Xác định một số trình tự ADN mã vạch của loài Đinh mật (Fernandoa brilletii) tại tỉnh Thái Nguyên

Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
[

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH CỦA LỒI ĐINH MẬT
(Fernandoa brilletii ) TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN
Hà Bích Hồng1, Nguyễn Thế Hưởng1, Vũ Phạm Thảo Vy2, Vũ Văn Thông3
1

Trường Đại học Lâm nghiệp
Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên
3
Công ty TNHH Phát triển nơng nghiệp Vy Anh
2

/>
TĨM TẮT
Đinh mật (Fernandoa brilletii (Dop) Steen) là lồi cây đặc hữu và có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam. Đây là lồi
cây đang có nguy cơ tuyệt chủng cao ngồi tự nhiên nhưng đến nay chưa có nghiên cứu đánh giá đầy đủ nhằm
bảo tồn và phát triển loài cây này. Do đó, những nghiên cứu phục vụ cơng tác đánh giá đa dạng di truyền là rất
cần thiết để kiến nghị và đưa ra biện pháp bảo tồn nguồn gen đối với lồi Đinh mật trên cả nước nói chung và
trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên nói riêng. Hiện nay, ADN mã vạch đã được sử dụng như những chỉ thị phân tử có
độ chính xác cao trong việc định danh loài và đánh giá đa dạng di truyền. Ở thực vật, các trình tự ADN được sử
dụng làm mã vạch trong giám định hay phân loại thường là các trình tự nucleotide thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen
nhân, bao gồm cả vùng mã hóa và vùng khơng mã hóa. Trong nghiên cứu này, ba chỉ thị ADN mã vạch là matK,
trnH-psbA và ITS được sử dụng để nghiên cứu bước đầu về ADN mã vạch cho loài Đinh mật phân bố tại tỉnh
Thái Nguyên. Hiệu quả nhân bản bằng PCR và giải trình tự nucleotide của ba chỉ thị ADN mã vạch ở loài Đinh
mật đều đạt 100%. Trong đó, trình tự nucleotide của đoạn gen matK và trnH-psbA của tất cả các mẫu Đinh mật
tại 5 huyện của tỉnh Thái Nguyên có sự tương đồng tuyệt đối. Trong 848 nucleotide của vùng gen ITS đã xác
định được hai vị trí nucleotide sai khác giữa các mẫu Đinh mật nghiên cứu. Các trình tự matK, trnH-psbA và ITS
của lồi Đinh mật được đăng ký thành cơng trên Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank) với các mã số lần lượt là
ON603621, ON603622, ON614190, ON614191. Cở sở dữ liệu về ADN mã vạch thế giới cũng như Ngân hàng

gen Quốc tế chưa cơng bố trình tự ADN mã vạch nào của lồi Đinh mật. Do đó, nghiên cứu này là nghiên cứu
đầu tiên về xác định các trình tự ADN mã vạch cho loài cây gỗ quý và đặc hữu này, góp phần làm phong phú
thêm cơ sở dữ liệu về ADN mã vạch cho hệ thống ADN mã vạch của thực vật.
Từ khóa: ADN mã vạch, Đinh mật, ITS, matK, trnH-psbA.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đinh mật (Fernandoa brilletii (Dop) Steen)
là lồi cây đặc hữu tại Việt Nam có giá trị kinh
tế cao, thân gỗ dùng trong xây dựng, đóng đồ
dùng nội thất cao cấp do có vân gỗ đẹp và chất
lượng gỗ vô cùng tốt. Cây gỗ lớn, cao 25 - 30
m, đường kính có thể tới 50 - 100 cm. Vỏ mầu
xám tro bong mảng, có nhiều lớp mỏng, lớp
trong nâu vàng. Phân cành thấp. Cành non hơi
vuông cạnh phủ lông nâu vàng. Lá kép lông
chim 1 lần lẻ mọc đối, dài 40 – 45 cm. Lá chét
hình trái xoan hay trứng trái xoan, đầu có mũi
nhọn, đi gần tròn, dài 10 – 13 cm, rộng 5 – 6
cm, mặt dưới có lơng mịn và tuyến nhỏ ở gốc,
gân bên nổi rõ ở mặt dưới, gân nhỏ gần song
song. Cuống lá chét ngắn. Hoa tự xim viên chuỳ
ở đầu cành. Hoa to, thưa, lưỡng tính, khơng đều.
Đài hình chuông, tràng hợp gốc, màu trắng hay
trắng vàng tạo thành 2 mơi. Nhị 5 có 2 nhị dài,
bầu 2 ơ. Quả nang hình trụ dài khoảng 40 cm,
rộng 4 cm, đầu quả nhọn. Vỏ quả hố gỗ khi
chín tách ơ. Hạt dẹt nhẵn bóng, có cánh màu
trắng, xếp thành 2 hàng trong mỗi ô. Cây mọc
30

