Tìm hiểu và phân tích BACILLUS CEREUS

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BACILLUS CEREUS

TP. HỒ CHÍ MINH, 2021


TP. HỒ CHÍ MINH, 2021


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BACILLUS CEREUS

TP. HỒ CHÍ MINH, 2021


PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ

4


BẢN NHẬN XÉT CỦA GVHD

5

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

6


LỜI CAM ĐOAN
Chúng em cam đoan đề tài tiểu luận này được nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn của
GVHD. Các số liệu và kết quả trong bài tiểu luận là trung thực, không sao chép bất kỳ
bài làm của nhóm khác.
TP.HCM, tháng 08 năm 2021
SINH VIÊN THỰC HIỆN

7


TĨM TẮT TIỂU LUẬN
Mục đích của bài tiểu luận là tìm hiểu các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus
trong thực phẩm. Qua đó có thể giúp nhóm hiểu hơn về các phương pháp kiểm nghiện
vi sinh được ứng dụng trong thực tế.
Trong đề tài này, nhóm tìm hiểu về đặc điểm của vi khuẩn Bacillus cereus, nguyên lí
và các bước thực hiện, ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đếm lạc khuẩn,
phương pháp MNP và phương pháp ELISA sandwich.

8


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài tiểu luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

GVHD học phần đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em trong
suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Trong quá trình thực hiện đề tài chúng em đã gặp khơng ít khó khăn. Nhưng với sự
động viên giúp đỡ của thầy, chúng em cũng đã hoàn thành tốt đề tài tiểu luận của mình
và có được những kinh nghiệm, kiến thức hữu ích cho bản thân.
Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót. Rất mong sự thơng cảm và
đóng góp ý kiến của thầy và các bạn để bài tiểu luận được hồn thiện.
Cuối cùng, xin kính chúc thầy và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong công việc
và cuộc sống.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
TP Hồ Chí Minh, tháng 08, năm 2021
SVTH

9


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

10


DANH MỤC HÌNH ẢNH

11


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TP.HCM:

Thành phố Hờ Chí Minh

TCVN:

Tiêu chuẩn Việt Nam

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent assay

MPN:

Most Probable Number

KN:

Kháng nguyên

KT:

Kháng thể

DD:

Dung dịch

MYP:

Mannitol-Egg Yolk-Polymycin

TBSP:

Tablespoon

PEMBA:

Pyruvat polymyxin

PBS:

Phosphate-buffered saline

PBS-T

Phosphate Buffered Saline-Tween

TMB

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

CV:

Coefficient of variation

12


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề

Ngày nay, an tồn thực phẩm ln là mối quan tâm toàn cầu. Năm 2020, theo số liệu
thống kê của Cục an toàn thực phẩm cho biết, cả nước ghi nhận 48 vụ ngộ độc thực
phẩm làm hơn 870 người mắc, 824 người nhập viện điều trị và 22 người tử vong. So
sánh với cùng kỳ năm 2019, tăng 11 vụ (29,7%) ngộ độc thực phẩm, số người mắc
tăng 18 người và tử vong tăng 17 người. Từ năm 2010 đến năm 2020, người ta phân
tích 1.604 vụ ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật chiếm 38,7%, độc tố tự nhiên chiếm
28,4%, hóa chất chiếm 4,2%,…Trong đó phải kể đến vụ ngộ độc ở Phú Yên do ăn thực
phẩm nhiễm vi khuẩn Bacillus cereus. Chúng được tìm thấy trong mơi trường như đất
và thảm thực vật và nha bào của nó thường gặp trong ngũ cốc, sữa và các sản phẩm đã
được chế biến, gia vị. Bacillus cereus tiết độc tố gây ngộ cho cơ thể người, thậm chí là
tử vong giống như độc tố của St. Aureus và Cl. Perfringens. Hiện nay, Bacillus cereus
được xem là tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm, chỉ sau Salmonella và các
virus khác. Các công nghệ bảo quản đang trở nên quan trọng hơn trong các ngành
công nghiệp thực phẩm hiện đại. Do tỷ lệ mắc bệnh truyền qua thực phẩm do B.
cereus ngày càng tăng và sự phân bố rộng rãi của B. cereus trong thực phẩm, các
phương pháp phát hiện nhanh chóng nhằm mục đích chẩn đốn, ngăn ngừa ngộ độc
thực phẩm. Vì vậy, chúng ta cần tìm hiểu về các phương pháp định lượng và cách tiến
hành để xác định sự hiện diện của Bacillus cereus trong thực phẩm.

