháp phận lập, ni cấy vi khuẩn...............................................42
1.2 Phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA...............................................42
1.3 Phân tích phương sai - ANOVA trên phần mềm SPSS20........................42
2. Phương pháp phân lập và định danh các chủng vi sinh vật có thể chống lại bệnh
thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.......................................42
3. Phương pháp phân lập các vi khuẩn trong đất trồng hành tím....................43
3.1 Phương pháp phân lập các vi khuẩn trong đất trong hành tím................43


3.2 Khảo sát mức độ đối kháng của vi khuẩn phân lập trong đất đối với
Pseudomonas aeruginosa trên đĩa thạch...............................................................43
3.3 Khảo sát khả năng chống lại bệnh thối củ hành tím của vi khuẩn đối kháng
trong nhà lưới.......................................................................................................44
4. Định danh chủng đối kháng.........................................................................44
5. Xử lý số liệu.................................................................................................44
6. Kết quả.........................................................................................................44
6.1 Khả năng đối kháng của huyền phù và dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phân lập
từ đất..................................................................................................................... 44
6.2 Hiệu quả giảm bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà
lưới....................................................................................................................... 45
6.3 Định danh vi khuẩn đối kháng................................................................46
7. Thảo luận.....................................................................................................47
8. Kết luận........................................................................................................48
9. Thảo luận, kiến nghị....................................................................................48


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.11. Yêu cầu về chỉ tiêu P. aeruginosa trong mẫu nước...............................14
(Theo QCVN 6 – 1:2010/BYT).............................................................................14
Bảng 5.1. Kết quả xét nghiệm chỉ tiêu P. aeruginosa trong các mẫu nước bình uống

liền bằng phương pháp lọc màng.....................................................................15
Bảng 4: Đọc kết quả của các phản ứng sinh hóa của kít API 20NE.......................24
Bảng 5.2: Kết quả test thử sinh hóa API 20NE đối với một số chủng vi khuẩn phân
lập trong mẫu nghiên cứu sau 24h nuôi cấy.....................................................26
Bảng 3.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn phân lập...........................37
Bảng 3.2.2 Hoạt lực đối kháng của 5 chủng vi khuẩn phân lập và Ralstonia
solanacearum sau 72 giờ..................................................................................39
Bảng 3. 3.1.Đặc tính của chủng Pseudomonas P04................................................40

7


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Trực khuẩn mủ xanh...................................................................................4
Hình 1.7. Nhiễm trùng bệnh viện.............................................................................7
Hình 5.2: Kiểm tra sự phát huỳnh quang của P. aeruginosa dưới đèn UV............19
Hình 5.3 Vi khuẩn P. aeruginosa phân lập trong các mẫu nước dưới kính hiển vi
quang học (1.000 X)........................................................................................20
Hình 5.4. Số lượng mẫu phân tích và số mẫu nhiễm vi khuẩn...............................20
Hình 5.5. Kết quả đánh giá chất lượng các mẫu nước xét nghiệm đối với chỉ tiêu P.
aeruginosa........................................................................................................21
Hình 5.1. Test API 20NE xác định tính chất sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ
mẫu xét nghiệm ( mẫu 15, mẫu 46 ).................................................................26
Hình 6.1. Test phản ứng oxidase ( chủng phân lập từ mẫu 16 ).............................28
Hình 3.1.2. Hình dạng khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn P01, P02, P03, P04 và P05
......................................................................................................................... 39
Hình 3.2.1 Hoạt lực đối kháng giữa 5 chủng vi khuẩn phân lập và Ralstonia
solanacearum...................................................................................................39
Hình 3.2.3 Hoạt lực đối kháng mạnh giữa chủng vi khuẩn P04 và Ralstonia
solanacearum...................................................................................................40