chậm, mùa hoa tháng 9 – 11. Mọc rải rác trong
rừng kín lá rộng thường xanh ở các tỉnh miền
Bắc. Hiện nay, ADN mã vạch đã được chứng
minh là những chỉ thị phân tử có độ chính xác
cao trong việc định danh lồi và đánh giá đa
dạng di truyền. Đặc điểm quan trọng nhất của
ADN mã vạch là phải phổ biến và đặc hiệu trong
các biến dị và dễ dàng sử dụng. Ở thực vật, các
đoạn ADN mã vạch có thể là những đoạn ADN
nằm trong hệ gen nhân (28S rDNA, ITS…)
(Baharum, 2012; Chen, 2010; Schoch et al.,
2012) hoặc hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH –
psbA, rpo, trnL-trnF, ycf...) (Yu et al., 2011;
Hollingsworth, 2011). Ba mã vạch ADN (rbcL,
matK, trnH-psbA) được sử dụng để đánh giá sự
đa dạng của các loài cây trong rừng mưa nhiệt
đới tại Queensland, Úc và kết luận rằng ADN
mã vạch là một trợ giúp đáng kể trong đánh giá
đa dạng sinh học và xác định các quần thể cây
ngay cả khi chúng không thể phân biệt được tất
cả các lồi bằng phương pháp hình thái (Costion
et al., 2011). ADN mã vạch được sử dụng để
giải quyết vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học theo

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
hai cách sau: (1) Là một phương tiện giám sát
đa dạng sinh học chính xác và nhanh chóng cả

trước và sau các hành động bảo tồn, (2) Cung
cấp dữ liệu để hỗ trợ trong việc ước tính sự đa
dạng phát sinh lồi để thiết lập các ưu tiên bảo
tồn (Krishnamurthy & Francis, 2012). Đinh mật
là lồi cây có nguy cơ tuyệt chủng cao ngoài tự
nhiên nhưng đến nay vẫn chưa được đưa vào
sách Đỏ Việt Nam và Nghị định 06/2019 về
quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp,
quý, hiếm và thực thi cơng ước về bn bán
quốc tế các lồi động vật, thực vật hoang dã
nguy cấp. Tại Thái Nguyên, Đinh mật cịn lại rất
ít, phân bố rải rác ở các vườn rừng, các diện tích

rừng tự nhiên tại các huyện Võ Nhai, Đồng Hỷ,
Định Hóa, Phú Lương và Đại Từ. Do đó, những
nghiên cứu phục vụ cơng tác định danh và đánh
giá đa dạng di truyền là rất cần thiết để kiến nghị
và đưa ra biện pháp bảo tồn nguồn gen đối với
lồi Đinh mật trên cả nước nói chung và trên địa
bàn tỉnh Thái Nguyên nói riêng. Cho đến nay,
chưa có nghiên cứu nào phân tích ADN của lồi
Đinh mật, hiện trên ngân hàng gen quốc tế mới
chỉ có một số ít trình tự ADN mã vạch của một
số loài trong chi Fernandoa như: F. coccinea,
F. macrantha, F. bracteata, F. serrata, F.
magnifica, và F. adolfi-friderici.

[[

Hình 1. Cây Đinh mật tại Vũ Chấn, huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Lựa chọn mẫu và cách lấy mẫu
Lá của 15 cây Đinh mật được thu thập từ 05
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

huyện của tỉnh Thái Nguyên. Các mẫu được kí
hiệu như trên Bảng 1.

Bảng 1. Địa điểm và thời gian thu thập các mẫu Đinh mật tại Thái Nguyên
Tọa độ
Ký hiệu
Thời gian
Địa điểm thu nhận mẫu
mẫu

thu mẫu
Kinh độ
Vĩ độ
DH 01
Định Hóa - Thái Nguyên
4/2022
2432139
565781
DH 02
Định Hóa - Thái Nguyên
4/2022
2432146
565781
565789
DH 03
Định Hóa - Thái Nguyên
4/2022
2432158
DHY 01
Đồng Hỷ - Thái Nguyên
4/2022
2415195
0587737
DHY 02
Đồng Hỷ - Thái Nguyên
4/2022
2415707
0588155
DHY 03
Đồng Hỷ - Thái Nguyên

4/2022
2415106
0587542
Phú Lương - Thái Nguyên
PL 01
4/2022
2410434
0579768
PL 02
Phú Lương - Thái Nguyên
4/2022
2408229
0579011
PL 03
Phú Lương - Thái Nguyên
4/2022
2410841
0579392
VN 01
Võ Nhai - Thái Nguyên
4/2022
2420007
0604997
0604979
VN 02
Võ Nhai - Thái Nguyên
4/2022
2419938
VN 03
Võ Nhai - Thái Nguyên

