I H C QU C GIA TP. H CHÍ MINH
TR
NG
I H C BÁCH KHOA
MAI TH NG C LAN THANH
ÁNH GIÁ
C I M KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
KHÁNG METHICILLIN (MRSA) C A M T S D
C LI U
THU HÁI T I T NH BỊNH D
NG
LU N ÁN TI N S K THU T
TP. H
CHÍ MINH ậ N M 2022
I H C QU C GIA TP. H CHÍ MINH
TR
NG
I H C BÁCH KHOA
MAI TH NG C LAN THANH
ÁNH GIÁ
C I M KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
KHÁNG METHICILLIN (MRSA) C A M T S D
C LI U
THU HÁI T I T NH BỊNH D
NG
Chuyên ngành: Công Ngh sinh h c
Mã s chuyên ngành: 62420201
Ph n bi n đ c l p 1: PGS. TS. Ph m Th Ph ng Trang
Ph n bi n đ c l p 2: PGS. TS. Tr n Cát ông
Ph n bi n 1: PGS. TS. Nguy n Th Thu Hoài
Ph n bi n 2: PGS. TS. Tr n Hùng
Ph n bi n 3: PGS. TS. Nguy n Thúy H ng
NG I H
NG D N KHOA H C:
1. PGS. TS. Tr ng V Thanh
2. PGS. TS. Hoàng Anh Hồng
TP. H CHÍ MINH – N M 2022
L I CAM OAN
Tác gi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên c u c a b n thân tác gi . Các k t qu nghiên
c u và các k t lu n trong lu n án này là trung th c, và không sao chép t b t k m t ngu n
nào và d
i b t k hình th c nào. Vi c tham kh o các ngu n tài li u (n u có) đã đ
hi n trích d n và ghi ngu n tài li u tham kh o đúng quy đ nh.
Tác gi lu n án
C
Mai Th Ng c Lan Thanh
i
c th c
TÓM T T LU N ÁN
tài “ ánh giá đ c đi m kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) c a
m ts d
c li u thu hái t i t nh Bình D
ng” đ
c th c hi n t tháng 12/2015 đ n tháng
12/2020 t i b môn Công ngh sinh h c và B mơn Hóa D
tr
ng
c, khoa K Thu t Hóa H c,
i h c Bách Khoa Thành ph H Chí Minh; b mơn Sinh h c ng d ng, khoa
Khoa H c T Nhiên,
i h c Th D u M t. M c tiêu c a đ tài là xác đ nh đ
c ho t tính
kháng vi khu n Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) c a cao ethanol th c
v t/cao phân đo n/tinh ch t.
N i dung c a đ tài bao g m: Sàng l c ho t tính kháng MRSA c a cao ethanol toàn
ph n/cao phân đo n t th c v t thu hái t i t nh Bình D
ng;
ánh giá kh n ng kháng
khu n MRSA c a cao ethanol toàn ph n/cao phân đo n; Xác đ nh công th c h p l c gi a
cao phân đo n v i kháng sinh, và công th c h p l c gi a các cao phân đo n v i nhau; Xác
đ nh ho t tính c ch hình thành màng sinh h c, ho t tính c ch tan huy t, ho t tính c
ch PBP2a, c ch kh n ng ch u mu i trên MRSA c a cao phân đo n; Xác đ nh và phân
tích ho t tính c a tinh ch t chính t cao ethanol tồn ph n cho ho t tính kháng MRSA t t
nh t. K t qu đ t đ
c nh sau:
K t qu xác đ nh đ
c b n cao chi t ethanol toàn ph n t Ngành Ng nh Nam, X ng Mã,
Trâm Trịn, Cị Ke có ho t tính kháng MRSA, trong đó cao ethanol tồn ph n Trâm Tròn,
X ng Mã, Cò Ke đ
c báo cáo l n đ u v ho t tính kháng MRSA. K t qu th đ c tính
trên nguyên bào s i và t bào ung th gan đã xác đ nh tính an tồn c a các cao chi t ethanol
toàn ph n Ngành Ng nh Nam, X ng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke.
M c tiêu c a lu n án là xác đ nh nhóm ho t ch t kháng MRSA, công th c h p l c và đích
tác đ ng c a nhóm ho t ch t kháng MRSA. K t qu c a đ tài đã thu nh n đ
c các cao
phân đo n ethylacetate c a Ngành Ng nh Nam, X ng Mã, Trâm Tròn, Cị Ke cho ho t tính
kháng MRSA. Trong đó, cao phân đo n ethylacetate Trâm Trịn có giá tr MIC th p nh t
b ng 1 mg/mL. Ph
ng pháp bàn c đ
c s d ng nh m xác đ nh ch s ‑IC c a các cao
phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam, X ng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke v i kháng sinh,
ii
và gi a b n cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam, X ng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke
v i nhau. K t qu xác đ nh cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam, Trâm Tròn có
kh n ng h p l c v i kháng sinh cefoxitin, v i công th c h p l c là cao phân đo n
ethylacetate Ngành Ng nh Nam
n ng đ 0,812 mg/mL và cefoxitin
n ng đ 0,002
mg/mL (1:1); Công th c h p l c c a cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn v i cefoxitin
là cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn
n ng đ 0,500 mg/mL và cefoxitin 0,008
mg/mL (1:1). Tuy nhiên, ch có cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn th hi n s h p l c
v i vancomycin, v i công th c h p l c là cao phân đo n ethylacetate Trâm Trịn
n ng
đ b ng 0,24 mg/mL và vancomycin có n ng đ b ng 0,001mg/mL (1:1).