Hình 3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S-rRNA của chủng P04...................41
Hình 3.3.3. Kết quả so sánh sự tương đồng giữa chủng P04 và Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071...................................................................................42
Hình 1. Chủng vi khuẩn 3B những đặc tính, sinh lý và sinh hóa...........................48
Hình 2.Chủng vi khuẩn 4A những đặc tính, sinh lý và sinh hóa............................48

8


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của con người
ngày càng cao; con người có thể làm ra nhiều của cải vật chất, nâng cao chất lượng
cuộc sống khi có một sức khỏe tốt. Tồn tại xung quanh chúng ta có rất nhiều tác nhân
gây bệnh mà mắt thường khơng thể nhìn thấy được, trong đó có các vi sinh vật gây
bệnh nguy hiểm. Khi cơ thể suy yếu, sức đề kháng giảm chính là cơ hội để chúng tấn
công. Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ không ngừng nghĩ của nền khoa học cũng
như y học, người ta đã phân lập, phát hiện ra rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây
bệnh; đặc biệt là loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội Pseudomonas aeruginosa ( hay
còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh ) - một trong những tác nhân quan trọng gây nhiễm
khuẩn bệnh viện rất nguy hiểm. Pseudomonas aeruginosa gây ra rất nhiều ca nhiễm
trùng ở hầu hết các bệnh viện, gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau cho con người
như nhiễm trùng đường ruột, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi, tấn công vào các
vết thương, vết mổ của người bệnh và gây ra tình trạng nhiễm trùng huyết nặng. Nó là
nguyên nhân thường xuyên của các bệnh nhiễm trùng rất phức tạp và đe dọa tính
mạng con người. Vì vậy, việc tìm hiểu, nghiên cứu các tác nhân gây bệnh và cách chữa
trị cho con người là việc làm thiết thực có ý nghĩa vơ cùng quan trọng, góp phần vào
sự phát triển chung của toàn nhân loại.

9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1. TỔNG QUAN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
1.1. Hình thái, cấu tạo
Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn gram âm hiếu khí, có dạng hình que nhỏ, đứng
một mình hay thành đơi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn, hai đầu tròn, thẳng hoặc hơi
cong nhưng không xoắn, dài khoảng 1 - 5μm, rộng 0,5 - 1μm. Trực khuẩn mủ xanh
không sinh bào tử, có khả năng di động nhờ tiên mao đơn cực, dinh dưỡng linh hoạt
đáng kinh ngạc.

Hình 1. Trực khuẩn mủ xanh
1.2. Cấu trúc tế bào
Vỏ polysaccaride: P. aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm
nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn gọi là alginate. Để bảo vệ
che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn
dịch của cơ thể vật chủ thì các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu
trúc biofilm.
Màng sinh chất: Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại
protein trên bề mặt gắn trên màng sinh chất (Protein F) và vận chuyển có chọn lọc các
chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500 Da. Nó giúp ngăn khơng cho các chất có
hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P. aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều
loại kháng sinh và giảm tính thấm của màng.
Tiên mao và tiêm mao: P. aeruginosa có một tiên mao (flagella) duy nhất ở một cực,
tiên mao giúp cho vi khuẩn di động. Tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là
flagellin. Các flagellin mang tính chất kháng nguyên, được gọi là kháng nguyên lông
H. Tiêm mao (pili): là những sợi lông rất mảnh, mọc quanh bề mặt tế bào và dài
khoảng 6 nm. Tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào bề mặt biểu mô của tế bào vật chủ hay
môi trường lỏng trong quá trình lây nhiễm.
Vật chất di truyền: Vật chất di truyền của P.aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng
vòng tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa

1
0


khoảng 65% là (Guanine + Cytosine). Ngoài ra, P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di
truyền ngồi nhân đó là các plasmid kháng lại với hầu hết các kháng sinh nên khi điều
trị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa gây ra rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị.
1.3. Phân bố
Trực khuẩn mủ xanh là một vị sinh vật rất phổ biến được tìm thấy trong các mơi
trường sống như: đất, nước, con người, động vật, thực vật, các bể bơi, hồ tắm nước
nóng, nước thải và bệnh viện và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới.Vi khuẩn
không chỉ phát triển trong mơi trường khơng khí bình thường mà cịn sống trong mơi
trường có ít khí ơxy, do đó vi khuẩn có thể cư trú trong nhiều mơi trường tự nhiên và
nhân tạo. P.aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng cơ hội ở người. Nó là "cơ
hội" vì nó hiếm khi lây nhiễm cho những người khỏe mạnh. Thay vào đó, nó thường
xâm nhập vào những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch, như những người bị xơ nang,
ung thư hoặc AIDS.
Nhiễm khuẩn do P.aeruginosa sinh trưởng ngay trong các thuốc dùng cho điều trị,
khơng những thế nó còn tồn tại được ở cả trong một số chất tẩy uế, các bồn và các
dụng cụ làm thơng khí có thể ơ nhiễm nặng, đây là nguồn gây nhiễm ra môi trường rất
cao. Ở bệnh viện, trực khuẩn mủ xanh thường tìm thấy ở đầu các máy khí dung, máy
hút ẩm, máy hơ hấp nhân tạo, ống thơng, bình chứa nước, thậm chí ở một số dung dịch
sát khuẩn dùng để rửa vết thương cho bệnh nhân.
1.4. Đặc điểm nuối cấy
Vi khuẩn hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch
máu, thạch dinh dưỡng, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 ,nhiệt độ thích hợp 30 - 37 0C, nhưng
có thể phát triển được ở 41 0C. Khuẩn lạc thường lớn, trong, bờ đều hoặc không đều,
trên nền môi trường màu hơi xanh có màu xám nhạt và có thể có ánh kim loại. Loại
khuẩn lạc xù xì hoặc nhầy cũng có thể gặp.

Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm. Trên môi
trường nuôi cấy có pepton, nó có thể tiết ra các loại sắc tố cụ thể:
- Pyocyanin: Là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan được trong nước và
chlorofoc, khuyếch tán ra môi trường nuôi cấy làm cho môi trường và khuẩn lạc có
màu xanh. Sắc tố này sinh ra thuận lợi trong mơi trường tiếp xúc nhiều với khơng khí.
Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin. Để phân biệt giữa P.aeruginosa với
các vi khuẩn khác thì đây là một đặc điểm quan trọng .
- Pyoverdin: Là loại sắc tố huỳnh quang, không tan trong chlorofoc nhưng tan trong
nước, phát ra màu xanh khi chiếu tia cực tím có bước sóng 400nm vào.
- Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt,trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này chỉ 1%. số
chủng.
- Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, trực khuẩn mủ xanh chỉ sinh sắc tố này 1-2% số
chủng.
Trực khuẩn mủ xanh khơng sinh sắc tố có khoảng 5-10% số chủng.

1
1


1.5. Cấu trúc kháng nguyên
Pseudomonas aeruginosa có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ở ngoại cảnh. Trong số
các vi khuẩn, nó có sức kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh. Mức độ kháng
thuốc này là do cấu trúc các lỗ porin của màng ngoài làm hạn chế các thuốc kháng
sinh.Về cấu trúc kháng nguyên Pseudomonas aeruginosa có 2 loại kháng nguyên đó là
kháng nguyên O chịu nhiệt và kháng nguyên H không chịu nhiệt.
Kháng nguyên H: Là kháng ngun lơng của vi khuẩn, kháng ngun có đặc điểm:
Chịu được tác động của focmol 0,5% nhưng không chịu được nhiệt, bị cồn 50% và các
men tiêu protein phá hủy.
Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân của vị khuẩn, đã có đến 16 loại do đó dựa
vào kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết thanh ký hiệu từ P1

