CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

CƠNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
ỨNG DỤNG

TS. Nguyễn Thanh Bình


LỜI NĨI ĐẦU

Hiện nay cơng nghệ sinh học đóng một vai trị khá lớn trong việc kết hợp các
quy trình và thiết bị kỹ thuật ở mức độ tế bào vi sinh vật, tế bào động thực vật để sản
xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi
ích, nhu cầu của con người, phát triển kinh tế - xã hội và đồng thời góp phần vào bảo
vệ mơi trường sống.
Sự thay đổi về điều kiện sống qua biến đổi khí hậu toàn cầu, sự gia tăng về dân
số đã thách thức khoa học công nghệ, nhất là công nghệ sinh học ứng dụng, để giải
quyết việc tăng nguồn lương thực có nguồn gốc từ động thực vật, giải quyết các vấn đề
về y tế, đồng thời giảm những tác động tiêu cực đến môi trường do những hoạt động
nông nghiệp gây ra.
Nội dung trong quyển sách đã được tổng hợp từ nhiều nguồn sách, tạp chí khoa
học có uy tín trên thế giới, và một số cơng trình nghiên cứu của tác giả sách được
cơng bố trong và ngồi nước. Quyển sách cung cấp những kiến thức cơ bản về các kỹ
thuật sinh học, khả năng ứng dụng, các kỹ thuật tác động trên tế bào và các thành
phần tế bào phục vụ thực tiển trong quy trình sản xuất. Đồng thời giới thiệu một số
phương pháp giải quyết các vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải quyết thức ăn
sinh học trong chăn nuôi... bằng những tác động đến kỹ thuật sinh học ở mức độ tế
bào mà hiện nay ở Việt Nam còn thiếu những tài liệu chuyên ngành bằng tiếng việt.
Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn đọc và hy vọng sẽ là nguồn tài liệu tham
khảo, học tập, nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất.

Trân trọng cám ơn Quý giáo sư, đồng nghiệp, các chuyên gia trong lĩnh vực
nghiên cứu; GS. TS. Masahi Miyake- Nguyên Hiệu trưởng Trường Đào tạo Sau đại
học Đại học Kobe - Nhật Bản đã tạo điều kiện, động viên, cung cấp tài liệu để tác giả
hoàn thành cuốn sách này.

Tác giả
TS. Nguyễn Thanh Bình

1


MỤC LỤC
CHƯƠNG I: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO
DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC ........................... 9
PHẦN 1. Giới thiệu ................................................................................................. 9
PHẦN 2. Tổng quan ................................................................................................ 9
1.1. Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp ....................................................... 9
1.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng (Gene cloning) .... 10
1.2.1. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp .............................................................................. 10
1.2.2. Tạo dòng gene.............................................................................................. 10
1.2.3. Các bước thực hiện ...................................................................................... 11
1.2.4. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp ............................ 12
1.2.4.1. Các enzyme giới hạn ................................................................................. 12
1.2.4.2. Các enzyme polymerase ............................................................................ 13
1.2.4.3. Các enzyme nối (Ligase) ........................................................................... 13
1.2.4.4. Các nuclease ............................................................................................. 14
1.2.5. Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp .................................................... 14
1.2.5.1. Các vector plasmid .................................................................................... 15
1.2.5.2. Các vector phage ....................................................................................... 16
1.2.5.3. Cosmid vector ........................................................................................... 16

1.2.5.4. Các vector khác ......................................................................................... 17
1.2.6. Các loại tế bào chủ ....................................................................................... 17
1.2.6.1. Tế bào chủ nhân sơ ................................................................................... 17
1.2.6.2. Tế bào chủ nhân chuẩn .............................................................................. 18
1.2.7. Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA ............................................................... 19
1.2.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp ............................................................................... 19
1.2.7.2. Tách dòng DNA tái tổ hợp ........................................................................ 19
1.2.7.3. Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gene ....................................... 20
1.3. Một số ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp và cloning gene trong điều chế
sản phẩm y sinh học............................................................................................... 20
1.3.1. Human alpha antitrypsin .............................................................................. 20
1.3.1.1. Sơ lược về bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT) .......................... 20
1.3.1.2. Sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene ................................. 21
1.3.2. rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine
growth hormone) .................................................................................................... 22
1.3.2.1. Giới thiệu về rBGH/rBST ......................................................................... 23
1.3.2.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất rBST ................................... 23
1.3.2.4. Ảnh hưởng của rBST đến khả năng sản xuất sữa ở bị ............................... 24
1.3.2.5. Lợi ích và rủi ro khi sử dụng BST ............................................................. 25
PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 27
CHƯƠNG II: MƠ DA DÙNG TRONG DỊNG HÓA ....................................... 29
2


Phần A: MƠ DA DÙNG TRONG DỊNG HĨA ................................................ 29
PHẦN 1. Giới thiệu ............................................................................................... 29
PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 29
2.1. Các lớp tế bào ở da ......................................................................................... 29
2.1.1. Lớp biểu bì................................................................................................... 30

2.1.1.1. Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum) ................ 30
2.1.1.2. Lớp gai (stratum spinosum) ....................................................................... 31
2.1.1.3. Lớp hạt (Stratum granulosum)................................................................... 31
2.1.1.4. Lớp bóng (Stratum lucidum) ..................................................................... 31
2.1.1.5. Lớp sừng (Stratum corneum)..................................................................... 31
2.1.2. Lớp bì .......................................................................................................... 32
2.1.3. Lớp hạ bì...................................................................................................... 32
2.2. Tế bào gốc da.................................................................................................. 32
2.2.1. Tế bào gốc da ở lớp biểu bì .......................................................................... 33
2.2.1.1. Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc biểu bì ............................... 36
2.2.2. Nang lơng tóc............................................................................................... 40
2.2.2.1. Sự hình thành nang lơng............................................................................ 40
2.2.2.2. Chu kỳ lơng tóc và các tế bào gốc ở nang lông .......................................... 41
2.2.2.3. Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc nang .................................. 42
2.2.3. Tuyến nhờn (SG) ......................................................................................... 45
2.3. Vai trò của tế bào gốc ở da .............................................................................. 46
PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49
Phần B: DỊNG HĨA BỊ .................................................................................... 50
PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................... 50
PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 50
2.1. Những nghiên cứu cơ bản trong dịng hóa bị .................................................. 50
2.2. Kỹ thuật dịng hóa ........................................................................................... 52
2.2.1. Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận ............................................................... 52
2.2.2. Bước 2: Xử lý tế bào cho ............................................................................. 53
2.2.3. Bước 3: Tái kết cấu ...................................................................................... 54
2.2.4. Bước 4: Nuôi cấy in vitro nỗn tái kết cấu ................................................... 54
2.2.5. Bước 5: Cấy phơi vào tử cung "mẹ nuôi" để cho phát triển thành bào thai 55
2.3. Dịng hóa từ tế bào thai ................................................................................... 55
2.3.1. Tế bào phôi lấy từ thai ................................................................................. 55