Các k t qu t ph
ng pháp nhu m v i crystal violet và ch p nh S‐M đã ch ra r ng, cao
phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam
đo n ethylacetate Trâm Tròn
n ng đ b ng 0,4062 mg/mL và cao phân
n ng đ b ng 0,2500 mg/mL c ch hình thành màng sinh
h c trên ch ng MRSA. nh ch p S‐M xác đ nh hình thái t bào MRSA trong màng sinh
h c thay đ i khi x lý v i hai cao phân đo n này.
Th nghi m kh n ng ch u mu i, xác đ nh vách t bào là đích tác đ ng c a cao phân đo n
ethylacetate Ngành Ng nh Nam vì ph n tr m t bào MRSA s ng sót so v i đ i ch ng gi m
58,89%.
S d ng ph
ng pháp nuôi trên môi tr
ng th ch máu nh m xác đ nh kh n ng c ch đ c
tính tan huy t c a ch ng MRSA khi ti p xúc v i dung d ch kh o sát. K t qu xác đ nh cao
phân đo n ethylacetate X ng Mã c ch hoàn toàn kh n ng tan huy t c a ch ng MRSA
n ng đ 4 mg/mL.
M c tiêu c a lu n án là xác đ nh c u trúc tinh ch t chính, công th c h p l c và c ch
kháng MRSA. K t qu thu nh n đ
c b n tinh ch t t cao ethanol toàn ph n Trâm Tròn là
pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, acid betulonic. Trong đó,
l
ng pinostrobin đ
c tìm th y nhi u nh t v i hi u su t chi t là 12,79 ± 0,21 mg
pinostrobin/ 1g b t lá khô, dimethyl pinocembrin l n đ u tiên đ
c tách chi t t chi Trâm.
Công th c h p l c c a pinostrobin và vancomycin là pinostrobin
µg/mL và vancomycin
n ng đ b ng 0,5 µg/mL (1:1).
iii
n ng đ b ng 12,8
ABSTRACT
The thesis title: “Evaluation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
characteristics of some medicinal herbs collected in Binh Duong province” was carried out
at the Department of Biotechnology, the Department of Chemistry- Faculty of Chemical
Engineering, Ho Chi Minh City University of Technology, the Department of Applied
Biology, Thu Dau Mot University from December 2015 to December 2019. The main
purpose of this study is to collect the ethanol plant extracts/fractions/main pured
compounds which have anti-MRSA activity.
The content of the topic includes: Screening the ethanol plant extracts are collected in Binh
Duong province and evaluation of anti-MRSA activity of ethanol plant extracts and
fractions; the fractions of ethanol plant extracts are collected, which are evaluated the antiMRSA activity of these fractions, simultaneous assessment of the mechanism of
antibacterial activity of fractions; The main pure compound is isolated from ethanol plant
extract which has the most anti-MRSA activity. The synergistic formula of main compound
with antibiotic is determined. The results are as follows:
There are four plant species, including Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata,
Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L had been identified with anti-MRSA activity.
Among them, ethanol extracts of Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia
asiatica L were reported anti-MRSA activity the first time. The Sulforhodamine B assay
is carried out for testing toxicity of ethanol plant extracts on fibroblast cells and hepatocyte
cells. The results present that Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium
glomeratum, Grewia asiatica L ethanol extracts are safe.
The ethylacetate fractions of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium
glomeratum, Grewia asiatica L leaf extracts are collected for testing anti-MRSA activity.
Especially, ethylacetate Syzygium glomeratum fraction has the lowest MIC value of
1mg/mL. The checkerboard method was undertaken to determine synergistic interactions
of plant extracts and isolated pure compounds in combination with antibiotic and the four
iv
ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum,
Grewia asiatica L extracts together demand for FICIs. The results shown that two
ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Syzygium glomeratum extracts can synergize
with cefoxitin. The synergistic formulation of ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense
extract and cefoxitin is 0.812 mg/mL (NN Ea) and 0.002 mg/mL (cefoxitin) (1:1); the
synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is 0.500 mg/mL
(SCTT Ea) and 0.008 mg/mL (cefoxitin) (1:1), respectively. However, only the
ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is determined the synergistic activity with
vancomycin. The synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum
extract and vancomycin is 0.24 mg/mL (SCTT Ea) and 0.001 mg/mL (vancomycin) (1:1).
The results from crystal violet assay and SEM technique have shown that ethylacetate
Cratoxylum cochinchinense fraction at a concentration of 0.4062 mg/mL and ethyl acetate
Syzygium glomeratum fraction at a concentration of 0.2500 mg/mL, which inhibited the
biofilm formation on MRSA. SEM images are collected, which presented the change of
morphologies of MRSA cells inside the biofilm when MRSA had been treated with these
two fractions.
The salt tolerance test was undertaken to identify damage to the cell wall on MRSA. The
results show that MRSA cells are treated with the ethylacetate of Cratoxylum
cochinchinense extract, which decreased the surviving of MRSA cells on high salt
concentrated medium.
