CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN pdf

1
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN
LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT
GEN
GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà
2
I. Đặt vấn đề
II. Nội dung
II.1. Đôi nét về Listeria
II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes
II.3. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene
III. Kết luận
IV. Tài liệu tham khảo
3
I. Đặt vấn đề

Trong số sáu loại Listeria, chỉ có Listeria
monocytogenes gây bệnh Listeriosis rất phổ
biến ở cả người và động vật. Đây là một loại
bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử
vong, đặc biệt là đối với những người có hệ
miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh,
người già yếu.

Listeria monocytogenes tồn tại trong thực
phẩm nên rất dễ lây nhiễm cho người đòi hỏi
phải có công tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt
khe.
4


Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn
thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên
một số môi trường chuyên biệt và xác định vi
khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa…
Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm
nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất
khó khăn, tốn kém và mất thời gian. Nhờ vậy mà
các kỹ thuật gene với những ưu điểm nổi trội
như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng
để chuẩn đoán Listeria monocytogenes.
5
II. Nội dung
II.1.Đôi nét về Listeria
Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae
gồm những trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có
lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có
phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính.
Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men
đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia
súc và người, trong đó có loài Listeria
monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền
nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân
trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa,
dê, cừu, heo, chuột, kể cả người.
6
Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài
1. Listeria monocytogenes
2. L. innocua
3. L. ivanovii
4. L. seeligeri

5. L. welshimeri
6. L. grayi
7
II.2. Giới thiệu chung về Listeria
motocytogenes
8
Phân bố và cách lây lan

L. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó
có trong đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh
dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe

Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của
vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ
tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống. Nếu
như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua
đường mắt và mũi.
9
Hình thái và nhuộm màu

L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai
đầu tròn, Gram dương. Trong môi trường nuôi cấy, khi tế
bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng
trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5×1-2 µm)
lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi
ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao
dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử, không tạo giáp
mô, có khả năng di động. Ở 20-25
0
C vi khuẩn di động

mạnh nhất. Ở 37
0
C vi khuẩn di động nhờ một chiêm
mao ở đầu.
10

Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi
khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ
nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có
thể dùng phản ứng Catalase để phân biệt. Trong
canh 3-6 giờ ở 37
0
C vi khuẩn có dạng trực, nuôi
cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay
hơn(đặc biệt chủng R). Sự di động của Listeria
dùng để phân biệt với Erysipelothrix.
11
Đặc tính nuôi cấy và yêu cầu tăng
trưởng
12
•
Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm
khí. Nhiệt độ thích hợp 30-37
0
C, pH 7,2-7,4 phát
triển trên môi trường nhưng thường sử dụng
môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10%
CO
2
cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường

kính 0,5-1mm và gây dung huyết.
•
Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng,
trắng mờ và có màu xanh lam (màu blue-green)
khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng.
•
Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo
vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin
sau 24-48 giờ.
•
Môi trường Gelatin không gây tan chảy.
13
Đặc tính sinh hóa
Lên men chậm các loại đường như glucose,
rhamnose, salicin, levulose. Không lên men
mannitol, xylose, lactose, saccarose. Phản ứng
Catalaza dương tính.
14
Sức đề kháng

Vi khuẩn bị diệt ở 60
0
C trong 30 phút và 72
0
C
trong 15 giây. Vi khuẩn đề kháng với sự khô
hạn. Có thể sống sót trong thực phẩm và đất
nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông
thường.


Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng
tetracycline cho kết quả tốt nhất. Người ta có thể
kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol
trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones.
Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều
trị bệnh cho người.
15
Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes
phức tạp, được chia thành 16 serotype căn bản
dựa trên kháng nguyên O và H.

Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia
thành 14 loại, ký hiệu 1-14.

Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia
làm 4 loại:a, b, c, d. Hiện nay có 3 chủng là
nguyên nhân gây bệnh chính có cấu trúc kháng
nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b
16
SEROTYPE
ANTIGENS
O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE)
1a
1b
I, II, (III)
I, II, (III)
A, B
A, B, C
2 I, II, (III) B, D

3a
3b
II, (III), IV
II, (III), IV
A, B
A, B, C
4a
4b
4ab
4c
4d
4e
(III), (V), VII, IX
(III), V, VI
(III), V, VI, VII, IX
(III), V, VII
(III), VI, VIII
(III), V, VI, VIII, IX)
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C
17
Độc tố
•
Vi khuẩn sản sinh ra men hemolysinase có tính
kháng nguyên protein. Cytolysin có tác dụng diệt
tế bào. Trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có

lipo-polysaccharid độc đối với thỏ.
18
Cơ chế gây bệnh
Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi
khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào
khác trong cơ thể con người. Vi khuẩn lớn lên
trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo
thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ
tế bào và đẩy sang tế bào liền kề. Khi đó vi
khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề
đó.
19
20

Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra
một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi
khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh

Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế
bào khỏe mạnh thông thường căng ra. Tình
trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn
chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào
chưa nhiễm bệnh liền kề.

Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton
phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi
khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi
độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm
bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi
khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó

lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ
dàng hơn.
21
22
Chẩn đoán bằng phương pháp truyền
thống
Nuôi cấy trên môi trường LSA
Bệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảy…
Nhuộm Gram
Chọn khuẩn lạc
Test ANTON
Tiêm não thỏ
(chết sau 2-3 ngày)
Kiểm tra máu thỏ(Bạch cầu đơn nhân
tăng 420-820/mm
3
)
Thỏ bị nhiễm Listeria
23
Tình hình dịch bệnh Listeriosis
•
Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nói đến
cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980
vi khuẩn L. monocytogenes mới được chính thức xác
nhận là tác nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm.
•
Từ tháng một đến tháng tám năm 1985, tại Mỹ có
một đợt bùng phát khác với 142 ca nhiễm bệnh
Listeriosis.
•

Vào những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết
có một trận dịch bệnh này từ bánh mì kẹp xúc xích nóng
và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến ít nhất
101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai
nhi bị sinh non.

24
•
Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã
tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những
nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề.
•
Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều
bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn
Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca
tử vong và 3 ca hỏng bào thai.
•
Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và
thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm
soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể
loại bỏ được bệnh hoàn toàn. Theo Trung tâm y tế dự
phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh Listeriosis
nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong. Người
có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực
phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn.
•
Năm 2008 ổ dịch Listeriosis ở Canada nguyên nhân từ
nhà máy Maple Leaf Foods ở Toronto, Ontario làm hai
mươi hai người chết và có tổng số 57 trường hợp nhiễm
bệnh.

25
II.3. Chuẩn đoán Listeria
monocytogenes bằng kỹ thuật gene
Dựa tên 3 gene: gene DTH-18, gene listeriolysin O (hly A)
và iap