2.3.2. Tế bào sinh dưỡng lấy từ thai ....................................................................... 55
2.4. Dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành................................................... 55
2.4.1. Chiến lược chuyển nhân tế bào sinh dưỡng và chu kỳ tế bào ........................ 55
2.4.2. Đồng pha của tế bào cho .............................................................................. 56
2.4.3. Các loại tế bào sinh dưỡng được sử dụng ..................................................... 56
2.5. Hiệu quả của dịng hóa bị ............................................................................... 56
2.5.1. Dịng hóa từ phơi ......................................................................................... 56
3


2.5.1.1. Phát triển in vitro ...................................................................................... 56
2.5.1.2. Phát triển in vivo ....................................................................................... 57
2.5.1.3. Hiệu quả chung ......................................................................................... 57
2.5.1.4. Những yếu tố giới hạn ............................................................................... 57
2.5.2. Hiệu quả của dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng ................................................ 58
2.5.2.1. Phát triển in vitro ...................................................................................... 58
2.5.2.2. Phát triển trước khi sanh............................................................................ 58
2.5.2.3. Sức sống của bị dịng hóa ......................................................................... 59
PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 61
Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN ...................................................................... 62
2.1. Khái niệm tái lập trình nhân ............................................................................ 62
2.2.Tái lập trình nhân của tế bào sinh dưỡng ........................................................... 62
2.2.1.Tái lập trình nhân bằng chuyển nhân ............................................................. 62
2.2.2.Tái lập trình nhân bằng dung hợp tế bào ....................................................... 64
2.2.3.Tái lập trình nhân bằng dịch chiết tế bào ....................................................... 66
2.2.4.Cấy ghép tế bào ............................................................................................ 66
2.2.5.Tái lập trình nhân bởi các phân tử nhỏ .......................................................... 67
2.3.Các yếu tố kiểm sốt q trình tái lập trình nhân .............................................. 68
2.3.1.Các yếu tố ngồi tế bào ................................................................................. 69

2.3.2.Các nhân tố bên trong ................................................................................... 71
2.4.Giới hạn về sinh học và kỹ thuật trong tái lập trình nhân .................................. 74
2.4.1.Sự bất hoạt NST X ........................................................................................ 74
2.4.2.Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) ........................................................ 75
2.4.3.Sự ngắn dần của telomere ............................................................................. 75
2.4.4.Sự đột biến .................................................................................................... 76
2.4.5.Thất bại trong quá trình in dấu bộ gene ......................................................... 76
2.4.6.Sai sót về mặt kỹ thuật .................................................................................. 76
2.5.Khiếm khuyết của động vật tạo dịng vơ tính ................................................... 77
Kết luận ................................................................................................................. 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 78
Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO ............................................... 80
PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................... 80
PHẦN 2. Nội dung ................................................................................................ 80
2.1. Những nghiên cứu bước đầu ........................................................................... 80
2.2. Những sự kiện phân tử của tái lập trình nhân trên heo ..................................... 81
2.2.1. Định nghĩa chung ......................................................................................... 81
2.2.2. Tái lập trình nhân trên heo ........................................................................... 81
2.2.2.1. Sự phồng lên của nhân chuyển .................................................................. 81
2.2.2.2. Sự tổng hợp mRNA.................................................................................. 82
2.2.2.3. Một số gene tham gia q trình tái lập trình .............................................. 84
2.3. Hoạt hóa trứng ................................................................................................ 86
4


2.3.1. Chu kỳ tế bào ............................................................................................... 86
2.3.2. Cơ chế hoạt hóa trứng .................................................................................. 86
2.4. Sự phát triển in vitro của phôi chuyển nhân .................................................... 87
2.5. Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân ................................................................... 88
2.6. Ứng dụng tạo đời con bằng kỹ thuật chuyển nhân ........................................... 89

PHẦN 3. Kết luận.................................................................................................. 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 92
CHƯƠNG III: LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA
(EPIGENETIC) ................................................................................................... 93
3.1.Định nghĩa epigenetic ...................................................................................... 93
3.2.Cơ sở phân tử của epigenetic ........................................................................... 93
3.3.Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu hiện gene ....................................... 95
3.4.Các vấn đề cần quan tâm.................................................................................. 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 98
CHƯƠNG IV: XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO ........................... 99
4.1. Khái niệm ....................................................................................................... 99
4.2. Phân loại tế bào gốc ........................................................................................ 99
4.3. Đặc điểm sinh học......................................................................................... 101
4.3.1. Tính vạn năng ............................................................................................ 101
4.3.2. Tính tự làm mới ......................................................................................... 101
4.3.3. Tính mềm dẻo ............................................................................................ 101
4.4. Những ứng dụng tính đa năng của tế bào ...................................................... 101
4.4.1. Trong nghiên cứu cơ bản............................................................................ 101
4.4.2. Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) ................................................ 102
4.5. Phương pháp thu nhận tế bào gốc.................................................................. 103
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 104
CHƯƠNG V: CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC
LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT ....................................................................... 106
5.1. Protein điều hịa ............................................................................................ 106
5.2. Methyl hóa DNA .......................................................................................... 109
5.3. Đoạn DNA giàu CG (vùng CpG (CG) hoặc đảo CpG) .................................. 113
5.4. Sự in dấu di truyền và biểu hiện gene theo nguồn gốc ................................... 114
5.5. Kiểm soát sau phiên mã (post-transcription control) ..................................... 116
5.5.1. Biến đổi sau phiên mã ở đầu 5’ và 3’ của tiền mRNA (pre-mRNA) ........... 116
5.5.2. Quá trình trưởng thành của tiền mRNA...................................................... 118