The MRSA cultured blood agar method was carried out to determine the ability to inhibit
hemolytic toxicity of MRSA strains when MRSA cells were treated with the ethylacetate
of plant extracts or pinostrobin. The results showed that the ethylacetate of Carallia
brachiata extract completely inhibited the hemolytic ability on the MRSA strain at a
concentration of 4 mg/mL.
In this research, four pure compounds are isolated from the Syzygium glomeratum ethanol
extract, which are pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, betulonic
acid. Among them, the amount of pinostrobin was highest with an extraction yield of
v
12.79±0.21 mg of pinostrobin in 1 g of dried leaf powder, dimethyl pinocembrin is the first
isolated from the genus Syzygium.
The synergistic formulation of pinostrobin and vancomycin is 12.8 µg/mL (pinostrobin)
and 0.5 µg/mL (vancomycin) (1:1), respectively.
vi
L I CÁM
N
Tôi xin trân tr ng g i l i bi t n sâu s c đ n PGS.TS. Tr
Anh Hoàng là hai ng
i th y đã h
ng d n t n tình, ch b o cho tơi hồn thành Lu n Án.
c bi t, Tơi xin kính dâng lịng bi t n c a tơi cho ng
giúp đ tôi r t nhi u c ng nh đ ng viên cho tơi v
hơm nay, đó chính là ng
ng V Thanh và TS. Hồng
i th y đã giúp tơi đ nh h
ng và
t qua r t nhi u khó kh n đ có ngày
i th y PGS.TS Lê Phi Nga. Tôi xin g i l i tri ân sâu s c đ n gia
đình đã ln ng h , giúp đ v v t ch t c ng nh tinh th n đ tơi n tâm hồn thành
Lu n Án. Tôi chân thành cám n đ n Lãnh đ o
i h c Th D u M t, Th y cô Khoa K
Thu t Hóa H c, Phịng sau đ i h c Bách Khoa TP.HCM và các đ ng nghi p đã cung c p
tài li u, t o đi u ki n cho tơi nghiên c u hồn thành Lu n Án và đóng góp ý ki n.
c bi t,
tôi xin g i l i đ n TS. Nguy n Th Nh t H ng, ch luôn ng h và t o đi u ki n cho tôi
nghiên c u, h c t p, làm vi c. Tôi cám n các b n sinh viên, các đ ng chí, đ ng đ i luôn
sát cánh bên tôi, đ c bi t cám n b n Tr n Th Mai Thy đã luôn ng h tinh th n c ng nh
v t ch t. Lu n án đ
tôi bi n
tôi, ng
c hoàn thành là s giúp đ , đ ng viên và t o đi u ki n đ c bi t cho
c m thành hi n th c. Tôi kính dâng lịng th
i đã cho tơi r t nhi u ý t
bi t n đ n t t c m i ng
phút vui s
ng khi nh n đ
ng m n và bi t n đ n Ngo i c a
ng trong nghiên c u này. M t l n n a, xin chân thành
i luôn bên c nh tôi trong khó kh n, th thách hay nh ng giây
c nh ng k t qu mong đ iầ
vii
M CL C
L I CAM OAN.......................................................................................... i
TịM T T LU N ÁN .................................................................................. ii
ABSTRACT .................................................................................................. iv
L I C M N ............................................................................................... vii
DANH M C CÁC HỊNH ............................................................................ xi
DANH M C B NG .................................................................................... xiii
DANH M C CÁC T
M
VI T T T .............................................................. xvi
U ....................................................................................................... 1
it
ng và ph m vi nghiên c u ................................................................ 2
N i dung nghiên c u ..................................................................................... 3
ụ ngh a khoa h c và ý ngh a th c ti n .......................................................... 3
CH
NG 1. T NG QUAN TÀI LI U ....................................................... 4
1.1 T ng quan v MRSA .............................................................................. 4
1.1.1.
c đi m vi th và đ c tính chi Staphylococcus............................... 4
1.1.2. C ch kháng thu c c a MRSA ........................................................ 4
1.1.3.
