ĐỊNH LƯỢNG MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

TIỂU LUẬN
Đề tài: ĐỊNH LƯỢNG MELAMINE TRONG SỮA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC

Mục lục

I.
-

-

-

Tổng quan về Melamine
1. Melamine là gì
Melamine là một chất hữu cơ, màu trắng pha lê, và khó
hịa tan trong nước. Tên khoa học của melamine là
1,3,5- triazine-2,4,6-triamine, có khi cịn gọi là
cyanuramide hay cyanurotriamine, với cấu trúc hóa học
gồm 3 nguyên tử carbone, 6 nguyên tử hydrogen và 6
nguyên tử nitrogen.
Melamine là trime của cyanamid, giống như cyanamid,
phân tử của chúng chứa 66% nitơ theo khối lượng vì thế
chúng có đặc tính dễ cháy
Trọng lượng phân tử của melamine: 126.12 g/mol
Công thức tổng quát C3H6N6
Công thức khai triển:

1

-

Nhiệt độ nóng chảy: 350 °C (623 K; 662 °F)

-

Nhiệt độ sơi: Sublimes

-

Độ hịa tan trong nước: 3.1g/l (20°C)

-

Melamine cịn là dẫn chất thuốc trừ sâu cyromazine và có thể được hình thành bên trong cơ
thể của động vật có vú từ cyromazine1. Có nghiên cứu cịn cho thấy melamine có thể hình
thành khi cyromazine có mặt trong mơ thực vật.
Điều chế
Nhà hóa học người Đức Liebig là người tổng hợp melamine đầu tiên vào năm 1834. Ban
đầu, calcium cyanamide được biến đổi thành dicyandiamide, sau đó được đốt nóng trên
nhiệt độ tan chảy của nó thành melamine. Tuy nhiên, hiện nay các nhà máy sản xuất sử
dụng ure trong các phản ứng như sau để tạo ra melamine.
2.

6 (NH2)2CO  C3H6N6 + 6 NH3 + 3 CO2

Phản ứng được diễn giải theo hai bước sau:
-

Đầu tiên urê phân hủy tạo thành axit cyanic và ammoni, đây là phản ứng thu nhiệt:

6 (NH2)2CO → 6 HCNO + 6 NH3

-

Sau đó axit cyanic polyme hóa tạo thành melamin và khí carbon dioxide:
6 HCNO → C3H6N6 + 3 CO2

Phản ứng sau là tỏa nhiệt, nhưng xét tồn bộ q trình là phản ứng thu nhiệt.
3.

Ứng dụng của Melanin
a. Công nghiệp

2


-

-

Melamine (CAS No.108-78-1) được sử dụng trong quá trình sản xuất các loại nhựa dẻo
melamine (phản ứng với formaldehyde), sản xuất hồ, nhựa ép, giấy dán, hợp chất gắn kết,
vật liệu bọc ngoài và chất chống cháy
Melamine được sử dụng trong sản xuất bêtông nhằm làm giảm hàm lượng nước, tăng khả
năng chịu lực…
Nơng nghiệp
Melamine cũng có thể được hình thành (như là dẫn chất) từ thuốc trừ sâu cyromazine
Melamine được sử dụng làm phân bón do sở hữu hàm lượng nitơ cao
Melamine cũng có mặt trong thuốc có gốc asen được dùng trong điều trị xoắn trùng Châu
Phi.

b.

-

Công nghiệp thực phẩm
Vì hàm lượng nitơ cao nên melamine được những nhà sản xuất "gian dối" dựa vào thực
phẩm : sữa
Ngoài sữa melamine cịn có thể xuất hiện trong các sản phẩm dùng sữa làm nguyên liệu như
trong cà rem, sữa chua, kẹo, bánh biscuit, …
c.

-

II.

Tổng quan về Melamine trong sữa
1. Độc tính của melamine
Những nghiên cứu trước đây đều cho rằng melamine có độc tính thấp nhưng khi kết hợp :

-

Gây độc cấp tính
Số liệu thí nghiệm trên chuột cho thấy liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) là

3.000mg /kg khối lượng cơ thể nếu melamine được đưa vào theo đường miệng. LD50 của thỏ
khi làm thí nghiệm kích thích trên da lớn hơn 100mg/kg.
Melamine cũng gây kích thích trên da lớn hơn 1000mg /kg. Melamine cũng gây kích
thích cho da và mắt. Một nhóm nhà khoa học Liên Xô cũ cho rằng muối tạo thành từ Melamine
và acid cyanuric (muối sử dụng trong chống cháy) có độc tính mạnh hơn cả hai chất riêng rẽ
này. Nếu đưa muối melamine trực tiếp vào dạ dày của chuột, LD50 là 4,1g/kg còn khi cho

chuột, LD50 là 3,5g/kg. Các số liệu tương ứng đối với chuột nhắt là 7,7g /kg và 3,4g/kg. Mèo
ăn thức ăn chứa melamine có các biểu hiện của hư thận.
-