5.5.3. Sự vận chuyển mRNA trưởng thành ra khỏi nhân – Đời sống mRNA, phân
hủy mRNA .......................................................................................................... 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 122
CHƯƠNG VI: KỸ THUẬT SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN TỶ LỆ SINH SẢN
VÀ CHẤT LƯỢNG THƯƠNG PHẨM ............................................................ 123
6.1. Cấy truyền phôi và bảo quản phôi ................................................................. 123
6.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cấy truyền phôi (CTP)................................... 123
5


6.1.2. Cấy truyền phôi (Embryo Transfer - ET).................................................... 124
6.1.3. Kỹ thuật cấy truyền phơi trên bị ................................................................ 125
6.1.4. Bảo quản phôi ............................................................................................ 126
6.1.5. Ý nghĩa của công nghệ bảo quản và chuyển cấy phôi ................................. 127
6.1.6. Ứng dụng chuyển cấy và bảo quản phôi trong chăn nuôi ............................ 128
6.2. Công nghệ thụ tinh nhân tạo (Artificial Insemination - AI) ........................... 128
6.3. Kỹ thuật PCR trong xác định giới tính phơi .................................................. 129
6.3.1. PCR ........................................................................................................... 129
6.3.2. Nguyên tắc của PCR .................................................................................. 130
6.3.3. Kỹ thuật xác định giới tính phơi bị bằng PCR ........................................... 130
6.3.4. Ý nghĩa xác định giới tính trong chăn nuôi ................................................. 131
6.4. Đánh giá chất lượng tinh trùng bằng kỹ thuật Hypoosmotic swelling test
(HOST)................................................................................................................ 133
6.4.1. Định nghĩa ................................................................................................. 133
6.4.2. Phương pháp .............................................................................................. 133
6.4.3. Ứng dụng ................................................................................................... 133
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 135
CHƯƠNG VII: KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC ........................................... 136
7.1. Khái niệm chung ........................................................................................... 136

7.1.1. Sinh vật biến đổi gene ................................................................................ 136
7.1.2. Sự phát triển của khoa học chuyển gene ở động vật ................................... 137
7.2. Công nghệ tạo động vật chuyển gene ............................................................ 137
7.2.1. Tách chiết, phân lập gene mong muốn và tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế
bào động vật ........................................................................................................ 138
7.2.1.1. Tách chiết, phân lập gene mong muốn .................................................... 138
7.2.1.2. Tạo tổ hợp gene chuyển biểu hiện trong tế bào động vật ......................... 139
7.2.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene ................................................................ 139
7.2.3. Chuyển gene vào động vật ......................................................................... 140
7.2.3.1. Phương pháp vi tiêm ............................................................................... 140
7.2.3.2. Phương pháp xung điện ........................................................................... 141
7.2.3.3. Phương pháp tiêm trực tiếp ..................................................................... 142
7.2.3.4. Phương pháp lây nhiễm retrovirus ........................................................... 142
7.2.3.5. Sử dụng súng bắn gene............................................................................ 142
7.2.3.6. Sử dụng tế bào gốc phơi .......................................................................... 143
7.2.3.7. Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome chuyển vào tế bào hay phôi ...... 144
7.2.4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm ................................................................ 144
7.2.5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gene .................................. 144
7.2.5.1. Phương pháp thẩm tách DNA.................................................................. 145
7.2.5.2. Phương pháp PCR ................................................................................... 145
7.2.6. Tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên tục.................................... 145
7.3. Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gene............................ 146
6


7.3.1. Chuột chuyển gene ..................................................................................... 146
7.3.2. Heo chuyển gene ........................................................................................ 146
7.3.3. Gà chuyển gene.......................................................................................... 147
7.3.4. Dê biến đổi gene ........................................................................................ 148
7.3.5. Chống sốt rét bằng muỗi biến đổi gene ...................................................... 148

7.3.6. Điều trị thành công liệu pháp gene cho người mù ...................................... 148
Kết luận ............................................................................................................... 148
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 149
PHẦN THAM KHẢO ....................................................................................... 150
CHƯƠNG I: L-LYSINE TRONG TỔ HỢP KHẨU PHẦN THỨC ĂN ......... 150
PHẦN 1. Mở đầu ................................................................................................. 150
PHẦN 2. Tổng quan về L-lysine .......................................................................... 150
1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 150
1.2. Vai trò của lysine .......................................................................................... 151
1.3. Cơ chế hoạt động của lysine.......................................................................... 151
1.4. Các trường hợp cần bổ sung lysine trong khẩu phần thức ăn ......................... 152
1.4.1. Trên người: Thực phẩm chức năng, điều trị bệnh. ...................................... 152
1.4.2. Vật nuôi: Bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm ................................... 153
1.5. Sản xuất lysine .............................................................................................. 155
1.5.1. Lịch sử quá trình sản xuất lysine ................................................................ 155
1.5.2. Phương pháp sản xuất L-lysine .................................................................. 155
PHẦN 3. Kết luận................................................................................................ 159
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 160
CHƯƠNG II: DÒNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TẠO CHẤT BỔ SUNG
TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ BACTERIOCIN KHÁNG KHUẨN . 161
2.1. Biến đổi dòng vi khuẩn ................................................................................. 161
2.2. Bacteriocin.................................................................................................... 161
2.2.1. Khái niệm về Bacteriocin ........................................................................... 161
2.2.2. Hoạt động của Bacteriocin ......................................................................... 162
2.2.3. Cơ chế hoạt động ....................................................................................... 162
2.2.4. Ứng dụng ................................................................................................... 162
2.2.4.1. Bảo quản lương thực – thực phẩm ........................................................... 162
2.2.4.2. Bacteriocin trong chăn nuôi..................................................................... 166
2.2.4.3. Một số sản phẩm trên thị trường .............................................................. 166
2.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic .............................................................. 169