c đi m sinh lý c a MRSA ............................................................. 5
1.2 T ng quan m t s kháng sinh ................................................................. 6
1.2.1 Nhóm Glycopeptide ........................................................................... 6
1.2.2. Nhóm Oxazolidinone ........................................................................ 7
1.2.3. Cephalosporin.................................................................................... 8
1.2.4. Các thu c khác .................................................................................. 8
1.3 Cao chi t/phân đo n/tinh ch t kháng MRSA .......................................... 8
1.3.1. Tóm l
c các nghiên c u .................................................................. 8
1.3.2. Các đích tác đ ng c a cao chi t/tinh ch t ......................................... 14
1.4 T ng quan m t s d
c li u thu hái t i Bình D
ng.............................. 18
1.4.1 Ngành Ng nh Nam ............................................................................. 18
viii
1.4.2 X ng Mã ............................................................................................. 20
1.4.3 Trâm Tròn........................................................................................... 21
1.4.4 Cò Ke .................................................................................................. 23
CH
NG 2. V T LI U VÀ PH
NG PHÁP .......................................... 25
2.1 V t li u, hóa ch t thí nghi m .................................................................. 25
2.1.1 M u th c v t ....................................................................................... 25
2.1.2 Hóa ch t thí nghi m ........................................................................... 25
2.1.3 Ch ng vi khu n .................................................................................. 26
2.1.4 Thi t b thí nghi m ............................................................................. 26
2.2 N i dung và ph
2.2.1 Thu m u d
ng pháp nghiên c u .................................................... 28
c li u và kh o sát s b ................................................. 29
2.2.2 Thu cao chi t/phân đo n/tinh ch t ..................................................... 30
2.2.3 nh tính thành ph n hóa h c c a cao ethanol tồn ph n/cao phân đo n
Trâm Trịn; Thu tinh ch t chính trong cao ethanol tồn ph n Trâm Tròn .... 31
2.2.4 Kh o sát ho t tính kháng MRSA c a cao chi t/phân đo n/tinh ch t. 35
2.2.5 C ch kháng khu n c a cao phân đo n/tinh ch t trên ch ng MRSA47
2.2.6 Xác đ nh đ c tính t bào c a các cao th c v t ................................... 51
CH
NG 3. K T QU VÀ BI N LU N .................................................. 54
3.1 Cao ethanol toàn ph n th c v t, ho t tính kháng MRSA, tính an tồn
c a cao ethanol tồn ph n ............................................................................. 54
3.1.1 Cao ethanol toàn ph n th c v t, ho t tính kháng MRSA c a cao ..... 54
3.1.2
c tính t bào c a các cao ethanol toàn ph n th c v t .................... 55
3.2 Cao phân đo n và ho t tính kháng MRSA .............................................. 56
3.2.1 Cao phân đo n .................................................................................... 57
3.2.2 Ho t tính kháng MRSA c a cao phân đo n ....................................... 57
3.2.3 Th nghi m đánh giá kh n ng di t khu n theo th i gian c a hai
cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam, Trâm Tròn ........................ 60
3.2.4 H p l c gi a cao phân đo n v i kháng sinh cefoxitin ...................... 63
ix
3.2.5 H p l c gi a cao phân đo n v i kháng sinh vancomycin ................. 71
3.2.6 H p l c c a các cao phân đo n .......................................................... 73
3.3 nh tính thành ph n hóa h c cao ethanol tồn ph n/cao phân đo n Trâm Trịn;
Thu tinh ch t chính và ho t tính kháng MRSA ............................................ 81
3.3.1 nh tính thành ph n hóa h c trong cao ethanol toàn ph n và cao phân
đo n Trâm Tròn ............................................................................................ 81
3.3.2 Phân l p và xác đ nh c u trúc............................................................. 83
3.3.3 H p l c gi a pinostrobin và vancomycin .......................................... 93
3.4 C ch kháng MRSA c a phân đo n/tinh ch t ....................................... 95
3.4.1
c ch hình thành màng sinh h c ...................................................... 95
3.4.2
c ch sinh đ c t tan huy t .............................................................. 101
3.4.3
c ch bi u hi n protein PBP2a trên ch ng MRSA .......................... 102
3.4.4 Th nghi m kh n ng ch u mu i c a MRSA .................................... 103
CH
NG 4. K T LU N VÀ KI N NGH ................................................ 106
4.1 K t lu n ................................................................................................... 106
4.2 Ki n ngh ................................................................................................. 106
DANH M C CÔNG TRỊNH CÔNG B T
K T QU C A LU N ÁN 107
TÀI LI U THAM KH O ............................................................................. 108
PH L C ...................................................................................................... 124
x
DANH M C HÌNH
Hình 1.1. Staphylococcus aureus-T c u vàng ...................................................... 5
Hình 1.2. C u trúc kháng sinh vancomycin ........................................................... 6
Hình 1.3. Con đ
ng t ng h p vách t bào c a Staphylococcus aureus ............... 17
Hình 1.4. Hoa và lá cây Ngành Ng nh Nam .......................................................... 20
Hình 1.5. Hoa, lá và tồn cây X ng Mã ................................................................. 21
Hình 1.6. Hoa, lá và tồn cây Trâm Trịn ............................................................... 22
Hình 1.7. Tồn cây, hoa và lá cây Cị Ke ............................................................... 24
Hình 2.1. Hình nh th c t đ a đi m thu m u ........................................................ 25
Hình 2.2. S đ n i dung nghiên c u ..................................................................... 28
Hình 2.3 S đ quy trình phân l p .......................................................................... 34
