CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hóa SINH

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HĨA SINH

MỤC LỤC
Contents
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN.............................................................................................................. 2
MỤC LỤC.......................................................................................................................... 3
DANH SÁCH CÁC HÌNH.................................................................................................6
DANH SÁCH CÁC BẢNG...............................................................................................6
LỜI MỞ ĐẦU....................................................................................................................7
PHẦN I: PROTEIN............................................................................................................8
1.

Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng.....................................8

2.

Phương pháp biuret........................................................................................... 11

3.

Phương pháp lowry........................................................................................... 13

4.

Phương pháp Dumas......................................................................................... 14

5.

Phương pháp nhuộm màu................................................................................. 14

PHẦN II PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE.................................................................. 16

1.

Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand..................................... 16

2.

Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich..............20

3.

Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid..........22

4.

Phương pháp định lượng saccarose.................................................................. 24

5.

Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác........................26

6.

Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid........................27

Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử
DNS 29
7.

8. Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với

KALIFERRYCYANURE........................................................................................... 31
PHẦN III: LIPID (CHẤT BÉO)....................................................................................... 32
1.

Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet.................33

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

2. Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam Rose-

Gottlieb........................................................................................................................ 34
3.

Phương pháp Chloroform- Methanol.............................................................. 35

4.

Phương pháp Babcook...................................................................................... 35

5.

Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Lolch................................36

PHẦN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN.................................................................................. 37
1.

Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột......................................... 38

2.

Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu.............................................. 39

3.

Xác định vitamin C............................................................................................ 40

4.

Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang.....................41

PHẦN V: KHOÁNG........................................................................................................ 43
1.

Phương pháp định lượng Canxi (trong mẫu sữa)........................................... 44

2.

Phương pháp phân tích mangan:..................................................................... 44

PHẦN VI: NƯỚC............................................................................................................ 45
1.

Nhiệt độ.............................................................................................................. 45

2.

Độ pH.................................................................................................................. 45
2.1

Bằng hộp giấy màu......................................................................................... 45

2.2

Phương pháp điện thế - máy đo pH................................................................ 45

3. Độ trong (Transparency), độ đục (Turbidity)..................................................... 46
3.1

Đo độ trong bằng đĩa Secchi........................................................................... 46

3.2

Đo độ đục bằng phương pháp Nephelometric................................................ 47

4.

Tổng chất rắn hòa tan (TDS) và tổng chất rắn lơ lửng (TSS)........................47
4.1

Tổng chất rắn hòa tan TDS (Total dissolved Solid)........................................ 47

4.2

Tổng chất rắn lơ lửng TSS (Total Suspended Solid)...................................... 48

5.

Độ dẫn điện (EC)............................................................................................... 49

6.

Nồng độ muối..................................................................................................... 49

7.

Oxy hòa tan (DO)............................................................................................... 50

8

7.1

Phương pháp Winkler..................................................................................... 50

7.2

Phương pháp điện cực Oxy hòa tan – máy đo Oxy........................................ 51

Độ cứng tổng hợp.................................................................................................. 53
2

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

9

EBOOKBKMT.COM

Độ kiềm tổng cộng................................................................................................. 55
9.1

Độ kiềm carbonate hay độ kiềm phenolphthalein.......................................... 56

9.1.1

Độ kiềm tổng cộng....................................................................................... 56

PHẦN VII: PHÂN TÍCH ENZYME................................................................................ 57
I. Các phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme thông dụng:......................58
1.

Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương pháp wohlgemuth..............58

2 Xác định hoạt độ lipase..................................................................................... 60
3 Khảo sát hoạt độ invertase................................................................................ 61
4 Khảo sát động học và xác định hoạt độ enyme urease.................................... 63
5.

Xác định hoạt độ của enzyme peroxidase..................................................... 66
Phân tích enzyme trong nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay
maltala. 68
6.

II.

Ứng dụng enzyme trong phân tích hóa sinh.................................................... 73

1.

Xác định cacbohydrate.................................................................................. 73

2.

Xác định acid hữu cơ..................................................................................... 74

3.

Xác định alcohol............................................................................................. 76

4.