đến P16. Kháng nguyên O có đặc điểm: bị phá hủy bởi focmon 0,5% ,chịu được nhiệt,
kháng cồn, rất độc.
1.6. Độc lực
Vi khuẩn có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập, lan
truyền, phát triển và gây bệnh.
1.6.1. Nội độc tố :
Là thành phần vách tế bào của vi khuẩn, gồm 2 thành phần chủ yếu là lipolysaccaride
(LPS) và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính của nội độc tố chủ yếu do LPS đảm nhiệm.
Nội độc tố của P. aeruginosa tác động tới bạch cầu, tiểu cầu, kích hoạt hệ nội tiết
enzyme và hệ thầnh kinh giao cảm. Nội độc tố cịn hoạt hố hệ kallikreinogen-kinin
gây rối loạn vi tuần hồn, đơng máu, ức chế miễn dịch và sốc.
1.6.2. Ngoại độc tố:
P. aeruginosa sản xuất 2 loại ngoại độc tố đó là Exoenzyme S và Exotoxin A (ETA)bản chất là protein ngoại tế bào. Exoenzyme S: Độc tố này tác động lên tế bào bạch
cầu trung tính và gây độc cho tế bào vật chủ, chủ yếu được sinh ra khi vi khuẩn có mặt
trong những mơ bỏng. Exotoxin A: Phần lớn P.aeruginosa sinh ra độc tố này, độc tố A
khơng bền nhiệt, chúng có vai trị gây chết tế bào và làm kìm hãm sự tổng hợp
protein .
1.7. Sinh bệnh học
Là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng bệnh viện tấn công các bệnh nhân bị suy
giảm miễn dịch,Vi khuẩn cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao
gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phịng mạch. Đó là ngun nhân gây
ra viêm chân lông ở người.

1
2


Hình 1.7. Nhiễm trùng bệnh viện
Nó là một mầm bệnh mạnh đến mức đầu tiên, nó tấn cơng 2/3 số bệnh nhân nặng nhập
viện, và điều này thường là dấu hiệu của các bệnh xâm lấn nhiều hơn. Thứ

hai, P.aeruginosa là tác nhân gây bệnh cơ hội Gram âm hàng đầu tại hầu hết các trung
tâm y tế, có tỷ lệ tử vong 40-60%. Thứ ba, nó biến chứng 90% trường hợp tử vong do
xơ nang; và cuối cùng, nó luôn được liệt kê là một trong ba tác nhân gây bệnh Gram
âm thường xuyên nhất và có liên quan đến các bệnh thị giác tồi tệ nhất. Nó cũng thể
hiện khả năng kháng nội tại đối với nhiều loại hóa chất trị liệu và kháng sinh khác
nhau, khiến nó trở thành một mầm bệnh rất khó loại bỏ.
Vi khuẩn này thích nghi cao với các điều kiện sinh trưởng khác nhau. Tính linh hoạt về
dinh dưỡng, số lượng lớn các yếu tố độc lực và khả năng kháng sinh cao khiến vi
khuẩn này cực kỳ khó tiêu diệt khỏi những người bị nhiễm bệnh, đặc biệt là nhiễm
trùng phổi của bệnh nhân xơ nang.Trong số các vi khuẩn, trực khuẩn mủ xanh có sức
kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh cũng như cần thời gian để phát triển sức
đề kháng và thích ứng khác nhau các phản ứng cũng như các đột biến di truyền góp
phần chống lại hầu hết các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến.Hiểu các cơ chế của
kháng kháng sinh và phương thức tiến hóa cũng như truyền tải của chúng sẽ giúp
chúng ta xây dựng chiến lược kiểm soát kháng thuốc. Phải dùng các kĩ thuật khác để
phân tích đối tượng vi sinh vật đó gây ra nhiều bệnh từ nhiều chủng loại.