4/2022
2419964
0605034
DT 01
Đại Từ - Thái Nguyên
4/2022
2377435
568815
DT 02
Đại Từ - Thái Nguyên
4/2022
2375015
568216
572578
DT 03
Đại Từ - Thái Ngun
4/2022
2374222

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022

31


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
[

Yêu cầu về mẫu lá và cách bảo quản: cắt
những lá bánh tẻ, xanh và khơng bị sâu bệnh.
Sau đó bảo quản mẫu lá trong túi nilon có chứa

hạt hút ẩm silica gel, vận chuyển về phịng thí
nghiệm ngay trong ngày. Các mẫu lá được bảo
quản trong tủ lạnh -20oC cho đến khi được sử
dụng để tách chiết ADN tổng số.
2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số được tách chiết từ mẫu lá Đinh
mật theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit tách
chiết ADN thực vật “DNA mini kit Qiagen” của
hãng Qiagen, CHLB Đức. Các mẫu ADN tổng
số sau khi tách chiết được đánh giá nồng độ và
độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ hấp phụ
ScanDrop (Analytik Jena, Germany) và bảo
quản ở nhiệt độ -20oC.
2.3. Phương pháp khuyếch đại PCR và xác
định trình tự nucleotide

Gen

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy
Biometra Tadvanced PCR Systems 96S
(Germany) với thành phần bao gồm: 10l PCR
master mix 2X, 1l mồi xuôi (10M ) và 1l
mồi ngược (10M), 1l ADN khuôn (50 ng),
bổ sung H2O deion tới 20l. Chương trình nhiệt
độ của phản ứng PCR như sau: biến tính ở 95oC
trong 5 phút; 35 chu kì lặp lại của ba bước 95oC
– 30 giây, 51oC - 60oC (tùy mồi) – 30 giây, 72oC
– 1 phút; kết thúc tổng hợp ở 72oC trong 5 phút;
bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. Tên mồi, trình
tự nucleotide các mồi ADN mã vạch và nhiệt độ

gắn mồi của các mồi sử dụng trong nghiên cứu
được thể hiện ở Bảng 2.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose
1,0% có bổ sung thuốc nhuộm axit nucleic
(Redsafe). Sau khi điện di, bản gel agarose được
soi dưới đèn UV và chụp ảnh.

matK_F

Bảng 2. Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi
Kích
Ta
Trình tự mồi (5’ - 3’)
thước
(OC)
đoạn gen
ACCCAGTCCATCTGGAAATCTGGTTC

matK_R

CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG

trnH_F
psbA_R
ITS_F

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG

ITS_R

TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC

Kí hiệu
mồi

matK
trnHpsbA
ITS

Những sản phẩm PCR sau khi khuếch đại
thành công sẽ được tinh sạch sử dụng bộ kit
Prification Kit của hãng InTRON – Hàn Quốc.
Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được gửi
cho phịng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để
giải trình tự nucleotide theo cả hai chiều xi và
ngược. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được
xác định bằng máy giải trình tự tự động dựa trên
nguyên lý của Sanger, sử dụng bộ Kit BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.4. Phương pháp phân tích dữ liệu ADN mã
vạch
Các trình tự nucleotide được phân tích và xử
lý bằng phần mềm tin sinh BioEdit 7.2.5 (Hall,
1999), Mega7 (Kumar et al., 2016), và các công
cụ trên NCBI ().
32

52

850

51

460

60

900

Tham
khảo
Kress and
Erickson,
2007
Sang et
al., 1997
Wen and
Zimmer,
1996

Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên
phương pháp Maximum likelihood, với số lần
lặp là 1000.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số
Sử dụng bộ kit tách chiết ADN thực vật của
Qiagen-Đức để tách chiết ADN tổng số từ 15
mẫu lá Đinh mật. Kết quả tách chiết ADN tổng

số được đo trên máy Scandrop với nồng độ thấp
(dao động từ 14,99 đến 29,25 ng/µl) nhưng độ
tinh sạch tương đối tốt (tỉ số A260/A280 chỉ đạt
từ 1,57 – 1,83). Chi tiết về hàm lượng ADN tổng
số và độ tinh sạch của từng mẫu được thể hiện
ở bảng 3. Với kết quả tách chiết ADN tổng số
này chúng tôi tiến hành thử nghiệm các nồng độ
ADN khuôn phù hợp cho phản ứng PCR thơng

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
qua cặp mồi matK_F/R thì tất cả các mẫu ADN
tổng số đều xuất hiện sản phẩm PCR đặc hiệu
với kích thước khoảng 850 bp ở nồng độ ADN
tổng số là 30 ng đến 50 ng trong một phản ứng
PCR. Đoạn gen nhân bản thể hiện trên gel

agarose 1,0% là một băng rõ, sắc nét và khơng
có sản phẩm phụ. Từ kết quả thử nghiệm PCR
này, chúng tôi khẳng định đã tách chiết được
ADN tổng số từ các mẫu lá Đinh mật sử dụng
bộ kit tách chiết ADN thực vật của Qiagen-Đức.