2.4. Lên men lactic .............................................................................................. 170
2.5. Ứng dụng lactobacillus ................................................................................. 172
2.5.1. Sản xuất probiotic ...................................................................................... 172
2.5.2. Sản xuất ACIDIFIER ................................................................................. 176
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 178
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 178
CHƯƠNG III: CHUẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM VÚ Ở BÒ SỮA ....................... 179
7


3.1. Bệnh leukocyte trên bò sữa Holstein Friesian............................................... 179
3.1.1. Khái niệm bệnh leukocyte .......................................................................... 179
3.1.2. Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh leukocyte .............................................. 180
3.1.2.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) .............................................. 180
3.1.2.2. Kỹ thuật lai phân tử Southern blot ........................................................... 185
3.2. Bệnh viêm vú trên bò sữa.............................................................................. 187
3.2.1. Khái niệm bệnh viêm vú ............................................................................ 187
3.2.2. Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú ................................................ 188
3.2.2.1. Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) ...................... 188
3.2.2.2. Máy đếm tế bào (flow cytometer)............................................................ 190
3.2.2.3. Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) ....................... 192
3.2.2.4. Một số phương pháp khác chẩn đoán viêm vú tiềm ẩn bò sữa ................. 196
Kết luận ............................................................................................................... 196
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 197

8


CHƯƠNG I
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ

ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC
PHẦN 1. Giới thiệu
Những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sức khỏe, trong
đó có sự đóng góp những tiến bộ của khoa học hiện đại. Trong đó bao gồm các lĩnh
vực như công nghệ gene và công nghệ chuyển gene đã phát hiện ra những liệu pháp
gene mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp (sữa của bị chuyển gene cung cấp
một nguồn protein an tồn, có giá trị cao hoặc các chế phẩm khác có thể điều trị bệnh
cho người như sản xuất men Alpha antitrypsin từ cừu biến đổi gene...).
Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gene lạ vào vi
khuẩn và bắt nó biểu hiện gene. Tuy nhiên, có những protein phục vụ cho nhu cầu của
con người ngày càng đòi hỏi phức tạp và cơ thể vi khuẩn không biểu hiện được và cần
đến động vật chuyển gene. Sản phẩm thành công đầu tiên của con người về sản xuất
sản phẩm sinh học thông qua chuyển gene là Insulin và hoocmon sinh trưởng vào vi
khuẩn E. coli.
PHẦN 2. Tổng quan
1.1. Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp
Năm 1972, các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường Đại học
Stanford (Mỹ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện bằng cách sử dụng
đặc tính cắt của enzyme giới hạn (Restriction enzyme) và khả năng nối các mạch DNA
với nhau của enzyme nối ligase. Nhờ kỹ thuật này vật chất di truyền thường là một hay
vài gene có thể lắp ghép vào phân tử DNA có nguồn gốc khác (Ví dụ: lắp ghép gene
của động vật, thực vật vào plasmid của vi khuẩn hoặc vào phage  ) để hình thành
DNA tái tổ hợp. Khi các cơ thể DNA tái tổ hợp được tạo thành có thể được chuyển từ
cơ thể này (cơ thể cho) sang cơ thể hoặc tế bào khác (cơ thể nhận hoặc tế bào nhận).
Điều cơ bản và quan trọng là các gene tái tổ hợp này vẫn duy trì chức năng cũ của nó
trong cơ thể, hoặc tế bào nhận.
Năm 1973, các nhà khoa học đã nối nhiều đoạn DNA vào plasmid được tách ra từ
vi khuẩn Escherichia coli (E. coli). Plasmid này có thể hoạt động, tự sao chép khi đưa
vào tế bào vi khuẩn E. coli, từ đó tạo ra công nghệ quan trọng trong công nghệ di truyền
là tách dòng gene.

Thành tựu đầu tiên của kỹ thuật DNA tái tổ hợp là việc sản xuất ra kích thích tố
sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật nhận là E. coli. Các
nhà khoa học đưa được gene mã hóa hGH vào E. coli. E. coli có DNA tái tổ hợp đã
sản sinh ra một lượng rất lớn kích thích tố sinh trưởng người và được sử dụng vào thực
tiễn y học.
Tiếp đó, vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, nhờ kỹ thuật DNA tái tổ
hợp, người ta đã sản xuất được interferol, sản xuất protein chống đông máu…
9


1.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng gene (Gene
cloning)
1.2.1. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp
DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gene) là DNA được tạo
ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được
tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một
loài, hoặc của các loài khác nhau. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gene
(cloning gene) do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn gene xác định.
Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology). Hệ thống các
phương pháp phịng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ một sinh vật để ghép nối
vào DNA của một sinh vật khác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Phân tử này được đưa
vào các sinh vật khác nhau để tạo ra những giống chủng vi sinh vật, thực vật và động
vật mới có những phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản xuất và
đời sống con người. Cơng nghệ này có ứng dụng rộng rãi trong y học, dược học, nông
nghiệp và nhiều ngành công nghiệp khác.
Ngày nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã tạo ra các đối tượng sản
xuất thích hợp hơn, có thể thay đổi cả về lượng và chất so với công nghệ sinh học
truyền thống trước đây bằng cách thay đổi gene của chúng và mở ra những triển vọng
to lớn cho các lĩnh vực hoạt động của cơng nghệ sinh học.
1.2.2. Tạo dịng gene

Gene là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của tế bào.
Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và mảnh nằm trong nhân, bao gồm chủ yếu là
DNA. Thông tin di truyền được bảo quản trong một chuỗi trình tự của các base
nucleotide gồm có một đoạn DNA.
Trong kỹ thuật gene, tạo dịng gene là một bước rất quan trọng vì tách chiết được
một gene có thể giúp đánh giá trình tự nucleotide của nó. Từ đó có thể xác định được
những giới hạn bên trong một gene. Không chỉ vậy, với nguồn gene có được, nhà khoa
học có thể so sánh trình tự DNA giữa các gene để làm rõ hơn tiến hóa của gene hoặc
dịch mã trình tự DNA của một gene thành trình tự amino acid nhờ vào bảng mã di
truyền qua đó có thể dự đốn được cấu trúc của protein được mã hóa cũng như chức
năng của gene đó.
Bên cạnh đó, nhờ kỹ thuật gene, nhà khoa học có thể chuyển gene mục tiêu vào
một cá thể tạo ra cá thể chuyển gene. Cá thể chuyển gene được dùng cả trong nghiên
cứu về các tiến trình sinh học ở phịng thí nghiệm cũng như ứng dụng trong phát triển.
Có thể hiểu tạo dòng gene (còn gọi là nhân dòng, tách dịng hay dịng hóa) là sự
sản sinh nhiều bản sao của một phân tử DNA, thường là phân tử DNA tái tổ hợp trong
plasmid vector, bằng cách sao chép phân tử đó trong một vật chủ thích hợp chẳng hạn
như vi khuẩn E. coli.