1
3


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Để nghiên cứu cặn kẽ hơn về chủng Pseudomonas Aeruginosa này thì hãy cùng nhóm
2 đi qua 5 phương pháp nghiên cứu sau :
-

Phương pháp màng lọc định lượng Pseudomonas aeruginosa trong nước uống
( TCVN 8881:2011 - ISO 16266:2010 – Phương pháp chính quy)

-

Phương pháp định danh API 20NE
Phương pháp phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa sinh hoạt chất kháng khuẩn
pyocyanin
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn pseudomonas aeruginosa. có khả năng kháng vi
khuẩn ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh ở cây cà chua
Định danh chủng đối kháng của pseudomonas aeruginosa trong hành tím

I.

PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS
AERUGINOSA TRONG NƯỚC – TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP
1. Phương pháp định lượng là gì?

Là phương pháp để xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu
Các PP định lượng thường gặp là : PP đếm trực tiếp, PP đếm khuẩn lạc, PP đếm khuẩn
lạc trên màng lọc, PP đo độ đục, PP MPN
Và để nghiên cứu Pseudomonas trong nước thì nhóm chúng tôi sẽ dùng phương pháp
đếm khuẩn lạc trên màng lọc
Vậy phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc là gì?
Phương pháp lọc màng là phương pháp đánh giá chất lượng nước thông qua việc sử
dụng một bộ lọc đặc biệt, tức là màng lọc để bẫy vi sinh vật. Đây là một phương pháp
rất hiệu quả để phân lập và định lượng vi sinh vật trong mẫu nước thử nghiệm. Sử
dụng phương pháp MF, chúng ta có thể xác định chất lượng nước bằng cách biết số
lượng khối vi sinh vật trong mẫu thử nghiệm. Vì vậy, phương pháp lọc màng kiểm tra
cả chất lượng nước và số lượng vi sinh vật trong nước.
2. Mục đích của phương pháp nghiên cứu :
Để xác định lượng Pseudomonas aeruginosa có trong các mẫu nước uống ở các hộ
dân là bao nhiêu? Có đạt đủ các chỉ tiêu, quy định về liều lượng P.aeeruginosa trong

TCVN hay không?
3. Nguyên liệu nghiên cứu:
3.1.

Đối tượng nghiên cứu

Tiến hành thu 50 mẫu nước ở dạng bình dung tích 19,5 lít tại các hộ dân và
các quán ăn trên địa bàn khu vực quận 10 TP.HCM

1
4


3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

-

Địa điểm nghiên cứu: Labo vi sinh, Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký
sinh trùng

-

Côn trùng Trung ương, Labo đã đạt chuẩn ISO 17025/2015

-

Thời gian thực hiện: Từ tháng 1/2019 đến tháng 08/2020.
3.3.

3.3.1.

Trang thiết bị, dụng cụ và các môi trường:
Trang thiết bị

1
5


(Tiêu chuẩn máy móc đều tuân theo quy định ISO 17025/2005) [1]
3.3.2.

Dụng cụ

3.3.3.

Môi trường PCN

.
3.3.4.

Môi trường thạch dinh dưỡng nutrien agar (NA)

3.3.5.

Môi trường Muller – Hinton

16

3.3.6.

Thuốc thử, hóa chất và kít thử khác

4. Phương pháp nghiên cứu:
4.1.

Thiết kế nghiên cứu

-

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu nước bình loại 19,5 lít dùng uống liền thu
tại quận 10, tp.HCM .

-

Mẫu được bảo quản theo các quy định về bảo quản theo TCVN 6663-3 hoặc
ISO 5667-3 và được phân tích ngay khi chuyển về phịng xét nghiệm để kết
quả cho chính xác hơn [2]

Các mẫu đem về sẽ được thực hiện công viêc định lượng Pseudomonas
aeruginosa bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và sử dụng
phương pháp lọc qua màng [3][4]
4.2.

Hóa chủng chuẩn

4.3.

Thu mẫu

-

Theo hướng dẫn thu mẫu nước sử dụng trong xét nghiệm các chỉ tiêu vi sinh
vật NIMPE. Hd 04.pp/31 (Phụ lục 2)

-

Mỗi mẫu thu vào 02 lọ, mỗi lọ 300ml nước
4.4.