Hình 3.1 Ho t tính kháng MRSA c a cao phân đo n ............................................ 58
Hình 3.2
ng cong t ng tr
ng c a MSSA trong th nghi m time-killing ...... 61
Hình 3.3
ng cong t ng tr
ng c a MRSA trong th nghi m time-killing ...... 62
Hình 3.4 H p l c gi a kháng sinh cefoxitin và cao phân đo n ethyl acetate Trâm
Tròn, Ngành Ng nh Nam trên hai ch ng MSSA, MRSA ...................................... 64
Hình 3.5 H p l c c a cao phân đo n ethylacetate X ng Mã v i cefoxitin ............ 68
Hình 3.6 H p l c c a cao phân đo n ethyl acetate Trâm Trịn v i vancomycin ... 71
Hình 3.7 H p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn và Ngành
Ng nh Nam ............................................................................................................. 74
xi
Hình 3.8 H p l c gi a hai cao phân đo n ethyl acetate Trâm Tròn và Cò Ke ...... 75
Hình 3.9 H p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn và X ng Mã .. 77
Hình 3.10 H p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate X ng Mã và Ngành
Ng nh Nam ............................................................................................................. 79
Hình 3. 1 Ph
1
H -NMR c a h p ch t H1.1 ........................................................... 83
Hình 3. 2 Ph
13
C -NMR c a h p ch t H1.1 .......................................................... 84
Hình 3. 3 GC-MS c a H1.1 .................................................................................... 86
Hình 3.14 C u trúc c a pinostrobin ........................................................................ 86
Hình 3. 4 Ph
1
H-NMR c a H7.1 ........................................................................... 87
Hình 3. 5 Ph
13
C-NMR c a H7.1 .......................................................................... 88
Hình 3.17 Dimethyl pinocembrin ........................................................................... 88
Hình 3.18. Cơng th c acid 4-methoxy-benoic. ...................................................... 90
Hình 3. 6 Ph
1
H-NMR c a h p ch t ‐7.1 ............................................................ 90
Hình 3. 7 Ph
13
C- NMR c a ‐ 7.1 ........................................................................ 91
Hình 3.21. Acid betulonic....................................................................................... 91
Hình 3.22 H p l c c a pinostrobin v i vancomycin ............................................. 93
Hình 3.23
c ch hình thành màng sinh h c c a ba cao phân đo n ethyl acetate
Trâm Tròn, Ng nh Ng nh Nam, Cò Ke ................................................................. 96
Hình 3. 8 Màng sinh h c c a ch ng MRSA ........................................................... 98
Hình 3. 9 Màng sinh h c c a MRSA khi Môi tr
ng TSB+1% glucose đ
cb
sung cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam ............................................ 99
xii
Hình 3. 10 Màng sinh h c MRSA khi mơi tr
ng TSB, 1% glucose có b sung
cao phân đo n ethyl acetate Trâm Trịn ................................................................. 100
Hình 3. 11 Mơi tr
Hình 3.28
ng TSB+1% glucose đ
c b sung tinh ch t pinostrobin ..... 100
c ch đ c tính tan huy t t cao phân đo n X ng Mã ......................... 102
Hình 3.29 Ki m tra s hi n di n PBP2a trên ch ng MRSA .................................. 103
Hình 3.30 Ph n tr m t bào MRSA s ng sót.......................................................... 105
xiii
DANH M C B NG
B ng 1.1 Cao chi t th c v t kháng MRSA ............................................................ 9
B ng 1.2 Ho t ch t th c v t kháng MRSA ............................................................ 11
B ng 2. 1 S đ ti n hành thí nghi m cao phân đo n ethylacetate Trâm Trịn, Ngành
Ng nh Nam v i cefoxitin ....................................................................................... 37
B ng 2.2 S đ chú thích gi ng k t h p theo s đ ............................................... 38
B ng 2.3 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a cao phân đo n ethylacetate X ng Mã
và cefoxitin ............................................................................................................. 39
B ng 2.4 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a cao phân đo n ethylacetate Cò Ke và
cefoxitin .................................................................................................................. 40
B ng 2.5 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a pinostrobin và vancomycin .. 41
B ng 2.6 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm
Tròn và Ngành Ng nh Nam ................................................................................... 42
B ng 2.7 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm
Tròn và Cò Ke ........................................................................................................ 44
B ng 2.8 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm
Tròn và X ng Mã .................................................................................................... 45
B ng 2.9 S đ ti n hành thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate X ng
Mã và Ngành Ng nh Nam ...................................................................................... 46
B ng 3.1
m và đ tro toàn ph n c a m u th c v t.......................................... 54
B ng 3.1 Ho t tính kháng MRSA c a các cao ethanol toàn ph n th c v t........... 55
B ng 3.3 Ph n tr m đ c t bào c a các m u cao trên dòng t bào ung th gan Hep
G2 và nguyên bào s i đ
c xác đ nh b ng ph
xiv
ng pháp SRB .............................. 56
B ng 3.4. Hi u su t chi t cao phân đo n................................................................ 57
B ng 3.5 Giá tr MIC c a cao phân đo n ............................................................... 59
B ng 3.6 K t qu c a thí nghi m kh o sát h p l c c a cao phân đo n ethylacetate
Trâm Tròn, Ngành Ng nh Nam v i cefoxitin ........................................................ 64
B ng 3.7 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn v i cefoxitin .... 65
B ng 3.8 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam v i
cefoxitin .................................................................................................................. 66
B ng 3.9 K t qu c a thí nghi m k t h p gi a cao phân đo n ethylacetate X ng