Xác định các thành phần khác...................................................................... 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 77

3


TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH3…………………………...11
Hình 2: Phương trình đường chuẩn…………………………………………………………12
Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry…………………….13
Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng
470nm…………………………………..16
Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet…………………………………………………………………
33
Hình 6:.Chai
badcook………………………………………………………………………….37
Hình 7: Hệ thống micromanometre…………………………………………………………..70
Hình 8: Đồ thị đường chuẩn…………………………………………………………………74
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1: Bảng thực nghiệm của
luxisun………………………………………………….....19
Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu…………………………………………30
Bảng 3: Một số Vitamin và các phương pháp phân tích……………………………….....43
Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với các nồng độ và độ pha loãng khác nhau……….60
Bảng 5:Chuẩn bị ống nghiệm………………………………………………………………….......62
Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu……………………………………………………………65
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm…………………………………………………………………65
Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm…………………………………………………………………….66
Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì…………………………………………72
4

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

LỜI MỞ ĐẦU
Thực phẩm hay nói đơn giản đó là thức ăn, chủ yếu bao gồm các chất như:
carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), các vitamin, khoáng chất, và nước, mà
con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạp các chất
dinh dưỡng nhằm ni dưỡng cơ thể hay vì sở thích.
Tuy nhiên, các chất trong thực phẩm dễ bị chuyển hóa bởi nhiều yếu tố khác nhau
trong q trình chế biến và bảo quản. Một trong những yếu tố đó là enzyme.Do phản ứng
enzyme mà chất lượng của các nguyên liệu trong quá trình chế biến và bảo quản tăng lên,
hoặc giảm sút.Các biện pháp công nghệ trong sản xuất thực phẩm hoặc là kìm hãm hoạt
độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cách tối đa.
Tất cả các thuộc tính lý, hố, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế đo
được, biểu diễn được dưới dạng các thông số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc và định lượng
các thành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chất lượng sản
phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới.Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa
học kỹ thuật, các phương pháp phân tích ngày càng phát triển hơn, hiện đại hơn và có độ
chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất lượng và quản lý sản xuất.
Yêu cầu đặt ra là phải xác định được hàm lượng các chất có trong thực phẩm,
cũng như hoạt độ xúc tác của enzyme trong sản xuất thực phẩm. Trên cơ sở biết được
hàm lượng của các nguyên liệu hay các chất có trong thực phẩm, người ta xác định được
giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm.Việc xác định được hoạt độ xúc tác của các
enzyme trong thực phẩm nhằm biết được các biến đổi diễn ra trong chế biến, từ đó có
những cách thức sản xuất cho phù hợp.
Hóa sinh thực phẩm là môn học quan trọng trong ngành thực phẩm, cung cấp cho
chúng ta những kiến thức cần thiết về cấu tạo cũng như sự chuyển hóa của các chất có
trong thực phẩm khi đi vào cơ thể.
5

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Ngày nay, có rất nhiều phương pháp phân tích trong hóa sinh thực phẩm. Trong bài
tiểu luận này, chúng em xin trình bày một số phương pháp phân tích phổ biến trong hóa
sinh thực phẩm.
Chúng em xin chân thành cảm ơn cơ Phan Minh Anh Thư đã giúp chúng em hồn thiện
bài báo cáo này. Vì kiến thức chun mơn chưa tốt nên trong q trình tìm hiểu khơng
tránh khỏi thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến cơ và các bạn.
PHẦN I: PROTEIN
Protein là polymer của các amino acid.
Protein có nhiều chức năng quan trọng
Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme).
Cấu trúc vật lý: phơ mát, bánh mì, các chất tạo bọt, tạo gel…
Các phương pháp xác định hàm lượng protein
1.
Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng
1. 1. Nguyên tắc:
Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H 2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy
hóa. Carbon và hydro tham gia tạo thành CO2 và H2O. Còn nitơ sau khi được giải phóng
ra dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tan trong dung dịch. Đuổi
NH3 khỏi dung dịch bằng dung dịch NaOH, đồng thời cất và thu NH 3 bằng một lượng dư
H2SO4 0.1N. Định lượng H2SO4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó ta
tính được lượng nitơ có trong mẫu ngun liệu cần phân tích.
1.2. Quy trình thực hiện
Vơ cơ hóa mẫu