Bảng 3. Hàm lượng và độ tinh sạch của 15 mẫu ADN tổng số tách chiết từ lá loài Đinh mật
Địa điểm lấy mẫu
Độ tinh sạch của
Hàm lượng ADN
STT

Mẫu
ADN (OD
(ng/µl)
1
ĐH1
1,77
24,52
2
Định Hóa
ĐH2
1,65
27,50
3
ĐH3
1,59
21,30
4
ĐHY1
1,57
17,11
5
Đồng Hỷ
ĐHY2
1,65
20,50
6
ĐHY3
1,78
22,03
7

PL1
1,57
14,99
8
Phú Lương
PL2
1,76
18,90
9
PL3
1,83
27,50
10
VN1
1,83
29,25
11
Võ Nhai
VN2
1,74
19,50
12
VN3
1,78
22,68
13
ĐT1
1,73
27,15
14

Đại Từ
ĐT2
1,71
22,76
15
ĐT3
1,61
22,12

3.2. Kết quả nhân gen với các đoạn ADN mã
vạch bằng kĩ thuật PCR
15 mẫu ADN tổng số được tách chiết từ lá
của 15 cây Đinh mật được sử dụng làm khuôn
để nhân bản đoạn gen matK, trnH-psbA, và ITS
bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu như
ở Bảng 2.
Gen matK là trình tự gen nằm trong lục lạp
có thể nhân bản một cách dễ dàng ở nhiều lồi
thực vật. Trình tự gen matK đã được sử dụng
rộng rãi để xây dựng mối quan hệ các hệ sinh
thái giữa các lồi có liên quan chặt chẽ hoặc để
định danh các loài thực vật. Cặp mồi sử dụng là
matK_F và matK_R để nhân bản đoạn gen
matK. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel
agarose 1% cho thấy gen matK được khuếch
đại thành công ở tất cả các mẫu Đinh mật
nghiên cứu, các băng thu được sáng đều với
kích thước tương tự nhau khoảng 850 bp (khi
so sánh với thang ADN chuẩn 100 bp), khơng
có băng phụ xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên

cứu (Hình 2A).
Vùng xen trnH-psbA là một trong những
vùng biến đổi nhất trong bộ gen của lục lạp ở

các lồi hạt kín. Nó là một công cụ phổ biến để
nghiên cứu di truyền quần thể thực vật và phát
sinh ở cấp loài và đã được đề xuất là phù hợp
cho các nghiên cứu mã vạch DNA. Cặp mồi
trnH_F và psbA_R được thiết kế để nhân bản
đoạn gen trnH-psbA trên nhiều đối tượng thực
vật khác nhau. Kết quả kiểm tra sản phẩm nhân
bản đoạn gen trnH-psbA bằng phương pháp
điện di trên gel agarose 1,0% cho thấy đoạn gen
trnH-psbA được khuếch đại thành công ở tất cả
15 mẫu Đinh mật nghiên cứu. Hình 2B là kết
quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen
trnH-psbA ở 15 mẫu Đinh mật tại tỉnh Thái
Nguyên, các băng ADN được nhân bản đặc hiệu
với một băng duy nhất, sáng rõ. Sản phẩm PCR
nhân bản đoạn gen trnH-psbA sẽ được tinh sạch
và xác định trình tự nucleotide.
Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các
đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN
mã hóa ribosome 18S, 5, 8S, 28S và xen giữa
các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của
vùng 5,8S. Vùng ITS (bao gồm ITS1 và ITS2)
vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022

33


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
[

hợp để phân biệt các loài gần gũi. Kết quả nhân
bản đoạn gen ITS ở 15 mẫu Đinh mật tại tỉnh
Thái Nguyên được thể hiện trên hình 2C.
Đoạn gen ITS khuếch đại thành công ở tất cả các

mẫu Đinh mật. Các mẫu đều xuất hiện một
băng ADN sáng rõ nét, kích thước khoảng trên
800 bp phù hợp với kích thước lý thuyết của
đoạn gen ITS dự kiến nhân bản.