13


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.1. Tổng quan
1.1.1.1. Giới thiệu về Bacillus cereus
Dựa theo phân loại quốc tế thì Bacillus cereus (B.cereus) thuộc giới bacteria, ngành
firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceaem, chi Bacillus, loài Cereus.
Bacillus cereus là loài vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, bào tử dạng hình
ovan. Khoảng những năm 1972 đến 1986 đã có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm
do B. cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên

thực tế con số này có thể lớn hơn rất nhiều.

Hình 1.1. Bacillus cereus qua kính hiển vi điện tử

1.1.1.2. Đặc điểm và nguồn gốc Bacillus cereus
Đặc điểm:
-

Là một loại trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, dễ sinh độc tố.
Khơng có khả năng di động
Tăng trưởng nhanh chóng trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 50°c, tối ưu ở 35 - 40°C
pH dao động từ 4,5 - 9,3, thích hợp ở pH từ 7 - 7,2
Có thể dễ dàng tạo bào tử và bào tử này thường nảy mầm rất dễ dàng.

Nguồn gốc: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, bụi, lây
nhiễm vào các loại thực phẩm để qua đêm hay trữ lạnh quá lâu (sữa, gạo, thịt, rau quả,
hỗn hợp gia vị, ngũ cốc,...) thường gây ngộ độc thực phẩm.

14


1.1.1.3. Một số tính chất sinh hóa
-

Khử nitrate thành nitrite
Phản ứng VP (+) (Voges - Proskauer)
Phân giải Tyroxin
Khả năng lên men glucose sinh acid
Tăng trưởng trên NB (Nutrient Broth) chứa 0,001% lysozyme

1.1.1.4. Độc tố và triệu chứng ngộ độc:
Vi khuẩn này có thể tiết ra hai loại độc tố chính:
-

Diarrhoeal toxin (gây tiêu chảy): Vi khuẩn sinh ra độc tố trên thịt, rau quả, gia vị.
Bản chất của nó là một loại protein gây hủy hoại biểu bì, niêm mạc ruột, gây tiêu

-

chảy.
Emetic toxin (gây nôn mửa): Vi khuẩn nhiễm trong gạo hay cơm nguội,…Bản chất
độc tố là phospholipit có tính ổn định cao khơng bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch
dạ dày.

Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi Bacillus cereus là đau bụng, tiêu chảy, không
gây sốt, bắt đầu 4 – 16 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong
khoảng từ 12 – 24 giờ. Ngồi ra cịn dạng triệu chứng ngộ độc khác là cảm thấy buồn
nôn và nôn chỉ sau 1 – 5 giờ khi ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn, không gây tiêu chảy
và kéo dài khoảng 24 giờ.
Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất bệnh tiêu chảy gây ra bởi B.cereus

Tính chất
Liều lây nhiễm
Độc tố được sản sinh
Loại độc tố
Thời gian ủ bệnh
Khoảng thời gian mang bệnh
Triệu chứng

Mô tả

105 – 107 (tế bào/g hoặc /ml thực phẩm)
Trong ruột non
Protein
8 – 16h (thỉnh thoảng >24h)
12 – 24h (có khi vài ngày)
Đau bụng, tiêu chảy ra nước, thỉnh thoảng
buồn nôn

15


Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất của bệnh nơn mửa gây ra bởi B. cereus

Tính chất
Liều lây nhiễm
Độc tố được sản sinh
Loại độc tố
Thời gian ủ bệnh
Khoảng thời gian mang bệnh
Triệu chứng

Mô tả
105 – 108 (tế bào/g thực phẩm)
Trong thực phẩm
Phospholipit
30 phút – 5h
6 – 24h
Buồn nôn, nôn mửa và khó chịu