-

Bảo quản và vận chuyển mẫu

Vận chuyển và bảo quản mẫu theo TCVN 6663-3 : 2008/ ISO 5667-3 :
2003 [2] [3]
4.5.

Lọc mẫu

17


-

Lọc vô trùng từ 100 đến 250 ml mẫu nước qua màng lọc có đường kính lỗ lọc
0,45 m theo hướng dẫn tại TCVN 6187-1:2009/ISO 9308-1:2000 [5]
4.6.

-

Một số trường hợp cần thiết có thể pha lỗng mẫu ở các nồng độ 10- 1, 10-2,
10-3… bằng dung dịch NaCl 0,85%., ở điều kiện vơ trùng
4.7.

-

Pha lỗng mẫu

Ủ mẫu

Úp ngược đĩa và đặt vào tủ ấm ở 370C- 380C, theo dõi trong thời gian 40 giờ
- 48 giờ, lưu ý là không được làm khô các đĩa môi trường.
4.8.

Đếm khuẩn lạc

-

Đếm khuẩn lạc theo TCVN 8881:2011 (ISO 16266:2010) (2011)

-

Phát hiện và đếm P. aeruginosa để kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng của nước
bằng phương pháp màng lọc [6]

-

Sau 20-24 giờ giờ ủ, kiểm tra và xác định sự có mặt của vi khuẩn cần xét

nghiệm trên đĩa có màng lọc.

-

Có 4 loại khuẩn lạc gồm:
 Loại khẳng định: Đếm tất cả các khuẩn lạc sinh tổng hợp sắc tố xanh
pyocyanin để khẳng định là Pseudomonas aeruginosa.
 Loại ước chừng: Soi đĩa dưới đèn UV để phát hiện các khuẩn lạc có sắc tố
huỳnh quang. Đếm các khuẩn lạc có sắc tố huỳnh quang nhưng khơng
sinh sắc tố pyocyanin sau đó thì tổng hai kết quả sinh sắc tố pyocyanin và
huỳnh quang để tạo thành loại ước chừng Pseudomonas aeruginosa trong
mẫu. Kết quả này sẽ được xác định bằng cấy lại các khuẩn lạc chọn lựa để
phát hiện ammonia trong môi trường acetamide broth.

Lưu ý: Thời gian kiểm tra mẫu dưới đèn UV không quá 5 phút.
 Loại giả định: Đếm tất cả các khuẩn lạc có sắc tố đỏ nâu mà khơng sinh
sắc tố huỳnh quang và các khuẩn lạc này được xác định bằng phản ứng
oxidase, môi trường acetamide broth và King’ B.
 Các loại khác: Không phải P. aeruginosa.
4.9.

Các xét nghiệm để khẳng định kết quả

4.9.1. Các xét nghiệm xác định Pseudomonas aeruginosa từ các dạng
khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc PCN [7]

18


4.9.2.

Xét nghiệm trên mơi trường NA hay cịn gọi nutrient agar

4.9.3.

Phản ứng tổng hợp ammonia trong môi trường acetamide broth

-

Với nhiệt độ 360C-380C các ống môi trường acetamide broth được cấy
chuyển từ môi trường NA trong 20 giờ - 24 giờ.

-

Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Nessler vào trong ống môi trường acetamide để kiểm
tra sự hình thành ammonia.

-

Phản ứng dương tính khi dung dịch trong ống chuyển màu từ vàng đến đỏ
gạch tùy thuộc vào mật độ của ammonia được sinh ra trong ống.
4.9.4.

-

Phản ứng oxidase

Thực hiện đối với những khuẩn lạc trong đĩa PCN ban đầu sinh sắc tố nâu đỏ:
 Nhỏ 2 đến 3 giọt thuốc thử oxidase lên khoanh giấy lọc đặt trong đĩa Petri
 Dùng que cấy nhựa hoặc thủy tinh bắt một khuẩn lạc đã chọn từ các đĩa

NA, phết lên khoanh giấy thấm;
 Phản ứng oxidase dương tính khi trong vịng 10 giây xung quanh vệt phết
xuất hiện quầng màu xanh tím sẫm .