Hình 2. Kết quả nhân bản 03 đoạn trình tự ADN mã vạch của 15 mẫu Đinh mật tại Thái Nguyên
(A): Trình tự matK, (B): Trình tự trnH-psbA, (C): Trình tự ITS. Giếng 1-3: mẫu DH 01-DH 03; Giếng 46: DHY 01- DHY 03; Giếng 7-9: PL 01 – PL 03; Giếng 10-12: VN 01 – VN 03; Giếng 13-15: DT 01- DT
03; M: Thang đo (marker) ADN 100 bp

3.3. Phân tích trình tự nucleotide các đoạn
ADN mã vạch
Các sản phẩm PCR đều được tinh sạch bằng
bộ kit PCR Purification Kit của InTRON – Hàn
Quốc theo hướng dẫn của nhà sản xuất và trình

tự nucleotide của các đoạn gen được xác định
bởi công ty 1st BASE - Malaysia.
3.3.1. Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen

matK

Hình 3. Cây quan hệ di truyền của loài Đinh mật tại Thái Nguyên với 04 loài trong chi Fernandoa
dựa trên trình tự nucleotide matK

Sau khi xác định trình tự nucleotide bằng
phương pháp tự động và xử lý trình tự bằng
phần mềm BioEdit, chúng tơi thu được đoạn gen
matK với kích thước 839 bp với các đỉnh peak
rõ ràng. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK
34

là giống nhau 100% ở tất cả các mẫu Đinh mật
nghiên cứu và được đăng ký lên GenBank với
mã số ON603621. Trên Ngân hàng gen Quốc tế
chưa cơng bố trình tự nucleotide của lồi Đinh
mật nên đây là cơng bố đầu tiên về lồi này.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Trên Ngân hàng gen Quốc tế hiện có 04 trình tự
nucleotide đoạn gen matK của 4 lồi thuộc chi
Fernandoa, đó là: F. bracteata (LC129162.1),
F. serrata (LC129167.1), F. adolfi-friderici
(MN370400.1), và F. magnifica (JX517318.1).
Cây quan hệ di truyền giữa loài Đinh mật tại
Thái Nguyên với 04 lồi thuộc chi Fernandoa
được thể hiện trên Hình 3. Mẫu DH 01 đại diện

cho tất cả 15 mẫu Đinh mật nghiên cứu và có
mức độ tương đồng 100% với lồi F. bracteata
(LC129162.1), ba lồi cịn lại của chi
Fernandoa được nhóm thành một nhóm và cũng
tương đối gần với lồi Đinh mật nghiên cứu.
Loài Dolichandrone spathacea là một loài
thuộc cùng họ Bignoniaceae với loài Đinh mật
được sử dụng như một lồi ngồi nhóm
(outgroup) để thể hiện mối quan hệ di truyền
gần giữa các lồi trong chi Fernandoa.
3.3.2. Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen
trnH-psbA
Trình tự nucleotide của đoạn gen trnH-psbA
tương đồng 100% giữa các mẫu Đinh mật
nghiên cứu và được đăng ký lên GenBank với
mã số ON603622. Trình tự nucleotide của đoạn

gen trnH-psbA của tất cả 15 mẫu Đinh mật
nghiên cứu có chiều dài 399 bp.
Trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa cơng bố
trình tự nucleotide nào của lồi Đinh mật
(Fernandoa brilletii) nhưng một cơ sở dữ liệu
ADN của Việt Nam (VNDNABANK) đã cơng
bố một trình tự trnH-psbA của lồi này ở
Thượng Tiến, Hịa Bình với kích thước 394 bp
(Hà Văn Huân, 2015). So sánh trình tự trnHpsbA của các mẫu Đinh mật tại Thái Nguyên
với trình tự mẫu Đinh mật tại Hịa Bình cho thấy
sự tương đồng là 100%. Cây quan hệ di truyền
của loài Đinh mật tại Thái Ngun với một số
lồi trong chi Fernandoa đã cơng bố trên Ngân

hàng gen Quốc tế được thể hiện trên Hình 4.
Trong đó, các mẫu Đinh mật tại Thái Nguyên
mà đại diện là mẫu DH 01 tương đồng 100% với
loài F. brilletii có mã số BF0003 trên Ngân hàng
ADN Việt Nam và cả hai đều được nhóm chung
với ba lồi thuộc chi Fernandoa có trên Ngân
hàng gen Quốc tế. Kết quả này cho thấy các mẫu
Đinh mật tại Thái Nguyên chính là loài F.
brilletii khi so sánh với cơ sở dữ liệu ADN của
Việt Nam.