Q trình này được tiến hành hồn tồn trong tủ Hotte.Mẫu được cho vào bình
Kjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay ít chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g,
mẫu lỏng lấy từ 2 đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL). Thêm vào từ từ 10mL
H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh quá trình vơ cơ hóa (đốt cháy) cần phải cho
thêm chất xúc tác. Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng 0.5g hỗn hợp
CuSO4 :K2SO4 (1:3). Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sơi, làm tăng vận tốc q
trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO 4, giải phóng oxy cho phản
ứng oxy hóa.Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉ đun
6

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch. Lưu ý: nếu q trình vơ cơ hóa
được thực hiện đơn giản bằng cách đun trực tiếp bình Kjendahl trên bếp điện thì trong quá
trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho khơng cịn một vết đen nào của
mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho tới khi
dung dịch trong bình hồn tồn trắng.
Hướng dẫn sử dụng bộ vơ cơ hóa mẫu
- Bật cơng tắc (1) và gia nhiệt trước khoảng 5 phút.
- Mang găng tay bảo hộ và nhẹ nhàng lắp bộ giữ (2) chứa các bình vơ cơ hóa mẫu (4)
vào.
- Cho dung dịch mẫu và chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vơ cơ hóa mẫu.
- Đóng chặt hệ thống bằng bộ Gaskets.
- Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun.
Sau khi vơ cơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt.Cần làm nguội trước khi

lắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit. 4
Cất đạm
Chuẩn bị máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vịi nước làm lạnh, chờ đến khi màn hình
hiện lên thì máy đã sẵn sàng làm việc. Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2SO4, lắp vào máy.
Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sục hơi: 50%,
thể tích NaOH 40%: 5 – 10mL, thời gian cất: 15 – 30 phút).
Tiến hành: Chuyển tồn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vơ cơ hóa xong ở bình Kjeldahl vào
bình định mức 100, thêm nước cho đến vạch định mức. Lưu ý acid H 2SO4 đậm đặc rất háo
nước và tỏa nhiệt mạnh khi tiếp xúc với nước nên có thể làm bay hơi một phần.Vì vậy,
cần làm nguội và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ ra erlen.
Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống,
chú ý khơng lắp lệch, khí sẽ thốt ra ngồi, mất mẫu.
Tiến hành cất đạm trên máy cho đến khi NH3 được giải phóng hồn tồn khỏi bình
Kjendahl.
7

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Định phân
Lấy erlen ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống.Cho 10 giọt
phenolphtalein vào bình và định phân bằng NaOH 0.1N.
Xác định hệ số hiệu chỉnh K: Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu
muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó
hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
Thủ tục hiệu chỉnh như sau:

- Gọi K là tỷ số giữa nồng độ thực tế (Ct) và nồng độ cần pha (Cp) của NaOH.
- Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân bằng V (mL) NaOH 0.1N đã pha
sẵn.Thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K.
1.3. Tính kết quả:
Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có trong mẫu:

N

=

(a−bK ).0,00
14 .V .100
v .m

Trong đó:
N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng
a – số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3
b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ
m – khối lượng mẫu đem vơ cơ hóa, g
V – tổng thể tích định mức dung dịch vơ cơ hóa (100mL)
v – thể tích dung dịch vơ cơ hóa dùng chưng cất (10 mL)
0.0014 – lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H2SO4 0.1N
K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N

8


TIEU LUAN MOI download :

Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

% Protein = % Nitrogen × 6,25(Phần lớp Protein chứa 16% N => hệ số 6,25
(100/16=6,25))
Ưu điểm của phương pháp
•
•
•

Ứng dụng cho tất cả các loại thực phẩm
Đơn giản, chi phí thấp
Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thơ (AOAC

945.01)
Nhược điểm của phương pháp
• Khơng phải tất cả N là protein, ngồi ra có thể xác định cả: Purine, Pyrimidine
DNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có > 50% N phi protein, Melamine
(6N/phân tử).
• Chỉ xác định được hàm lượng N tổng, không xác định được chính xác hàm
lượng N protein
• Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu.
2.
Phương pháp biuret
2.1 Nguyên tắc
Biuret và peptide phản ứng với Cu 2+ tạo thành một phức hợp có màu tím hấp thụ ánh
sáng bước sóng 540nm.(Biuret là một hợp chất ngưng tụ của urea sau khi bị đốt nóng).
Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu.
Cách pha thuốc thử Biuret

Thuốc thử biuret được pha từ 3 dung dịch thuốc thử là dung dịch A, B và C. Các dung
dịch này được chuẩn bị như sau:
-

Dung dịch A: 05g CuSO4. 5H2O hòa tan trong 495 mL nước ( dung dịch CuSO4.