Cả 2 loại trên đều có thể gây nguy hại đến tính mạng. Tình trạng ngộ độc thực phẩm

gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được sơ chế, chuẩn bị mà không được bảo quản ở
điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi đem ra sử dụng. Thực phẩm thường chứa vi
khuẩn này ở mật độ trên 106 tế bào/g (hoặc tế bào/ml) là đủ để gây ngộ độc. Do vậy
chúng là một trong những mối qua tâm hàng đầu trong vấn đề bệnh gây ra bởi thực
phẩm. Vậy nên, ngày nay các kỹ thuật phát hiện, định lượng B. cereus là một yếu tố rất
quan trọng trong việc có thể xác định được nguyên nhân gây ngộ độc và tìm ra phương
pháp chữa bệnh cho bệnh nhân bị ngộ độc. Qua đó có thể ngăn ngừa vấn đề ngộ độc
trong thực phẩm hay trong môi trường tự nhiên.
1.1.1.5. Sơ lược về các kỹ thuật phân tích Bacillus cereus
Mỗi phương pháp đều có độ nhạy và giới hạn phát hiện khác nhau, tuy nhiên, các
phương pháp tiêu chuẩn do thời gian phân tích lâu và độ nhạy kém, nên ngày nay một
số phương pháp đã được cải tiến phần nào nhược điểm của nó hoặc được thay bằng
những phương pháp hiện đại khác. Nhằm mục đích tiết kiệm thời gian phân tích cũng
như tăng độ đặc hiệu.
a. Phương pháp truyền thống
- Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch-kỹ thuật đếm
khuẩn lạc
Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện
trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi

16


trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc
(colony count) hay đếm đĩa (plate count). Phương pháp đếm khuẩn lạc này có đặc
điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.
Thuật ngữ “giả định” được đưa vào để công nhận thực tế là ở giai đoạn khẳng định
không thể phân biệt được B. cereus với các lồi Bacillus khác có liên quan mật thiết.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường
và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc

độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không
đủ dài. Thông thường, điều kiện nuôi cấy như môi trường, nhiệt độ, thời gian cần đảm
bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số
lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa.
-

Kỹ thuật MPN (Most Probable Number) định lượng Bacilus cereus:

MPN kỹ thuật tính số có xác suất cao nhất, số tối khả hay cịn có tên gọi khác là kỹ
thuật pha lỗng tới hạn hay kỹ thuật chuẩn độ, nó được dựa theo nguyên tắc xác suất
thống kê lượng vi sinh vật hiện có trong một đơn vị thể tích mẫu thực phẩm. Thực tế
thì MPN là một trong những kỹ thuật rất phổ biến được ứng dụng để định lượng vi
sinh vật.
Kỹ thuật này định lượng dựa trên kết quả định tính của loạt thí nghiệm lặp đi lặp lại
nhiều lần (3 – 10 lần) ở mỗi nờng độ pha lỗng khác. Quá trình định lượng này thường
được tiến hành lặp lại ba lần ở ba độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng 3×3 = 9 ống
nghiệm. Trong các lần lập lại một số ống nghiệm sẽ cho kết quả dương tính và một số
cho kết quả âm tính, số MPN của vi sinh vật trong một thể tích của mẫu được ước tính
từ số lượng và sự phân bố của ống nghiệm mang kết quả dương tính, từ đó tra bảng
Mac Crady để có thể suy ra được mật độ vi sinh. Từ bảng MPN của Mac Crady có thể
dễ dàng phân tích những kết quả dương tính cũng là một ưu điểm nổi bật của phần lớn
kỹ thuật MPN. Kỹ thuật MPN được sử dụng để định lượng, phát hiện bất kỳ loại vi
sinh nào, vi sinh vật có nờng độ nhỏ với điều kiện là phải dùng mơi trường lỏng, ngồi
ra khơng sử thiết bị đắt tiền nhưng từ đó vẫn cho ra kết quả khá phù hợp. Vì vậy, ta có

17


thể sử dụng kỹ MPN để định lượng mật độ vi khuẩn Bacillus cereus, từ đó có thể kiểm
sốt được mức độ vi khuẩn có trong thực phẩm, tránh gây ngộ độc thực phẩm.