Hình 4. Cây quan hệ di truyền của loài Đinh mật tại Thái Nguyên với các loài thuộc chi Fernandoa
dựa trên trình tự nucleotide trnH-psbA

3.3.3. Phân tích trình tự nucleotide đoạn ITS
Trình tự nucleotide của đoạn ITS ở các mẫu
Đinh mật có chiều dài 848 bp và có một số vị trí
nucleotide sai khác giữa các mẫu Đinh mật. Cụ
thể, sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn

ITS đã được phân thành hai nhóm trình tự với
mã số trên GenBank tương ứng là ON614190 và
ON614191. Hai trình tự ITS khác nhau tại hai vị
trí nucleotide là vị trí nucleotide số 150 và 245
(Hình 5). Cụ thể trình tự có mã số ON614190

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022

35

Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
[

bao gồm các mẫu Đinh mật tại Định Hóa, Phú
Lương, Đồng Hỷ và Võ Nhai (đại diện là mẫu
DH 01), cịn trình tự có mã số ON614191 bao
gồm các mẫu Đinh mật tại Đại Từ (đại diện là
mẫu DT 03).
Mối quan hệ di truyền của các mẫu Đinh mật
tại Thái Nguyên với một số lồi thuộc chi
Fernandoa dựa trên trình tự ITS được thể hiện
trên Hình 6. Trong đó, mẫu DH 01 và DT 03 có
khoảng cách di truyền rất nhỏ (0,007) và cùng
nằm trong một nhóm với các lồi của chi

Fernandoa hiện có trên Ngân hàng gen. Các
mẫu Đinh mật nghiên cứu có quan hệ tương đối
gần
với
lồi
Fernandoa
coccinea
(KU203434.1). Lồi Fernandoa macrantha
(KU203435.1) và Fernandoa sp. (KU203433.1)
nhóm thành một nhóm có quan hệ gần với nhóm
lồi Đinh mật nghiên cứu. Lồi Dolichandrone
spathacea là một lồi thuộc cùng họ
Bignoniaceae với loài Đinh mật được sử dụng
như một lồi ngồi nhóm (outgroup).

Hình 5. Trình tự nucleotide của đoạn ITS có mã số ON614190 và ON614191 của cây
Đinh mật tại Thái Ngun

36

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022


Cơng nghệ sinh học & Giống cây trồng

Hình 6. Cây quan hệ di truyền của loài Đinh mật tại Thái Ngun và một số lồi trong chi Fernandoa
dựa trên trình tự nucleotide ITS

Đặc điểm ADN mã vạch của loài Đinh mật tại
tỉnh Thái Nguyên
Gen matK của loài Đinh mật trong nghiên
cứu này được nhân bản có kích thước gần 900
bp và có trình tự nucleotide tương đồng 100% ở
tất cả 15 mẫu. Gen matK là một gen chức năng,
tổng hợp enzyme maturase K, do vậy thường
khơng có các đột biến thêm hay bớt nucleotide
xảy ra trong gen, nên kích thước cũng như trình
tự nucleotide của gen này tương đối ổn định.
Trình tự matK của lồi Đinh mật tại Thái
Ngun tương đồng 100% với một loài khác
cùng chi là F. bracteata, do đó có thể thấy khả
năng phân biệt lồi trong chi Fernandoa dựa
trên trình tự matK khơng được tốt.
Trình tự trnH-psbA là trình tự khơng mã hóa

và biến đổi nhiều nên việc kết hợp với một trình
tự mã hóa và bảo thủ như rbcL sẽ làm giảm bớt
những sai sót (Kress & Erickson, 2007). Tuy
nhiên, trong nghiên cứu này, trình tự trnH-psbA
của tất cả 15 mẫu Đinh mật nghiên cứu đều
tương đồng 100% và cũng tương đồng 100%
với loài F. brilletii tại Thượng Tiến, Hịa Bình.
Kết quả này cho thấy trình tự trnH-psbA là rất
bảo thủ trong lồi. Điều này có khác so với kết
quả của dự án “Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu ADN
mã vạch phục vụ công tác quản lý giống cây lâm
nghiệp đã được công nhận là giống Quốc gia”
do Hà Văn Huân chủ nhiệm đã khẳng định đoạn

trình tự trnH-psbA là trình tự hiệu quả nhất
trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức dưới
loài (Hà Văn Huân, 2015).
Trình tự ITS cũng là một trình tự khơng mã
hóa và có thể có sự biến đổi về một vài vị trí
nucleotide trong cùng một lồi. Đối với lồi
Đinh mật tại Thái Ngun, trình tự ITS cho thấy
hai biến thể với sự khác nhau tại hai vị trí
nucleotide. Trong đó, một biến thể bao gồm các
mẫu của 4 huyện Định Hóa, Đồng Hỷ, Phú
Lương và Võ Nhai, còn một biến thể bao gồm
các mẫu của huyện Đại Từ. Qua đó cho thấy đối
với lồi Đinh mật thì trình tự ITS có thể sử dụng
để đánh giá sự đa dạng bên trong lồi tốt hơn so
với trình tự matK và trnH-psbA.
4. KẾT LUẬN