5H2O 1%)
-

Dung dịch B: 10g NaKC4H4O6.4 H2O hòa tan trong 490 mL nước ( dung dịch

NaKC4H4O6.4 H2O 2%)
-

Dung dịch C: 20,5g Na2CO3 và 4g NaOH hòa tan và định mức thành 1 lít dung dịch

(dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N).
9

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Thuốc thử biuret = 1 mL dung dịch A + 1 mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C

Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH3
Amino acid đơn và dipeptide không phản ứng

Vùng nồng độ tuyến tính là 1-5 mg/ml
Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin).
2.2 Quy trình thực hiện
Dựng đường chuẩn
Pha 5 dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò ứng với 5 nồng độ khác nhau 2, 4, 6,
8 và 10 (mg protein/ mL).Lấy 1 mL từng dung dịch protein chuẩn và 5 mL thuốc thử
biuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp được lắc đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp
sau đó được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm.
Vẽ đường chuẩn: trục hồnh là nồng độ protein, trục tung là độ hấp thu.

10

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Hình 2: Phương trình đường chuẩn
Xác định độ hấp thu mẫu thực phẩm
- Trích ly protein (nếu mẫu là mẫu rắn). Sau đó, ta tiến hành pha lỗng mẫu sao cho
nồng độ protein trong mẫu nằm trong khoảng 0 – 10 mg/mL.
- Lấy 1 mL dịch trích và 5 ml thuốc thử biuret cho vào ống nghiệm và lắc đảo trong 15
phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó, hỗn hợp được đem đi xác định độ hấp thu ở bước sóng
540 nm.
- Giá trị nồng độ protein trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn.
Ưu điểm
• Nhanh (khoảng 30 phút), đơn giản, màu sắc ít biến đổi hơn so với các phương
pháp Lowry, UV, có ít hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret,

không phát hiện N từ nguồn khơng phải peptide hoặc protein.
• Khơng sử dụng hó chất độc hại.
Nhược điểm
•
•
•
3.

Khơng nhạy bằng phương pháp Lowry.
Cần 2 – 4 mg protein cho một lần đo.
Các muối ammoni nồng độ cao có thể gây ảnh hưởng.
Phương pháp lowry
11

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

3.1 Nguyên tắc
Cu2+ trong môi trường kiềm sẽ tạo phức hợp với protein.Cu 2+ xúc tác oxy hóa nhóm
phenol trong tyrosine và tryptophan bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdicphosphotungstic acid) => tạo ra hỗn hợp có màu.

Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry
3.2 Quy trình thực hiện
Pha loãng mẫu (20 – 100 microgam protein)
Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na2CO3 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Phản ứng với CuSO4- KNa tartate-NaOH 10 ở nhiệt độ phịng.

Tiếp đó cho phản ứng với Folin 10 phút ở 500C.
Đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm.
Ưu điểm:
•
•

Tính chuyên biệt cao, nhanh và đơn giản (~1.5 giờ).
Rất nhạy: 20-100 µg.– 50-100 x so với Biuret, 10-20 x so với UV 280 nm

Nhược điểm
• Rất nhạy cảm với thay đổi pH.
• Màu dễ bị biến đổi bởi các loại protein khác nhau (nhiều hơn so với Biuret).
• Có nhiều hợp chất gây ảnh hưởng: sucrose, lipid, đường khử, hexoamine,
amino sulfate…
4.
Phương pháp Dumas
12

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

4.1. Nguyên tắc
Mẫu được đem đốt cháy ở 700- 10000C sau đó được phản ứng với đồng ở 6000C, xác
định hàm lượng protein bằng phương pháp sắc kí khí.
4.2. Cách tiến hành
Mẫu đem cân cho vào thiết bị rồi đốt cháy bằng Oxy tinh khiết (toàn bộ Nito trong

mẫu chuyển thành N2 và NxOy ) rồi dẫn qua ống có chứa Cu. NxOy phản ứng với Cu tạo ra
N2.Khí sinh ra chỉ cịn N2.Dẫn vào cột sắc ki khí để xác định hàm lượng Nito.
Ưu điểm:
•
•

Khơng sử dụng hóa chất độc hại.
Có thể xác định lượng protein trong mẫu trong vịng 3 phút, có thể tiến hành

một lúc 150 mẫu.
Nhược điểm:
•

Thiết bị mắc tiền
5.
Phương pháp nhuộm màu
5. 1. Nguyên tắc
Mẫu protein được trộn với một lượng dư biết trước chất nhuộm.Ở pH thấp, các nhóm
bazơ của protein mang điện tích (+) và gắn kết tuyến tính với điện tích (-) của chất nhuộm
tạo kết tủa.Phần chất nhuộm thừa sẽ được xác định bằng cách đo màu.