b. Phương pháp hiện đại
Phương pháp ELISA
Ban đầu kỹ thuật ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay –
RIA), được nghiên cứu bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson, công
bố vào năm 1960 và được giải Nobel y học năm 1977. Tuy phương pháp này có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ, các nhà
nghiên cứu cần phát triển một phương pháp cải tiến thay thế. Năm 1971, hai nhóm
nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van
Weemen đã phát minh một phương pháp mang tính cách mạng hố trong y học, gọi là
kỹ thuật ELISA đang sử dụng hiện nay. Phương pháp sử dụng kháng thể để phát hiện
sự hiện diện của độc tố hoặc vi rút. Năm 1977, sự cải tiến của phương pháp ELISA
Sandwich, trong đó kháng thể phát hiện được phủ lên bề mặt tấm vi, sau đó thêm vào
protein quan tâm được phát triển và thử nghiệm trên một số chất nền. Kỹ thuật liên kết
kháng nguyên hoặc kháng thể với một enzyme tạo phản ứng màu đặc trưng. Quy trình
liên kết enzyme được phát triển độc lập bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce.
Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme-linked Immunosorbent assay)
được viết tắt thành phương pháp ELISA đã được ứng dụng phát hiện GMO (protein
biến đổi gen), độc tố (độc tố botulinum, trong tảo), tác nhân gây bệnh (E.coli,
Salmonell, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus), chất gây dị ứng (gluten trong đậu
phộng). Kỹ thuật ELISA có thể phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm
vài giờ sau khi sinh trưởng. Ngày nay, phương pháp ELISA đã được tiêu chuẩn hóa
thành bộ KIT được ứng dụng rộng rãi. Ví dụ như việc ứng dụng ELISA để kiểm tra
nhanh kháng thể của SARS-CoV-2 (COVID - 19) trong đại dịch toàn cầu.
Cho đến nay, phương pháp ELISA có 4 loại phương pháp chính là: kỹ thuật ELISA
trực tiếp, kỹ thuật ELISA gián tiếp, kỹ thuật ELISA cạnh tranh, kỹ thuật ELISA
sanwich. Tuy nhiên, nhóm chỉ tập trung vào kỹ thuật ELISA sanwich được cải tiến để

18

phát hiện nhanh B. cereus trong thực phẩm. Vì đây là phương pháp mang tính chính
xác cao, tiết kiệm thời gian và đặc hiệu nhất trong tất cả phương pháp ELISA. Phương
pháp này có tên sandwich là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thơng qua việc
kháng ngun được kẹp giữa hai kháng thể.

19


CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP
2.1.1. Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch – kỹ thuật
đếm khuẩn lạc ở 300C (Theo TCVN 4992:2005)
- Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định này áp dụng cho:
+ Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
+ Sản phẩm dùng cho người và thức ăn chăn nuôi.
2.1.1.1. Nguyên tắc thực hiện
-

Cấy một lượng mẫu thử quy định lên bề mặt cấy chọn lọc trong các đĩa Petri.
Trong cùng một điểu kiện, chuẩn bị các đĩa khác và sử dụng các dung dịch pha

-

loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu.
Ủ từ 18- 48 giờ trong điều kiện hiếu khí
Để tính lượng B. cereus trong 1 mililit hoặc 1g mẫu, ta dựa vào lượng khuẩn lạc
khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng được chọn sao cho kết quả có
ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử quy định.

2.1.1.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Dịch pha lỗng

+ Mơi trường thạch
• Mơi trường cơ bản:
Bảng 2.1. Thành phần mơi trường cơ bản

Cao thịt bò
Pepton từ casein
D-mannitol
Natri clorua (NaCl)
Phenol đỏ
Thạch
Nước
a : tùy thuộc vào sức sống của thạch

1,0g
10,0g
10,0g
10,0g
0,025g
12g - 18g a
900ml

- Chuẩn bị:
+ Hịa tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh trong nước, nếu cần thì đun
nóng.

20


+ Điều chỉnh pH sao cho sau khử trùng pH của mơi trường hồn chỉnh đạt 7,2 ± 0,2 ở
25°C.

+ Ở mỗi 90 ml môi trường này được phân phối vào các bình cầu với dung tích thích
hợp. Khử trùng 15 phút trong nời hấp áp lực ở 121°C.
• Dung dịch Polymyxin B
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch Polymyxin B

106 IU a)
100ml

Polymyxin B sunfat
Nước
a)
IU là đơn vị quốc tế

- Chuẩn bị : Hòa tan Polymyxin B sunfat trong nước, sau đó lọc để khử trùng.
+ Dung dịch nhũ tương lịng đỏ trứng
+ Dùng quả trứng gà còn nguyên vẹn, sau đó rửa trong dung dịch tẩy rửa bằng bàn
chải. Tráng sạch, ngâm trong etanol 95%, 30 giây rồi để khô. Để tách riêng lịng đỏ
bằng kỹ thuật vơ trùng, ta chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ quả này sang nửa vỏ quả cịn
lại, tiếp đến cho vào bình cầu vơ trùng và khuấy mạnh.
+ Đun ở nhiệt độ 44°C đến 47°C, 2 giờ trong nời cách thủy. Sau đó để yên từ 18 đến
24 giờ ở 5°C ± 3°C nhằm tạo kết tủa.
+ Bằng cách vô trùng thu lấy nhũ tương phía trên. Dung dịch nhũ tương có thể bảo
quản ở 5°C ± 3°C đến 72 giờ.
• Mơi trường hồn chỉnh (thạch MYP)
Bảng 2.3. Thành phần mơi trường hồn chỉnh