Mã v i kháng sinh cefoxitin ................................................................................... 68
B ng 3.10 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethylacetate X ng Mã v i cefoxitin ..... 69
B ng 3.11 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethyl acetate Cò Ke v i cefoxitin ........ 66
B ng 3.10 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn v i vancomycin
................................................................................................................................ 66
B ng 3.11 K t qu thí nghi m h p l c gi a cao phân đo n ethylacetate Cò Ke
v i cefoxitin ............................................................................................................ 70
B ng 3.12 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethylacetate Cò Ke v i cefoxitin ......... 70
B ng 3.13 Ch s ‑IC c a cao phân đo n ethyl acetate Trâm Tròn v i vancomycin
................................................................................................................................ 71
B ng 3.14 Ch s ‑IC c a phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam v i
vancomycin ............................................................................................................ 72
B ng 3.15 K t qu kh o sát h p l c SCTT ‐a và NN ‐a trên s đ 96 gi ng ...... 73
xv
B ng 3.16 Ch s ‑IC c a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn v i Ngành Ng nh
Nam ........................................................................................................................ 75
B ng 3.17 K t qu c a thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate
Trâm Tròn và Cò Ke .............................................................................................. 76
B ng 3.18 Ch s ‑IC c a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn và Cò ke .. 76
B ng 3.19 K t qu c a thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn
và X ng Mã ........................................................................................................... 78
B ng 3.20 Ch s ‑IC c a hai cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn và X ng Mã 78
B ng 3.21 K t qu c a thí nghi m h p l c gi a hai cao phân đo n ethylacetate X ng Mã
và Ngành Ng nh Nam ........................................................................................... 80
B ng 3.22 Ch s ‑IC c a hai cao phân đo n ethylacetate X ng Mã và Ngành Ng nh Nam
................................................................................................................................ 80
B ng 3.23 Thành ph n hóa h c c a cao ethanol tồn ph n Trâm Trịn ................. 82
B ng 3.24 Thành ph n hóa h c c a các cao phân đo n Trâm Tròn....................... 82
B ng 3. 2 B ng so sánh H1.1 và Pinostrobin ........................................................ 85
B ng 3. 3 B ng so sánh H7.1 và Dimethyl pinocembrin ....................................... 89
B ng 3.27 K t qu thí nghi m h p l c gi a pinostrobin v i vancomycin............. 94
B ng 3.28 Ch s ‑IC c a pinostrobin và vancomycin .......................................... 94
B ng 3.29 Ph n tr m t bào MRSA s ng sót ......................................................... 104
xvi
DANH M C CÁC T
VI T T T
96W
đ a 96 gi ng
Alt
Autolysin
CC
S c ký c t
CDC
Trung tâm ki m soát và phịng tránh b nh Hoa K
CFT
Cefoxitin
CFU
n v hình thành khu n l c
CLSI
Tiêu chu n Xét nghi m Lâm sàng
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid
DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
ED
Cao ethanol toàn ph n đ
c chi t t th c v t khơ
EF
Cao ethanol tồn ph n đ
c chi t t th c v t t
eDNA
Extracellular DNA
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
EGCg
Epigallocatechin-gallate
EPI
Nhân t
FDA
C c Qu n lý D
FIC
N ng đ
FICI
ch s n ng đ
FnBP
Fibronection-binding protein
GAPDH
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
HPLC
S c ký lòng cao áp (High performance liquid chromatography)
MBC
N ng đ di t khu n t i thi u
i
c ch b m
c ph m và Th c ph m Hoa K
c ch t ng ph n
c ch t ng ph n ph i h p
xvii
MDR
a kháng thu c
MHA
Môi tr
ng Mueller Hinton Agar
MHB
Môi tr
ng l ng Muller Hinton
MIC
N ng đ
MRSA
Khu n t c u vàng Staphylococcus aureus kháng methicillin
MSA
Môi tr
MSSA
Staphylococcus aureus nh y methicillin
NMR
Ph c ng h
OD
M t đ đo quang
Oxa
Oxacillin sodium
PBP2a
Protein g n kháng sinh Penicillin c a gen mecA
PBPs
Protein liên k t Penicillin
PBS
Dung d ch đ m sinh lý
PCR
Ph n ng khu ch đ i gen
Rpm
T c đ ly tâm vòng trên phút (Rotation per minute)
S
H p l c (Synergy)
SCCmec
Staphylococcal Chromosome Cassette mec
TLC
S c ký b n m ng
TSA
Môi tr
ng Tryptone soya agar
TSB
Môi tr
ng l ng Tryptone soya
VAN
Vancomycin
WHO
T ch c Y t Th gi i
SCTT
Cao ethanol tồn ph n Trâm Trịn
NN
Cao ethanol tồn ph n Ngành Ng nh Nam
c ch t i thi u
ng Manitol salt agar
ng t h t nhân
xviii
XM
Cao ethanol toàn ph n X ng Mã
CK
Cao ethanol toàn ph n Cò Ke
SCTT Ea
Cao phân đo n ethylacetate Trâm Tròn
NN Ea
Cao phân đo n ethylacetate Ngành Ng nh Nam
XM Ea
Cao phân đo n ethylacetate X ng Mã
CK Ea
Cao phân đo n ethylacetate Cò Ke
SCTT hex Cao phân đo n hexan Trâm Tròn
NN hex
Cao phân đo n hexan Ngành Ng nh Nam
XM hex
Cao phân đo n hexan X ng Mã
CK hex
Cao phân đo n hexan Cò Ke
xix
M
U
T c u vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus kháng methicillin-MRSA) là
m t v n đ y t toàn c u và m t thách th c trong đi u tr [1]. MRSA có c ch kháng
v i kháng sinh nhóm -lactam nh methicillin và penicillin làm cho các b nh nhi m
trùng do MRSA r t khó đi u tr [2]. N m 2014, c quan nghiên c u y t và ch t l
Hoa K (AHRQ) đã công b g n 375.000 tr
t vong
10 n
ng h p
Hoa K có liên quan đ n nhi m MRSA. Chi phí đi u tr cho m t v t m sâu
b nhi m MRSA,
Hoa K
ng h p nhi m trùng và 23.000 tr
ng
c tính kho ng 43.970 USD cho m t b nh nhân t 65 tu i tr lên
[3] v i th i gian đi u tr dài, kèm theo nh ng th
ng t t [3, 4]. Nghiên c u
c châu Á xác đ nh t l t vong 30 ngày liên quan viêm ph i b nh vi n t 18,7
% đ n 40,8 %, trong đó MRSA chi m 82,1 % trong t ng s các ch ng S. aureus phân
l p [5]. N m 2017, WHO đã công b danh sách các m m b nh, các ki u hình kháng
kháng sinh u tiên nghiên c u và phát tri n các ph
chia thành ba m c đ
ng pháp đi u tr m i, đ
c phân
u tiên là quan tr ng, cao và trung bình. Trong đó, MRSA đ
x p vào nhóm quan tr ng u tiên tồn c u đ nghiên c u và phát tri n các ph
c
ng pháp
đi u tr m i [6].