5.2 Quy trình:
•

Trộn protein, chất nhuộm, đệm pH 2
13

TIEU LUAN MOI download :

Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

•
•

EBOOKBKMT.COM

Lọc hoặc ly tâm
Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở 470 nm

Mật độ quang của chất nhuộm gắn kết protein ≈ nồng độ chất nhuộm ban đầu – nồng độ
chất nhuộm trong dịch lọc.

Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm
Các yếu tố ảnh hưởng đến nhuộm màu ion âm:
• Nhiệt độ
• Thành phần phi protein
• Hệ thống đệm
• Chất lượng protein
=> Phân tích protein trong sữa, bột mì, sản phẩm từ đậu nành, thịt….

14

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

PHẦN II PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE
Carbohydrate là hydrate của carbon như: C6(H2O)6, C12(H2O)11, C18(H2O)16, Polyhydroxy
aldehyde, ketones và các dẫn xuất.
• Monosaccharide (đường đơn): không thể phân hủy thành dạng đường đơn giản
hơn ở điều kiện thường.
• Oligosaccharide: thường 2-10 đường đơn.
• Polysaccharide: polymer của đường đơn.
Chức năng: Nguồn carbon và năng lượng.
Một số phương pháp định lượng carbohydrate:
1.
Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand
1. 1Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucoza, fructoza, mantoza...) khử oxit đồng
(2) thành oxit đồng 1 (Cu+2→Cu+1).Để định lượng đường khử dùng thuốc thử Fehling:
dung dịch sunfat đồng (Fehling I) và dung dịch muối xecnhet: muối kali-natri tartrate kép
(Fehlinh II) hoặc gọi là Fehling A và Fehling B, theo tỉ lệ 1:1. Khi trộn Fehling I và
Fehling II, đầu tiên tạo thành Cu(OH)2 có màu xanh da trời.

Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu + trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới
dạng Cu(OH)2. Muối phức này khơng bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehit hoặc
xeton dễ dàng khử Cu+2 thành Cu+ ra kết tủa oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ.

15

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Để định lượng oxit đồng I được tạo thành trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt 3 hoặc
sunfat kép sắt amon trong môi trường axit sunfuric, Cu + sẽ bị oxi hóa trở lại thành Cu+2 ,
cịn Fe+3 bị khử thành Fe+2.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + 2H2SO4 = 2 CuSO4 + FeSO4 + H2O
Tiếp đó lượng Fe+2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịch
KMnO4 chuẩn độ trong môi trường axit.
10FeSO4 + 2 KMnO4 + 8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 + H2O
Dựa vào lượng KMnO4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMnO 4 1/30N và
lượng đường khử (bảng 1) để dễ sử dụng.
Hóa chất
Thuốc thử Fehling
+ Fehling I: 40g CuSO4.5H2O/1 lít
+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g NaOH/ 1 lít
Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: 50g Fe2(SO4)3 + 200ml H2SO4 đậm đặc
(d = 1,4)/lit. Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni
86g (NH4)2SO4. Fe2(SO4)3.24H2O + 200g (108,7ml) H4SO4 d = 1,84/l
KMnO4 1/30N; 1,06g KMnO4/1 lít nước cất đun sơi. Nồng độ KMnO4 được xác
định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha.