10


1.2.3. Các bước thực hiện
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA hay còn gọi là kỹ thuật tạo dòng gene được thực hiện
qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi. Thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ
yếu sau:
Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gene và ni tế bào cho (Ví
dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA.
Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được gọi là phân
lập gene.

Bước 3: Cắt cả hai loại DNA (DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một
loại enzyme giới hạn (restriction enzyme-RE). Ví dụ: sử dụng enzyme giới hạn
endonuclease EcoRI tạo ra các đầu so le.
Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi
một loại enzyme giới hạn như đã nêu trên.
Bước 5: Bổ sung enzyme để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh.
Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E. coli) và nhân
dòng.
Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo
dõi hoạt động, biểu hiện của gene thông qua sản phẩm của gene lấy từ tế bào cho.

11


Hình 1.1. Các bước tái tổ hợp DNA
(Nguồn />
1.2.4. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp
1.2.4.1. Các enzyme giới hạn
Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra DNA tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần
phải có cơng cụ cắt plasmid hình vịng và đoạn DNA của tế bào rồi cho chúng nối lại
với nhau. Công cụ cắt DNA là các enzyme giới hạn.
 Khái niệm về enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất
định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Tùy theo phương thức cắt
và nguồn gốc của enzyme giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzyme
giới hạn đó.
 Phân loại enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzyme giới hạn
thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ di truyền thuộc
kiểu II. Các enzyme này cắt bên trong mạch DNA (không phân hủy từ 2 đầu của

DNA) nên còn được gọi là enzyme endonuclease. Enzyme giới hạn kiểu II thực chất là
endonuclease giới hạn kiểu II.
12


Các enzyme giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzyme giới hạn kiểu II cũng như
các enzyme giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzyme giới hạn được ghép
bởi chữ cái đầu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật
mà enzyme được tách chiết. Những chữ và số La Mã tiếp theo là tên của chủng và
dịng của lồi sinh vật cụ thể đã tách chiết enzyme:
Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, lồi coli, chủng Ry 13) Một số loại khác
như E. coRV, BamHI, HaeIII, Smal…
1.2.4.2. Các enzyme polymerase
Các enzyme polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các acid nucleic (DNA,
hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong công nghệ di truyền.
Các DNA polymerase (Enzyme DNA polymerase I, enzyme T4 DNA polymerase,
enzyme Taq polymerase…). Hiện nay cịn có nhiều loại DNA polymerase khác lưu
hành trên thị trường như T7 DNA polymerase, Vent DNA polymerase…
Các enzyme RNA polymerase: có ba loại enzyme RNA polymerase thường được
dùng trong thực tế: SP6 RNA polymerase, T3 RNA polymerase và T7 RNA polymerase.
Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase): có khả năng tổng hợp DNA một
mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mRNA, hoặc từ một đoạn polynucleotite
được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà
có thể tổng hợp được hầu hết các gene riêng biệt nào đó nếu như có mặt mRNA của
gene đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và
được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào
plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dịng c-DNA. Nếu cDNA có nguồn gốc từ
một gene thì ta tạo được dịng gene. Trong trường hợp mRNA trưởng thành khi đã ở
ngồi nhân thì ta sẽ thu được dịng gene chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Khơng
có đoạn khơng mã hóa (intron).

1.2.4.3. Các enzyme nối (Ligase)
Enzyme ligase là enzyme nối quan trọng trong tế bào. Các enzyme này xúc tác
hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn acid nucleic với nhau. DNA
ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase là enzyme chủ yếu được sử
dụng rộng rãi. Có một số loại enzyme nối khác nhau, nhưng enzyme T4 DNA ligase là
enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong các phịng thí nghiệm về cơng nghệ
di truyền.
Có 3 loại enzyme nối thường dùng trong công nghệ di truyền. Enzyme E. coli
DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E. coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự
DNA có đầu so le. Enzyme T4 DNA ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào
E. coli, có chức năng giống như E. coli DNA ligase nhưng lại có khả năng nối hai
đoạn trình tự DNA có đầu bằng và là enzyme nối được ưa chuộng nhất hiện nay.
Enzyme T4 RNA ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, có khả năng nối hai
trình tự RNA bằng các liên kết phosphodiester.
13


Ngoài các loại enzyme nối kể trên, hiện nay người ta cịn sử dụng các đoạn nối
(đầu dính–adaptor) cho các enzyme cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn DNA
do có các enzyme giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn enzyme cắt
đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.
1.2.4.4. Các nuclease
Các enzyme nuclease phân hủy các acid nucleic bằng cách làm đứt các liên kết
phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngoài các enzyme
giới hạn đã nêu ở trên cịn có các loại nuclease chủ yếu sau:
Enzyme DNAase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy
phân các liên kết ngay sau một bazơ nitơ ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu
nhiên.
Enzyme S1 nuclease (endonuclease) là enzyme tách chiết từ nấm mốc Aspegillus
oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của DNA và

khơng có khả năng cắt nội liên kết.
Enzyme exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo
thành các đoạn DNA có đầu 5’ nhơ ra.
Enzyme ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzyme này thường được sử dụng để loại
bỏ RNA trong hỗn hợp DNA và RNA.
Enzyme ARNase H dùng để loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA-RNA, nhất
là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cDNA, từ đó tạo nên
phân tử cDNA kép.