MRSA có nhi u y u t đ c l c, là nguyên nhân gây ra hàng lo t các b nh v nhi m
trùng da, nhi m trùng máu, viêm ph i, viêm kh p r t khó đi u tr [7]. M t đ c đi m
quan tr ng khác là kh n ng hình thành màng sinh h c (biofilm). Màng sinh h c đ
c
t o b i các vi sinh v t s ng bám dính và liên k t v i nhau trên b m t c ch t [8]. S
hình thành màng sinh h c có vai trò r t quan tr ng trong t n t i, thoát kh i h th ng
mi n d ch c a v t ch [9]. Màng sinh h c và các thành ph n bao quanh bên ngồi màng
có vai trò nh m t tr ng i v t lý góp ph n ng n ch n thu c và s xâm nh p c a t bào
mi n d ch vào bên trong màng sinh h c [10].
Vancomycin là thu c u tiên hàng đ u cho đi u tr các b nh nhi m khu n do MRSA
[11]. Tuy nhiên, các ch ng MRSA kháng vancomycin (VRSA) chi m t l 6,1% đã đ
c
báo cáo [12]. H n n a trong kho ng 30 n m tr l i đây, các nhà khoa h c ch a th c s
thành cơng trong vi c tìm ra lo i kháng sinh m i, mà ch y u là các d ng s a đ i
1
(modify) d a vào khung nguyên b n c a thu c kháng sinh th h c .
ng tr
ph
c các th c tr ng nói trên, vi c tìm ki m các ngu n kháng sinh m i ho c các
ng pháp m i đ ki m soát vi khu n kháng kháng sinh, đ c bi t d ng siêu kháng
thu c là h t s c c p bách [13]. M t trong nh ng ph
ng pháp có kh n ng kháng vi
khu n kháng kháng sinh là s k t h p các h p ch t th c v t v i các kháng sinh [14]
ho c k t h p các h p ch t th c v t v i nhau [15].
Vi t Nam có m t h sinh thái phong phú và đa d ng, có ti m n ng v tài nguyên cây
thu c. Th c v t dùng làm thu c trong đi u tr các b nh c p tính và mãn tính đã và đang
đ
c s d ng t xa x a theo các đ n thu c y h c c truy n. Trong đó, ho t tính kháng
khu n c a các loài th c v t đ
c chú ý [16]. Bình D
ng v i 698 lồi cây thu c đã đ
c
phát hi n, trong đó có 140 loài cây thu c quý đi u tra t v n tri th c b n đ a t nh đã
đ
c báo cáo theo Tr n Công Lu n và c ng s v i đ tài “ i u tra kh o sát tình hình
cây thu c t nh Bình D
ng” nhi u lồi có tác d ng kháng khu n [17]. T b d li u
này, đ tài “Sàng l c kháng sinh th c v t tan trong dung môi n
c kháng Staphylococcus
aureus” ti p t c th c hi n kh o sát ho t tính kháng khu n S. aureus, k t qu ghi nh n
m t s loài th c v t thu hái t i Bình D
Xu t phát t
ng cho ho t tính kháng S. aureus.
nh ng ngun nhân nói trên, đ tài: “ ánh giá đ c đi m kháng
Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) c a m t s d
t nh Bình D
ng” đã đ
c li u thu hái t i
c th c hi n.
M c tiêu đ tƠi
Xác đ nh đ
c ho t tính kháng vi khu n Staphylococcus aureus kháng methicillin
(MRSA) c a cao ethanol th c v t/cao phân đo n/tinh ch t.
it
ng nghiên c u
Cao ethanol toàn phân/cao phân đo n t b n loài th c v t thu hái t i t nh Bình D
ng
bao g m: Trâm Tròn (Syzygium glomerulatum), X ng Mã (Carallia Brachiata), Cò Ke
(Grewia asiatica), Ngành Ng nh Nam (Cratoxylum cochinchinensis).