16

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

1.2Cách tiến hành

Xử lí mẫu
Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng
để định lượng đường có khác đơi chút, nhưng ngun tắc chung như sau:
a. Trong trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin:
Có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước.Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạt
hay các mẫu thí nghiệm thực vật khơ như cây, lá hoặc quả khô...đã được nghiền nhỏ (và
sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 –
10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 - 80°C.
Chuyển tồn bộhổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít. Đun cách thủy 70 - 80°C trong
35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat [Pb(C 2H2O2)
2.3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO3)2] 10%.Tránh dùng quá dư chì axetat (dùng 2 - 5ml chì
axetat).Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hịa, để yên hỗn
17

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

hợp 10 phút.Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay
bình khơ.Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
b. Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc
Cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp
ống làm lạnh khơng khí.Trong trường hợp này khơng cần kết tủa protein bằng chì axetat
vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.
c. Trường hợp mẫu chứa nhiều protein
Kết tủa protein và các tạp chất dùng dung dịch tricloacetic 10 %, sau đó trung hịa bằng
dung dịch NaOH 5 % với chỉ thị metyl đỏ (màu đỏ chuyển sang màu vàng).Thêm nước

cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc.Nước qua lọc là dung dịch đường khử cần định
lượng.
d. Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ
Cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần.
Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose. Trước khi đun cách thủy hỗn
hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.
Tiến hành thí nghiệm
Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị (xem ở trên) được lấy 10 ml (0,8 – 40mg
đường) cho vào bình tam giác V 100ml, thêm 5ml Fehling I và 5 ml Fehling II. Đun sơi
hỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên. Sau khi đun sơi dung dịch vẫn
giữ màu xanh biếc đặc trưng.Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Fehling cho vào
khơng đủ.Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Fehling hoặc giảm lượng
mẫu.Để yên, lọc bằng phễu lọc đường (G-4) vào bình lọc chân khơng benzen.Rửa bình và
phễu lọc bằng nước cất nóng 3 – 4 lần. Chú ý giữ phần lớn lượng oxit đồng I nằm lại
trong bình tam giác và lớp oxit đồng trong bình và trên phễu ln được phủ một lớp nước
nóng để Cu2O khỏi bị oxi hóa bởi O2 của khơng khí. Hịa tan kết tủa của oxit đồng I vào
bình bunzen khác bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml) dung dịch sunfat sắt 3 trong môi
trường H2SO4 vào bình có chứa kết tủa Cu 2O và chuyển sang phễu lọc.Tráng cẩn thận
bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng. Nước tráng cũng thu vào bình. Định phân
dung dịch bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt không mất đi trong
20-30 giây.Biết lượng định phân, tra bảng suy ra lượng đường trong dung dịch thí
nghiệm. Làm thí nghiệm kiểm chứng song song thay dung dịch đường bằng nước cất.
18

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

1.3Tính kết quả
Hàm lượng đường khửtính theo phần trăm (%):

RS% = a. V .100
V

1. m.1000

Trong đó:
a: sốmg glucoza tra bảng ứng với sốml KMnO4 1/30N trừ đi sốml KMnO4 1/30N
của mẫu kiểm chứng;
V: dung tích bình định mức;
V1: lượng dung dịch mẫu thí nghiệm lấy để xác định đường khử (trong ví dụ trên
10ml)
m: lượng mẫu (g) nguyên liệu thực phẩm;
100: hệ sốchuyển đổi %;
1000: hệ số chuyển đổi sang mg
2.

Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

2. 1 Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm của đường khử (glucose, fructose,
mantose...) có thể khử dễ dàng đồng (II) thành oxit đồng (I) (Cu +2 →Cu+1) dưới dạng kết
tủa màu đỏ và qua lượng CuSO4 dư (khơng tham gia phản ứng) tính được lượng đường
khử.Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:
Khi trộn hai dung dịch Fehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa
chúng theo hai giai đoạn:
Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trời:

CuSO4 +2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịch màu
xanh thẫm:
19

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Muối trên là một hợp chất khơng bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc xeton
dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị
oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling:

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường
H2SO4 sẽ giải phóng ra iot tự do.
CuSO4 + 4KI + H2SO4

I2 + CuI2 + 2K2SO4

Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosunfat (Na 2S2O3) chuẩn, qua đó tính được
lượng đường khử có trong dung dịch.
I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 +2NaI
Hóa chất
Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO4.5H2O trong 500ml H2O
Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H2O
Dung dịch KI 30%, dung dịch H2SO4 25% , dung dịch Na2S2O3 0,1N.
2.2Tiến hành