1.2.5. Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp
Muốn chuyển được gene mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận),
hoặc tách dịng gene, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gene (vector chuyển gene).
Vector chuyển gene là phân tử DNA nhỏ có khả năng mang được gene cần thiết.
Vector chuyển gene phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau:
- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà tồn tại
độc lập trong tế bào.
- Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp
các đoạn gene lạ.
- Có trình tự khởi điểm (promoter).
- Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào
chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gene kháng chất kháng sinh, hoặc
gene tổng hợp chất màu.
Để đảm bảo cho được tính bền vững của DNA tái tổ hợp, ngồi các đặc điểm trên
vector chuyển gene cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dịng dễ
thực hiện như:
14


- Chứa các gene vơ hiệu hóa các đoạn DNA khơng mong muốn bị gắn nhầm vào.
- Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm

bảo sự khuếch đại của gene lạ mong muốn được gắn vào.
Giá trị của các vector chuyển gene ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho mục đích
sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gene toàn năng, mà cần phải lựa chọn
vector chuyển gene cho từng đối tượng và tùy thuộc và kích thước của đoạn gene cần
được chuyển.
Các vector chuyển gene có các ứng dụng chủ yếu:
 Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự, hoặc gene để tạo nhiều bản sao giống
nhau.
 Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA hoặc một gene.
 Chuyển gene vào tế bào vi sinh vật khác (vật chủ nhận).
 Sản xuất các RNA.
 Sản xuất protein được tổng hợp từ gene đã được tạo dịng. Do tính chất quan
trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gene ngày càng được khám phá, hồn
thiện khơng ngừng. Từ những vector chuyển gene sẵn có trong tự nhiên như plasmid ở
vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều
mục đích khác nhau, thậm chí tạo ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo.
1.2.5.1. Các vector plasmid
Mỗi tế bào vi khuẩn có trung bình khoảng 20 plasmid. Các plasmid có thể chia
thành 2 nhóm:
 Tiếp hợp
 Khơng tiếp hợp
Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thơng
qua q trình tiếp hợp. Q trình này địi hỏi các chức năng của các đoạn đặc thù như
tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid. Các plasmid khơng tiếp hợp thì
khơng tự truyền đi được để vào vật nhận. Plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao
chép một cách thoải mái và tồn tại trong tế bào với số bản sao lớn hơn so với plasmid
tiếp hợp. Các plasmid luôn được cải biến để ngày càng hoàn thiện hơn qua nhiều thế
hệ, thuận tiện cho công nghệ DNA tái tổ hợp. Plasmid thế hệ thứ nhất là những
plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng như pSC1001, ColE1…
Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của nhiều

plasmid tự nhiên, gắn thêm gene chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển hình cho
plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322.
Plasmid nhân tạo thế hệ thứ 3 rất mạnh, có kích thước nhỏ và có một đoạn đa liên
kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site). Đoạn đa liên kết là
15


đoạn polynucleotite tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của nhiều loại
enzyme giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC và điển hình là pUC18.
Plasmid pUC18 được cải tiến từ pBR322 có kích thước là 2688 bp. Plasmid
pUC18 có điểm khởi đầu sao chép (ori) mang gene kháng sinh ampicilline (Ampr).
Ngồi ra nó cịn có gene ức chế lac (lacI), đoạn đa liên kết (MCS) và gene lacZ’. Đoạn
đa liên kết gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn.
1.2.5.2. Các vector phage
Các phage (virus của vi khuẩn) được dùng làm vector chuyển gene do khả năng
thực hiện việc mang gene từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải nạp).
Các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn bắt nguồn từ phage
lamda (phage  ) có nhiều loại phage như: EMBL3, EMBL4,  GEM11, phage M13…
Phage M13 thường được sử dụng làm vector tách dịng nó có DNA sợi đơn chứa 10
gene, có kích thước khoảng 6400 bp, chỉ xâm nhiễm vào E. coli.

Hình 1.2. Vector chuyển gene
(Nguồn )

1.2.5.3. Cosmid vector
Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn DNA lớn (khoảng 40-45
kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage. Cosmid
vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp DNA của phage từ dạng thẳng nối
lại thành vịng trịn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phage. Mặt khác

cosmid vector lại có phần gốc plasmid. Do vậy, chúng có khả năng tự nhân đơi như
những plasmid của vi khuẩn. Do hầu như tồn bộ phần DNA của phage đã được cắt
bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn
DNA ngoại lai được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage.
16


Phage mang DNA tái tổ hợp không tự nhân lên được vì phần DNA phage đã bị loại bỏ
nhưng chúng vẫn có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi
khuẩn, chúng lại có khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid
bình thường. Cosmid mang đoạn gene lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện
gene ở ruồi giấm, chuột, thậm chí cả ở người.
1.2.5.4. Các vector khác
 Plasmid Ti
Được sử dụng rộng dãi trong việc chuyển gene ở thực vật. Plasmid Ti bắt nguồn
từ vi khuẩn trong đất, loài Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở
thực vật.
 Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC
Nấm men là đối tượng quan trọng trong cơng nghệ di truyền. Các plasmid có
nguồn gốc từ vi khuẩn đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả. Ngược lại
plasmid có nguồn gốc nấm men đưa vào tế bào vi khuẩn lại không hoạt động. Cho tới
nay ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) mới chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất,
đó là plasmid hình vịng có kích thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong tế bào nấm
men Sacchromyces cerevisiae.
 Vector là virus của tế bào eukaryote
Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian virus)
adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes,… Các vector nhóm này được sử
dụng trong tách dịng gene và chuyển gene ở tế bào động thực vật bậc cao. Nhìn chung
có nhiều loại vector khác nhau được dùng trong cơng nghệ di truyền. Mỗi loại vector
có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn DNA có kích thước khác nhau.