Mơi trường cơ bản
Dung dịch polymyxin B
Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng
-

90 ml
1,0 ml
10,0 ml

Chuẩn bị

Làm tan chảy và làm nguội môi trường cơ bản trong nồi cách thủy ở 44°C – 47°C.
Cho các dung dịch còn lại vào và trộn kỹ sau mỗi lần thêm. Sau đó làm nguội trong
nời cách thủy để ở 44°C – 47°C
• Chuẩn bị các đĩa thạch
21


Từ mơi trường hồn chỉnh rót 15 ml đến 20 ml sang các đĩa Petri vô trùng và để đông
đặc. Các đĩa có thể để bảo quản đến 4 ngày ở nhiệt độ 5°C ± 3°C trước khi làm khô.
Ngay trước khi sử dụng phải làm khô các đĩa, cách tốt nhất là tháo bỏ nắp ra và úp bề
mặt thạch xuống, đặt trong tủ ấm hoặc tủ sấy ở 37°C cho đến khi bề mặt thạch khô.
Thạch huyết cừu
-

Môi trường cơ bản: Thạch huyết
Bảng 2.4. Thành phần môi trường cơ bản

Pepton proteoza hoặc pepton
tương đương
Sản phẩm thủy phân gan
Cao nấm men
Natri clorua (NaCl)
Thạch

Nước
a)
Tùy thuộc vào sức đông của thạch
-

15g
2,5g
5g
5g
Từ 12g đến 18g a)
1000ml

Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh trong nước bằng cách đun sơi.
Chỉnh pH sao cho sau khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C. Phân phối vào bình cầu và khử
trùng 15 phút trong nồi hấp ở 121°C.
Huyết cừu đã khử sợi huyết
-

Mơi trường hồn chỉnh
Bảng 2.5. Thành phần mơi trường hồn chỉnh

Môi trường cơ bản
Huyết cừu đã khử sợi huyết
-

100ml
5ml – 7ml

Chuẩn bị

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ từ 44°C – 47°C, ta thêm huyết cừu đã khử sợi huyết
vào mơi trường cơ bản và trộn đều. Tiếp đến rót các phần ít nhất 12 ml mơi trường
hồn chỉnh sang các đĩa Petri và để đông đặc.
22


2.1.1.3. Cách tiến hành
Cấy và ủ
-

Dùng pipet vô trùng cho vào hai đĩa thạch mỗi đĩa 0,1ml mẫu thử nếu sản phẩm
dạng lỏng hoặc huyền phù và lặp lại quy trình với các dung dịch pha lỗng thập

-

phân tiếp theo
Đối với một số sản phẩm nhất định, để ước tính B. cereus với số lượng nhỏ thì cách
tốt nhất là tăng các giới hạn phát hiện lên 10 lần bằng cách kiểm tra 1ml mẫu thử.
Sử dụng dụng cụ dàn mẫu vô trùng để phân phối 1ml dịch cấy lên bề mặt của đĩa
Petri lớn hoặc khắp bề mặt của ba đĩa Petri nhỏ. Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị

-

cho phép xác định kép sử dụng hai đĩa lớn hoặc sáu đĩa nhỏ.
Dàn đều dịch cấy trên khắp bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt mà không chạm
vào các mép đĩa, mỗi đĩa sử dụng một que dàn mẫu vô trùng. Để chất cấy bám vào

-

thạch, các đĩa này được đậy nắp khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và ủ 18 giờ đến 24 giờ ở 30°C. Nếu khơng nhìn thấy rõ
các khuẩn lạc thì ủ thêm 24 giờ trước khi đếm.

Đếm khuẩn lạc
-

Sau giai đoạn ủ, chọn các đĩa, tốt nhất là ở hai độ pha lỗng liên tiếp, có ít hơn 150

-

khuẩn lạc.
Đếm khuẩn lạc giả định trên mỗi đĩa. Các khuẩn lạc giả định là các khuẩn lạc lớn,
màu hồng eosin và thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa, điều đó chứng tỏ
B. cereus khơng lên men mantinol mà hình thành lecithinase và kháng polymycin.