-

Các khuẩn lạc dương tính với oxidase và ammonia được chọn để thực hiện
bước thử tiếp theo.

19


4.9.5.

Phát hiện sắc tố huỳnh quang trong môi trường King’s B

-

Các khuẩn lạc dương tính với oxidase được cấy chuyển từ môi trường NA
sang các ống môi trường King’s B

-

Ủ trong tủ ấm ở 370C ± 10C, tối đa đến 5 ngày. Kiểm tra các ống hàng ngày
dưới đèn UV để phát hiện sắc tố huỳnh quang (thông thường cho kết quả
dương tính sau 24 giờ)
4.10.

Phương pháp xử lý và phân tích số liệu

Đếm số lượng tất cả các khuẩn lạc có:
-

Sắc tố pyocyanin (+)

-

Sắc tố huỳnh quang (+); có ammonia (+) và pyocyanin (-)

-

Sắc tố đỏ nâu (+); có ammonia (+), test oxidase (+) và huỳnh quang (+)
trên môi trường King’s B.

-

Đếm số lượng P. aeruginosa trên 1 màng lọc, trong thể tích mẫu đã lọc ban
đầu theo cơng thức sau:

20


4.11. Đánh giá kết quả
Quy đổi số lượng vi khuẩn từ thể tích mẫu lọc ban đầu về thể tích 250 mL (quy
định chung đối với chỉ tiêu vi khuẩn trong nước uống liền). So sánh với QCVN
6 – 1: 2010/BYT do Bộ Y tế ban hành để đánh giá chỉ tiêu vi khuẩn đó là đạt hay
khơng đạt [8]
Bảng 4.11. Yêu cầu về chỉ tiêu P. aeruginosa trong mẫu nước
(Theo QCVN 6 – 1:2010/BYT)

5. Kết quả xét nghiệm chỉ tiêu pseudomonas aeruginosa trong mẫu nước:
Bảng 5.1. Kết quả xét nghiệm chỉ tiêu P. aeruginosa trong các mẫu nước bình
uống liền bằng phương pháp lọc màng

g

21


22


Ghi chú: Các mẫu phải pha loãng (*) là những mẫu có số lượng vi khuẩn P.

23


aeruginosa quá cao, không đếm được ở lần xét nghiệm đầu tiên
Kiểm tra sự phát huỳnh quang của các vi khuẩn mọc trên màng dưới đèn
UV bước sóng 340-380 nm, kết quả chỉ ra ở bên dưới

Đối chứng dương

Mẫu 38 khơng pha lỗng

Mẫu 46 pha lỗng

Mẫu 4 ( VK loại khác)

Mẫu 38 pha lỗng

Mẫu 49

Mẫu 19

Mẫu 40

So sánh đối chứng

Hình 5.2: Kiểm tra sự phát huỳnh quang của P. aeruginosa dưới đèn UV

Các mẫu phân lập có vi khuẩn P. aeruginosa trong các mẫu nước bình
uống liền cũng được nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học
(1.000 lần). Kết quả, các vi khuẩn này đều bắt màu Gram âm, hình que, hai
đầu trịn, hơi thn, đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi

24


Hình 5.3 Vi khuẩn P. aeruginosa phân lập trong các mẫu nước dưới kính hiển vi
quang học (1.000 X)
Từ các kết quả nêu trên, mức độ ô nhiễm vi khuẩn P. aeruginosa trong các mẫu
nước được thể hiện trong các Hình 5.4

Hình 5.4. Số lượng mẫu phân tích và số mẫu nhiễm vi khuẩn

Hình 5.5. Kết quả đánh giá chất lượng các mẫu nước xét nghiệm đối với chỉ tiêu
P. aeruginosa
6.

Nhận xét:

25