1.2.6. Các loại tế bào chủ
Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụng
như:
 Ni số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dịng. Hệ thống tế bào
chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.
 Dùng để biểu hiện gene, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao như động vật,
thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính đặc thù.
 Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.
 Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một tế bào chủ thích hợp. Các tế bào chủ
có thể chia làm hai hệ thống chính, đó là tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ nhân chuẩn.
1.2.6.1. Tế bào chủ nhân sơ
Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống,
lại chấp nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng các yêu cầu của tế bào
17


chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dịng gene. Do tính chất
đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E. coli được nghiên cứu tỉ mỉ về cơ chế di truyền,
phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó là cơ sở cho kỹ thuật
DNA tái tổ hợp và cơng nghệ di truyền.
Ngồi E. coli một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho các thí
nghiệm tách dịng gene như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces… tuy nhiên
những tế bào chủ này có những hạn chế nhất định. Những tế bào chủ này cần đòi hỏi
những vector thích hợp, nên việc đưa các DNA tái tổ hợp vào chúng gặp nhiều khó
khăn.
1.2.6.2. Tế bào chủ nhân chuẩn
Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E. coli làm tế bào chủ để tách
dịng gene vì nó là sinh vật nhân sơ khơng có màng nhân bao bọc nhiễm sắc thể. Do
vậy các gene ở sinh vật nhân chuẩn không thể được biểu hiện được trong E. coli vì

mơi trường khác với mơi trường bình thường của sinh vật nhân chuẩn. Như vậy, nếu
chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm tách dịng
thì khó có thể tin rằng E. coli mang DNA tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein có chức
năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn.
Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩn bậc
thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào phức tạp như động
vật, thực vật.
 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
Nấm men S. cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5
micromet) dễ ni cấy với quy mơ lớn, có điểm khởi đầu (promotor) mạnh và có
plasmid dùng làm vector YAC biểu hiện gene,… Lồi S. cerevisiae có rất nhiều đặc
điểm phù hợp để người ta chọn làm tế bào chủ phù hợp nhất.
Ngoài ra các nấm men khác cũng được dùng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm
tạo dòng gene như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia
pastoris.
 Tế bào thực vật
Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các phịng
thí nghiệm thao tác gene. Tảo đơn bào, ví dụ như lồi Chramydomonas rainhardii có
tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bào
thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí nghiệm thao
tác di truyền, trong cơng nghệ di truyền. Tuy nhiên, người ta cũng còn dùng các tế bào
thực vật ni cấy trong những mơi trường thích hợp có thể dùng làm tế bào chủ.
 Các tế bào chủ động vật

18


Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần thiết cho
sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tế bào chủ động
vật. Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:

 Tế bào thận của khỉ xanh châu Phi.
 Tế bào thận chuột đồng nhỏ.
 Tế bào thận phôi người.
 Tế bào tử cung chuột bạch.
 Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người.
 Tế bào tuyến côn trùng Caenorhabditis elegans.

1.2.7. Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA
Hai yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp là: khả năng sử dụng các
enzyme để cắt nối các phân tử DNA in vitro và hệ thống các tế bào vật chủ để đưa
DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với một số lượng lớn bản sao trong tế
bào chủ. Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một dòng tế bào chứa bản sao của một
gene cần thiết, đó là tách dịng gene (gene cloning).
1.2.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp
 Tạo nguồn gene
Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gene. Có ba
phương pháp khác nhau để thu nhận gene:
 Thu nhận DNA từ hệ gene (thư viện DNA).
 Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học.
 Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA).
 Tạo plasmid tái tổ hợp
Khi có các đoạn DNA hay cDNA mong muốn. Bước tiếp theo là gắn chúng vào
vector chuyển gene để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương pháp gắn các đoạn
DNA, hoặc cDNA vào plasmid, hoặc các vector chuyển gene khác.
 Phương pháp dùng đầu dính.
 Phương pháp dùng đoạn nối (linkers).
 Phương pháp dùng enzyme terminal transferase
1.2.7.2. Tách dòng DNA tái tổ hợp
Sau khi plasmid tái tổ hợp hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp theo là
biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gene lạ, ví dụ biến nạp vào E. coli.

Biến nạp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau.
19


 Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất.
 Phương pháp xung điện.
 Phương pháp vi tiêm.
 Phương pháp dùng súng bắn DNA.
1.2.7.3. Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gene
Sau khi biến nạp DNA (gene) vào tế bào chủ nhận thì ở trong tế bào nhận, DNA
biến nạp được nhân bản, từ đó chúng tạo ra được dòng DNA (gene). Bước tiếp theo
chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gene mong muốn và sau đó tạo điều kiện
cho gene biểu hiện.
 Chọn lọc dịng DNA tái tổ hợp đặc hiệu
Trong nhiều trường hợp, do sử dụng các loại enzyme giới hạn khác nhau nên tạo ra
số lượng dòng DNA rất lớn, hoặc một loại enzyme giới hạn có thể cắt ra những đoạn
gene khơng mong muốn. Trong khi đó nhà nguyên cứu lại chỉ muốn tách một dịng DNA
cụ thể đặc hiệu. Có 3 hướng chính để chọn lọc dịng DNA là: lai acid nucleic dùng mẫu
RNA dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm
tùy theo tính chất của dịng gene.
 Biểu hiện của gene mong muốn
Muốn gene đã tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu hiện
mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gene ở động vật có vú tạo
ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số lượng lớn và có
giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gene này trong tế bào E. coli cần lưu ý một số
nhân tố sau:


Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli cần hợp lý.



Phải có khởi điểm (promotor) phiên mã mạnh.



Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã.



DNA tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài trong E. coli.



Khơng có sự phân giải protein đích của các enzyme trong tế bào chủ.

1.3. Một số ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp và cloning gene trong điều
chế sản phẩm y sinh học

1.3.1. Human alpha antitrypsin
1.3.1.1. Sơ lược về bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT)
Thiếu men AAT là một tình trạng di truyền làm tăng nguy cơ phát triển bệnh phổi
và gan.

20


Thiếu men AAT, cũng gọi là thiếu chất ức chế 1-proteinase hay đơn giản hơn là
một bệnh di truyền làm tăng nguy cơ phát triển một loạt các bệnh như khí thũng phổi
và bệnh xơ gan. Đó là do đột biến ở gene mã hóa cho glycoprotein 52 kD alpha 1antitrypsin (AAT).