Xử lí mẫu
Cách thực hiện tương tự phương pháp Bertrand
Tiến hành thí nghiệm
20

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50ml: 1ml dung dịch đường, 2ml nước cất, 1ml
dung dịch Fehling I và 1ml dung dịch Fehling II
Bước 2: Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sơi, dung
dịch vẫn cịn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa đồng I oxit màu đỏ gạch là
được. Nếu dung dịch mất màu hồn tồn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào
khơng đủ để oxi hóa hồn tồn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm. Trường
hợp đó phải làm lại thí nghiệm với dung dịch đường ít hơn hoặc pha lỗng dung dịch
đường.Ngược lại, nếu khơng có lớp kết tủa đồng I oxit thì phải tăng lượng dung dịch
đường, giảm nước cất (ln đảm bảo thể tích là 5ml).
Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1ml H 2SO4 25% và 1ml KI 30%, lắc đều
và giữ trong 20 phút.
Bước 4: Chuẩn độ I2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N. Song song làm thí nghiệm đối
chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất
2.3 Tính kết quả
Hàm lượng đường khử được tính theo cơng thức sau:

X

= (a−b) . f .
3,3. V .100 (%)
W.V1

Trong đó:
a:
b:

số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ đối chứng,
hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,

f: hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N
3,3: hệ số chuyển thành đường
V: tổng thể tích dịch chiết từng gam nguyên liệu (ml)
V1: thể tích thí nghiệm (ml)
W: khối lượng nguyên liệu (g)
100: hệ số chuyển thành %
21

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

3.

EBOOKBKMT.COM

Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid

Trong nhiều loại rau, củ, quả...các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khá lớn
saccarose cùng với đường khử.Saccarose không có tính khử nên khơng thể trực tiếp xác
định bằng phương pháp Bertrand.Để có thể xác định saccarose bằng phương pháp này
phải thủy phân saccarose thành đường khử (glucozo và fructozo).
3.1Nguyên tắc
Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử là
glucose và fructose.Định lượng đường khử tạo thành cho pháp tính được lượng saccarose
có trong mẫu thí nghiệm.
C12H22O11
(saccarose)

+

H2O

C6H12O6

+ C6H12O6

(glucose)

(fructose)

Hóa chất :
Dung dịch HCl 5%
Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa
Metyl đỏ 0,02% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất
Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo phương pháp Bertrand
3.2Tiến hành
• Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xác

định đường khử cho vào bình nón 250ml)
• Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%
• Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng khơng khí trong 30 – 40 phút,
làm nguội nhanh.
• Trung hịa hỗn hợp bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH 6,5 – 7,0 với chỉ
thị metyl đỏ(3 giọt)
• Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng
Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand
Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thểkết quả sẽ bị sai khác,
bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một số phần
22

TIEU LUAN MOI download :


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

EBOOKBKMT.COM

hay hồn tồn.Trong q trình thủy phân những chất này cũng tạo thành các
monosacarit.Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung dịch
đạt 75 – 80%.
3.3Tính kết quả
Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo cơng thức:
X = (a – b). 0,95
Trong đó:
X: hàm lượng saccarose tính theo %
a: hàm lượng đường khử theo glucose của dịch đường sau khi thủy phân bằng axit
(%)
b: hàm lượng đường khửcủa dung dịch đường (trước khi thủy phân)

(%) 0,95: hệ số chuyển từ glucose sang saccarose.
4.
Phương pháp định lượng saccarose
4.1Nguyên tắc
Làm trong dung dịch trước khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có góc quay
cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo. Các chất làm trong thường
sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH 3COO)2.3H2O và axetat chì kiềm tính
2Pb(CH3COO)2.Pb(OH)2 ở dạng bột hoặc dung dịch. Axetat chì lắng hàng loạt các chất
như axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màu
melanoidin...
Chú ý: khơng dùng q lượng axetat chì vì một số kết tủa có khả năng hịa tan khi dư
axetat chì như các protein. Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp gồm
hai dung dịch Pb(NO3)2 và NaOH. 340 g Pb(NO3)2 /1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượng bằng
nhau (5-10 ml). Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.Chú ý: Lượng chì dư trong
dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH 2PO4 hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc. Thước
đo độ đường: theo quy định thước đo độ đường trong kế chỉ 100°S khi ta hòa tan 26g
đường saccaroza tinh khiết trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200 mm ở 20°C.
26 g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn. Khi cân mẫu với
lượng cân chuẩn và phân cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước đo cho ta biết %
23

TIEU LUAN MOI download :