Đã xác định được 03 trình tự ADN mã vạch
là trình tự matK (mã GenBank: ON603621),
trnH-psbA (ON603622) và ITS (ON614190,
ON614191) cho loài Đinh mật (Fernandoa
brilletii) phân bố tại tỉnh Thái Nguyên.
Cả ba chỉ thị ADN mã vạch (matK, trnHpsbA, ITS) đều thể hiện mức độ tương đồng cao
về trình tự nucleotide với các lồi thuộc chi
Fernandoa hiện có trên Ngân hàng gen Quốc tế.
Tuy nhiên, lồi Đinh mật (F. brilletii) là loài đặc
hữu của Việt Nam nên hiện nay chưa có cơng
bố nào trên Ngân hàng gen Quốc tế, do đó đây
là những trình tự đầu tiên của lồi Đinh mật

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022

37


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
[

được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, đóng
góp vào hệ thống cơ sở dữ liệu về ADN mã vạch
của thực vật.
Trình tự trnH-psbA của loài Đinh mật tại
Thái Nguyên tương đồng 100% với lồi Đinh
mật tại Thượng Tiến, Hịa Bình được công bố
trên Ngân hàng
ADN Việt
Nam

(VNADNBANK).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2007). Sách Đỏ Việt
Nam, Phần II – Thực vật. NXB Khoa học tự nhiên và
Công nghệ, Hà Nội.
2. Hà Văn Huân (2015). Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị
phân tử ADN mã vạch trong phân tích đa dạng di truyền
và giám định sinh vật ở Việt Nam. Ngân hàng dữ liệu
ADN Việt Nam.
3. Nguyễn Tiến Bân (2003). Danh mục các loài thực
vật Việt Nam, tập II. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Tiến Bân, Vũ Xuân Phương, Nguyễn
Khắc Khôi, Dương Đức Huyến, Trần Thế Bách, Đỗ Thị
Xuyến, Trần Thị Phương Anh (1996, 2007). Những lồi
thực vật có nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng ngoài thiên
nhiên ở Việt Nam và biện pháp bảo tồn. Trang web Trung
tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, cấp ngày 20/10/2013.
5. Phạm Hoàng Hộ (1999-2003). Cây cỏ Việt Nam,
Quyển 1-3. NXB Trẻ, TP. Hồ Chí Minh.
6. UBND tỉnh Thái Nguyên (2013) Quyết định số
2150/QĐ-UBND ngày 18/10/2013, phê duyệt Đề án
khung nhiệm vụ khoa học và công nghệ về quỹ gen cấp
tỉnh giai đoạn 2014-2020.
7. CBOL plant working group (2009). A DNA
barcode for land plants, 106: 12794-12797.
8. Costion C. M, Kress W. J, Crayn D. M (2016).
DNA barcodes confirm the taxonomic and conservation
status of a species of tree on the brink of extinction in the
Pacific.
9. Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D.,

Rao P. K., Nadia H., and Vincent S. (2005). Land plants
and DNA barcodes: short-term and long-term goals.
Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), 18891895.
10. Hall T. A. (1999). BioEdit: A User-Friendly
Biological Sequence Alignment Editor and Analysis
Program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids
Symposium Series 41, 95-98.
11. Kress W. J., Erickson D. L. (2008). DNA
barcodes: Gens, genomics, and bioinformatics. Proc Natl
Acad Sci U S A, 105(8), 2761-2762.
12. Krishnamurthy P. K, Francis R. A. (2012). A
critical review on the utility of DNA barcoding in
biodiversity
conservation. Biodiversity
and
Conservation 21, 1901– 1919.
13. Jiao L., Yu M., Wiedenhoeft C. A., He T., Li J.,

38

Liu B., Jiang X., Yin Y. (2018). DNA barcode
Authentication and Library Development for the Wood of
Six Commercial Pterocarpus Species: The Critical Role
of Xylarium Specimens. Scientific Reports 8(1), 265.
14. Liu Z. F., Ci X. Q, Li L., Li H. W., Conran J. G.,
Li J. (2016). DNA barcoding evaluation and imlication
for phylogenetic relationships in Lauraceae from China.
PLoS ONE 12 (4), e0175788.
15. Nybom H. (2004). Comparison of different
nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic

diversity in plants. Mol. Ecol. 13, 1143–1155.
16. Storchova H., M. S. Olson (2007). The
architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding
region in angiosperms. Plant systematic and evolution.
Biomedical and life sciences, 268, No 1-4, 235-256.
17. Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G.,
Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian
B., and Eske W. (2007). Power and limitations of the
chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding.
Nucleic Acids Res, 35(3), 14.
18. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van
Valkenburg J. L., Duistermaat C. H., Smulders (2009).
DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant
species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides
L.f.), from non-invasive relatives. Molecular Ecology
Resources, 9, 1086-1091.
19. Vijayan K. and Tsou C. H. (2010). DNA
barcoding in plants: taxonomy in a new
perspective. Current science, 99, 1530 - 1540.
20. Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M.,
Kerstetter R. (2010). DNA barcoding of the Lemnaceae,
a family of aquatic monocots. BMC Plant Biology,10,
205.
21. Dong W., Xu C., Li C., Sun J., Zuo Y., Shi S.,
Cheng T., Guo J., Zhou S. (2015). ycf1, the most
promising plastid DNA barcode of land plants. Scientific
reports, 5, 8348. doi: 10.1038/srep0834.
22. Wu F. Q., Shen S. K., Zhang X. J., Wang Y. H.,
Sun W. B. (2015). Genetic diversity and population
structure of an extremely endangered species: the world’s

Rhododendron. AoB Plants, 7, 10696–10700.
23. Pang X., Song J., Zhu Y., Xu H., Huang L., Chen
S. (2011). Applying plant DNA barcodes for Rosaceae
species
identification.
Cladistics,
27, 165–170.
doi: 10.1111/j.1096-0031.2010.00328.x
24. Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010).
Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for
plants and animals. PLoS ONE, 5, 13102.
25. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S.,
Kun L., Dong L. and Hui Y. (2010). Authentication of
Taxillus
chinensis
using
DNA
barcoding
technique. Journal of Medicinal Plants Research, 4(24),
2706-2709.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
26. Zhang X., Yang L., Liu Y.H., Zhou X. L., Zhang
L.Q., Wang Y.H., Shen S.K. (2021). Genetic diversity,
genetic structure, and demographic history of
Cinnamomum chago, a plant species with extremely
small populations in China. Global Ecology and

Conservation, 31. e01808.
27. Liu Z., Chen L. S., Song Y. J., Zhang J. S., Chen
L. K. (2012). Application of deoxyribonucleic acid
barcoding in Lauraceae plants. Pharmacogn Mag , 8(29),
4–11.doi: 10.4103/0973-1296.93301.

RESEARCH FOR IDENTIFICATION OF SOME DNA BARCODES OF
Fernandoa brilletii SPECIES IN THAI NGUYEN PROVINCE
Ha Bich Hong1, Nguyen The Huong1, Vu Pham Thao Vy2, Vu Van Thong3
1

Vietnam National University of Forestry
2
Thai Nguyen Central General Hospital
3
Vy Anh Agriculture Development Limited Liability Company

SUMMARY
Fernandoa brilletii (Dop) Steen is an endemic tree species in Vietnam with high economic value, its trunk is
used in construction and high-class furniture making due to its beautiful wood grain and good quality. This is a
highly endangered plant species in the wild but so far has not been included in the Vietnam Red Book. Therefore,
studies for the evaluation of genetic diversity are necessary to propose measures to conserve the genetic resources
of F. brilletii species in the whole country in general and in Thai Nguyen province in particular. Currently,
barcoded DNA has been used as molecular markers with high accuracy in species identification and genetic
diversity assessment. In plants, the DNA sequences used as barcoding in identification or classification are
usually the nucleotide sequences of the chloroplast and nuclear genomes, including both coding and non-coding
regions. In this study, three barcoded DNA marker matK, trnH-psbA and ITS were used to initially study the
barcoded DNA for F. brilletii species distributed in Thai Nguyen province. The cloning efficiency by PCR and
nucleotide sequencing of three barcoded DNA markers in F. brilletii species reached 100%. In which, the

nucleotide sequences of matK and trnH-psbA gene segments of all F. brilletii samples in 5 districts of Thai
Nguyen province have an absolute similarity. Particularly, the nucleotide sequence of the ITS barcode showed
the appearance of two variants with two different nucleotide positions between the studied F. brilletii samples.
The matK, trnH-psbA, and ITS sequences of F. brilletii species were successfully registered on the international
gene bank (GenBank) with codes ON603621, ON603622, ON614190, ON614191, respectively. The world
database of barcoded DNA as well as the international gene bank has not yet published any barcoded DNA
sequences of F. brilletii species. Therefore, this study is the first to identify barcoded DNA sequences for this
precious and endemic tree species, contributing to enriching the barcode DNA database for the barcoded DNA
system of plants.
Keywords: DNA barcode, Fernandoa brilletii, ITS, matK, trnH-psbA.
Ngày nhận bài
Ngày phản biện
Ngày quyết định đăng

: 09/6/2022
: 15/7/2022
: 26/7/2022

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4 - 2022

39