Hầu hết các men AAT trong cơ thể được gan sản xuất. Do đó khi thiếu men này
gan cũng có thể bị tổn thương giống phổi.
Bệnh thiếu men AAT được cho là một trong những bệnh di truyền thường gặp
nhất ở cộng đồng người da trắng.
Năm 1988, Ian Wilmut và các đồng nghiệp, Viện Roslin-Scotland, đã tạo ra cừu
biến đổi gene “Tracy” sản xuất với các gene của con người đối với AAT được biểu
hiện trong sữa. Mục đích là để thu hoạch các AAT để điều trị bệnh khí thũng con
người.
1.3.1.2. Sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene
Theo Bio Factsheet, số 51 đăng vào tháng 9/1999 thì quy trình sản xuất AAT
bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene được thực hiện như sau:

21


Trích mRNA từ tế bào người
Ly trích mRNA và xử lý với enzyme phiên mã ngược thu được bản sao DNA

Kiểm tra cDNA với đầu dị phóng xạ để xác định các đoạn có gene AAT bình thường

Điện di phân lập

Xử lý những đoạn gene với enzyme cắt giới hạn để tạo ra cDNA kết dính

Ly trích DNA từ tế bào cừu khỏe mạnh và xử lý với enzyme cắt giới hạn để tạo ra
DNA kết dính bổ sung

Trộn cDNA từ người và DNA kết dính bổ sung từ cừu và thêm những đoạn DNA mà
có chứa gene đề kháng với neomycin.

Xử lý với enzyme nối DNA ligase để gắn kết chúng lại như là DNA tái tổ hợp

Khuếch đại DNA tái tổ hợp (rDNA) bằng kỹ thuật PCR

Trộn rDNA với tế bào cừu (tế bào gan) trong nuôi cấy mơ, sốc nhiệt và calcium
phosphate, sau đó kết hợp nó vào hệ gene của chúng.

Tiếp tục nuôi cấy tế bào cừu và xử lý với neomycin. Khi đó sẽ giết chết những tế bào
mà không kết hợp được với rDNA. Những tế bào còn lại sẽ chứa AAT

Cấy ghép các tế bào này trở lại cho cừu bằng cách tiêm tĩnh mạch, trực tiếp vào gan.

Trong vòng một vài ngày có thể trích AAT từ huyết tương trong máu hoặc trong sữa
cừu
1.3.2. rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine growth
hormone)

22


1.3.2.1. Giới thiệu về rBGH/rBST
rBGH/rBST là hocmon tăng trưởng tái tổ hợp trên bị được tạo ra từ cơng nghệ
DNA tái tổ hợp, là sản phẩm biến đổi gene được sản xuất tự nhiên từ thùy trước tuyến
yên của bò. Ra đời bởi nhà sản xuất Monsanto, với tên thương hiệu là Posilac.
Hormone rBGH và rBST đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm– Dược phẩm Mỹ
(FDA) phê duyệt năm 1997.
rBST làm tăng sản lượng sữa trên bò (từ 10 – 15%, có 1 vài trường hợp tăng lên
đến 40%) và tạo ra những giống bò sữa cao sản, được tiêm vào bò lúc 60 – 80 ngày
sau khi sinh con, kích thích bị ăn nhiều hơn.
1.3.2.2. Ứng dụng cơng nghệ sinh học trong sản xuất rBST

 Quá trình sản xuất rBST tái tổ hợp
Với sự phát triển của công nghệ sinh học. Các nhà khoa học đã ứng dụng công
nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra rBST bằng cách chuyển gene rBST từ nhân tế bào của
bò vào một tế bào vi khuẩn. Để chuyển gene rBST của bò thành rBST trong tế bào vi
khuẩn ta cần:
 Tạo ra nhiều bản sao của gene rBST bò
 Cắt gene rBST với enzyme giới hạn
 Chèn gene rBST bò vào DNA của vi khuẩn cho ra rBST
Tiêm DNA của vi khuẩn có chứa rBST vào vi khuẩn qua q trình lên men tạo ra
những vi khuẩn biến đổi di truyền sau đó tinh chế cho ra rBST cần tìm.
 Q trình sản xuất rBST tự nhiên từ bị

Hình 1.3. Quy trình sản xuất rBST
(Nguồn:
/>23


 Q trình sản xuất rBGH bằng cách tạo dịng gene sử dụng vi khuẩn
Tạo ra nhiều bản sao gene rBGH bằng kỹ thuật PCR
Chèn gene rBGH của bò vào DNA của vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn

Hình 1.4. Kỹ thuật chèn gene rBGH
(Nguồn: />Chèn gene rBGH của bò vào vi khuẩn nhờ vector plasmid để kết dính tạo ra
DNA tái tổ hợp
Đưa các plasmid tái tổ hợp có chứa các rBGH vào tế bào vi khuẩn để tạo thành
rBGH tổ hợp.
1.3.2.4. Ảnh hưởng của rBST đến khả năng sản xuất sữa ở bò
Sản lượng sữa gia tăng một cách đáng kể khi tiêm rBST vào cơ thể bò. Lưu lượng
chảy của máu đến tuyến vú bò mạnh hơn, dẫn đến việc gia tăng lượng chất dinh dưỡng
có trong sữa, điều này đã ảnh hưởng đến việc cải thiện năng suất sữa của bị. Ngồi ra

hiệu quả của việc cho ăn được cải thiện, giúp bò sản xuất được nhiều sữa. Theo Peel,
những bò được tiêm BST tăng sản lượng sữa từ 4,8 – 11,2 cân/ngày, hiệu quả của việc
cho ăn được cải thiện từ 2,7 – 9,3%.
Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã làm một vài thử nghiệm về BST, kết quả sản
lượng sữa gia tăng 8,4 kg/ngày (Bauman, 1989). Họ đã đưa ra nhận định khi tiêm BST
trên đàn bị sữa thì sản lượng sữa gia tăng trong khoảng từ 8,5 – 17,6%. Tuy nhiên
cũng có một số thơng tin của một vài nhóm nghiên cứu đưa ra nhận định khơng khả
quan về tính chất sinh học của somatotrobin (Bauman, 1989).
Thật khó để đánh giá mỗi cá thể bò sẽ đáp ứng với BST như thế nào. Đáp ứng cao
được thấy khi ta bắt đầu tiêm BST cho bò, sau khi bò sản xuất sữa khoảng 101 ngày,
khá hơn khi bắt đầu tiêm vào ngày 57 – 100 sau khi bò đẻ. Phản ứng của những bò được
24