Ch ng vi khu n Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC® 33591,
ch ng vi khu n Staphylococcus aureus nh y methicillin (MSSA) ATCC® 6538 đ
2
c
cung c p b i Microbiologics c a M .
Ph m vi nghiên c u
Trong nghiên c u này ho t tính kháng MRSA c a cao ethanol tồn ph n/cao phân đo n
c a b n loài th c v t thu hái t i Bình D
ng. Các th nghi m đ
c ti n hành trong
phịng thí nghi m.
N i dung nghiên c u
Sàng l c ho t tính kháng MRSA c a cao ethanol toàn ph n/cao phân đo n t th c v t
thu hái t i t nh Bình D
ng.
ánh giá kh n ng kháng khu n MRSA c a cao ethanol toàn ph n/cao phân đo n; Xác
đ nh công th c h p l c gi a cao phân đo n v i kháng sinh, và công th c h p l c gi a
các cao phân đo n v i nhau
Xác đ nh ho t tính c ch hình thành màng sinh h c, ho t tính c ch tan huy t, ho t
tính c ch PBP2a, c ch kh n ng ch u mu i trên MRSA c a cao phân đo n
Xác đ nh và phân tích ho t tính c a tinh ch t chính t cao ethanol tồn ph n cho ho t
tính kháng MRSA t t nh t.
ụ ngh a khoa h c và Ủ ngh a th c ti n
Lu n án góp ph n ghi nh n các loài th c v t m c t i Bình D
ng (Vi t Nam) cho ho t
tính kháng MRSA.
ng th i, lu n án tìm ki m các công th c h p l c gi a cao phân đo n/tinh ch t v i
kháng sinh và gi a cao phân đo n v i nhau cho ho t tính kháng MRSA, nh m tìm ra
li u pháp kháng MRSA mà h n ch xu t hi n c ch kháng, và tái s d ng l i các kháng
sinh th h c b kháng b i MRSA.
tài cơ l p các tinh ch t chính t cao ethanol tồn ph n có ho t tính kháng MRSA cao
nh t, và xác đ nh công th c h p l c gi a tinh ch t và kháng sinh trên MRSA.
K t qu c a lu n án s giúp đ a ra m t s gi i pháp ki m soát MRSA trong th c ti n.
3
CH
NG 1.
T NG QUAN TÀI LI U
1.1 T ng quan v MRSA
1.1.1
c đi m vi th và đ c tính chi Staphylococcus
S. aureus l n đ u tiên đ
c phân l p t m ng
i vào n m 1880 b i Scotland Alexander
Ogston [18]. Chi Staphylococcus có h n 40 lồi khác nhau, trong đó có 3 lồi t c u gây
b nh đ
c chú ý trong y h c: S. aureus (T c u vàng), S. epidermidis (T c u da), và S.
saprophyticus. S. aureus là nh ng vi khu n hình c u, khơng di đ ng, gram d
ng, đ
ng
kính 0,5-1,5 µm, t bào x p thành hình chùm nho. S. aureus là nh ng vi khu n hi u khí
hay k khí khơng b t bu c, có th phát tri n trong mơi tr
ng khơng có oxi nh enzyme
catalase ho c s d ng m t ch t nh n đi n t . Ngoài ra, chúng còn cho ph n ng DNase,
phosphatase d
[19].
c th ng
nh ng ng
con ng
ng tính, có kh n ng lên men và sinh acid t manitol, trehalose, sucrose
i, S. aureus là vi sinh v t c h i t n công vào v t th
i có s c đ kháng kém. Vi khu n th
ng h ho c
ng kí sinh trên m i, h ng và da c a
i và đ ng v t.
1.1.2. C ch kháng thu c c a MRSA
Trong chi n tranh th gi i th hai, penicillin đ
c đ a vào s d ng lâm sàng, S. aureus
lúc này còn r t nh y v i kháng sinh. Tuy nhiên, ch vài n m sau đó các ch ng S. aureus
kháng penicilin đã đ
c phát hi n [20]. Hi n nay, S. aureus kháng penicillin - PRSA
(Penicillin Resistant S. aureus) chi m kho ng 90 % , MRSA dao đ ng t 30-50 % trong
t ng s các ch ng S. aureus đ
c phân l p [21].
Methicilin là penicilin bán t ng h p, MRSA kháng methicillin xu t hi n 2 c ch kháng
ph bi n: m t là siêu bi u hi n -lactamases, hai là thay đ i d ng bình th
Protein g n Penicillin (PBPs). Bi u hi n enzyme -lactamase đ
ng c a
c ki m soát b i operon
bla. Trong Operon bla, blaZ là vùng gen mã hóa cho -lactamase, và hai protein đóng
vai trị là các protein đi u hịa là: blaI (nhân t
c ch ) và blaR1 (nhân t ho t hóa). BlaI
c ch s bi u hi n c a blaZ b ng vi c g n v i promoter. BlaR1 t n t i nh là protein
xuyên màng; khi vùng bên ngoài t bào g n v i -lactam, thì vùng bên trong t bào s
đ
c gi i phóng và phân gi i BlaI, vi c này cho phép bi u hi n blaZ. C ch kháng th
4