Hình 2.1. Khuẩn lạc B. cereus trên MYP

Lưu ý: Nếu trên các đĩa màu hồng đặc trưng của khuẩn lạc bị nhạt đi hoặc biến mất
hoàn toàn, chứng tỏ các đĩa chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến sinh axit.

23


Một số chủng B. cereus chỉ sinh ít hoặc khơng sinh lecithinase và các khuẩn lạc này sẽ
khơng có vùng kết tủa bao quanh và chúng cần được thử khẳng định.
Khẳng định
- Chọn và lọc khuẩn lạc để khẳng định
+ Lấy 5 khuẩn lạc giả định từ mỗi đĩa. Nếu có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các

khuẩn lạc giả định có mặt.
+ Nếu khuẩn lạc mọc quá dày và không thể chọn khuẩn lạc phân lập tốt thì cấy ria
năm khuẩn lạc giả định lên các đĩa đựng mơi trường hồn chỉnh. Sau đó ủ ấm từ 18
giờ đến 24 giờ ở 300C.
+ Chọn ít nhất một khuẩn lạc có màu hờng phân lập tốt và đem đi khẳng định khuẩn
lạc theo các quy định sau.
- Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu
+ Cấy đâm sâu, cấy ria hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn lên mặt thạch huyết cừu sao
-

cho thể hiện được tốt phản ứng hồng cầu và ủ trong 24 giờ ± 2 giờ ở 300C.
Giải thích phản ứng sinh hóa

Bảng 2.6. Kết quả khuẩn lạc B. cereus giả định

Phép thử
Thạch MYP
Thử hồng cầu
a

Kết quả khẳng định Bacillus cereus giả định
Hình thành khuẩn lạc màu hồng được bao quanh
bởi một vùng kết tủa
Phản ứng dương tính a

độ rộng của vùng hờng cầu có thể thay đổi

2.1.1.4. Tính và biểu thị kết quả khuẩn lạc B. cereus giả định
Dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha loãng và hiệu chỉnh bằng tỷ lệ đã khẳng định
(% khuẩn lạc được xác nhận là B. cereus) để tính số tế bào B. cereus trong 1g mẫu.

2.1.2. Phương pháp MPN
2.2.2.1. Đặc điểm của phương pháp

24


• Đây là phương pháp định lượng số lượng nhỏ Bacillus cereus giả định bằng kỹ
-

thuật tính số có xác suất lớn nhất-MPN
Phương pháp MPN có thể được dùng để định lượng bất kì nhóm vi sinh vật với
điều kiện duy nhất là được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả

-

biếu kiến thích hợp.
Vi sinh vật cần kiểm nghiệm phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường
nuôi cấy như: sự đổi màu (sinh acid làm chuyển màu mơi trường), sinh hơi, hóa

•
-

đục,…
Ngồi ra, có thể định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn.
Khi áp dụng phương pháp MPN cần biết một số vấn đề sau:
Các vi sinh vật phân bố ngẫu nhiên trong mẫu
Tế bào vi sinh tồn tại ở dạng riêng lẻ, không tồn tại ở dạng chùm hoặc chuỗi.
Môi trường và điều kiện nuôi cấy cho phép ta phát hiện sự sinh trưởng của vi sinh

trong các ống nghiệm cho dù mẫu cấy ban đầu chỉ chứa duy nhất một tế bào.

• Kỹ thuật (Most Probable Number) định lượng Bacilus cereus giả định. Có thể áp
-

dụng cho:
Các sản phẩm dành cho con người và thức ăn chăn nuôi
Các mẫu môi trường được lấy trong khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm.

Phương pháp tính số có xác suất lớn nhất này được áp dụng để từ đó định lượng
Bacillus cereus trong các loại mẫu thực phẩm khác nhau không chứa B. cereus lớn hơn
10 tế bào/g. Đồng thời, phương pháp MPN cũng thường ứng dụng để ta kiểm nghiệm
những mẫu có chứa tinh bột khô khi mà kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở trên khơng cịn thích
hợp.
2.2.2.2. Vật liệu nghiên cứu
-

Sản phẩm cần kiểm tra phải được pha loãng (dịch pha loãng)

Chuẩn bị các mơi trường và hóa chất
-

Mơi trường tăng sinh chọn lọc lỏng: Canh thang polymyxin đậu tương trypton

-

(TSPB)
Môi trường đặc chọn lọc: thạch xanh bromothymol mannitol lòng đỏ trứng
pyruvat polymyxin (PEMBA)

25