Gây độc mãn tính
Nếu ăn thực phẩm chứa melamine có thể dẫn đến các tổn thương đường tiêu hóa, sỏi

bàng quang, sỏi thận và có thể ung thư bàng quang. Melamine cũng được tìm thấy trong mơ
thận của mèo và chó được cho ăn thức ăn chứa melamine. Sự lắng đọng các tinh thể muối

3


melamine có khả năng gây bệnh tích tại thận của heo và cá tương tự như acid uric gây sỏi thận
trên người.
Tinh thể melamine rất khó tan, di chuyển rất chậm trong đường tiết niệu (từ thận xuống
nệu đạo) nên có khả năng gây các triệu chứng độc cấp tính.
Tại sao melamine lại được cho vào sữa tươi và sữa bột trẻ em?
Vì hàm lượng nitơ cao nên melamine được những nhà sản xuất "gian dối" đưa vào thực
phẩm. Cơ sở để họ thực hiện điều này là những phương pháp kiểm tra như phương pháp
Kjeldahl và phương pháp Dumas đo hàm lượng đạm trong thực phẩm (một chỉ số dinh
dưỡng) qua việc xác định hàm lượng nitơ. Chính vì vậy melamine được dùng để "lừa"
phương pháp kiểm tra, lừa các cơ quan kiểm tra và tất nhiên là lừa người tiêu dùng. Vậy tại
sao nhà sản xuất lại đưa melamine vào trong thực phẩm mà nhất là sữa và các sản phẩm
dùng sữa làm nguyên liệu.? Câu trả lời ngắn gọn là: để tăng giá sản phẩm. Đơn giản là lượng
protein trong sữa càng nhiều thì nhà sản xuất càng có lý do để tăng giá sữa từ đó có thể nâng
giá sản phẩm lên.
2.

-

III.

-

-

Xác định hàm lượng melamine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao
1. Phương pháp HPLC
HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký cột (column
chromatography). Thay vì để dung mơi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của
trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh
hơn. Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích thước nhỏ trong cột hấp
phụ (column packing material) và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh (stationary phase)
và các phân tử đi qua nó. Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn
hợp
HPCL dựa vào pha động ( dạng lỏng ) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau.
Những thành phẩn này đầu tiên được hịa tan vào trong dung mơi và sau đó dưới tác dụng
của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn hợp sẽ được
phân tách thành những cấu tử của chúng
2.

Phân loại

Tùy theo tính chất phân cực của cột ghi sắc ký và dung môi, người ta phân ra hai loại HPLC :
-

-

HPLC pha thuận (normal phase HPLC): cột hấp phụ chứa các hạt silic dioxit (silica – một
hợp chất phân cực) rất nhỏ, dung môi là chất không phân cực, ví dụ hexan. Thơng thường
cột hấp phụ có đường kính trong 4,6 mm, chiều dài 150 – 250 mm. Các hợp chất không phân
cực sẽ di chuyển qua ống nhanh hơn các hợp chất phân cực. Tuy nhiên phương pháp này ít
khi được sử dụng.
HPLC đảo pha (reversed phase HPLC): kích thước cột như phương pháp pha thường nhưng
các hạt silica được biến trở thành không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên
4


các hạt này. Thông thường, mỗi hat gắn khoảng 8-18 nguyên tử cacbon. Dung dịch là chất
phân cực, ví dụ hỗn hợp nước + rượu. Các hợp chất không phân cực trong hỗn hợp có xu
hướng gắn kết với các nhóm hydrocacbon nhờ lực Van de Waals. Các hợp chất khơng phân
cực cũng khó hịa tan hơn trong dung mơi phân cực. Do đó, các hợp chất khơng phân cực sẽ
di chuyển qua ống chậm hơn các hợp chất phân cực. Phương pháp này thường được sử dụng
phổ biến hơn phương pháp pha thường.
3.

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điều kiện chạy sắc ký
Phương pháp này sử dụng một hỗn hợp pha động của axit trifluoroacetic (0.10%, pH 2,4) và
4.

-

methanol (90:10)
Cột sắc ký :
• Nhiệt độ cột : nhiệt độ phịng
• Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm

-

đường kính trong 1-10mm, ht nhi c 0.3-5àm,
ã Cht nhi ct ph thuc vo lọai cột và kiểu sắc ký.
Áp suất cao khoảng 250-600bar
Tốc độ dòng : 0.3 ml/phút
Hiệu quả của TFA tập trung vào thời gian lưu giữ melamine và hình dạng pick được đánh
giá. Tại 0,050% (pH 2,8) và 0,10% TFA, thời gian lưu giữ (3.7 phút) được hình dạng giống
hệt nhau và cao điểm sắc nét, tuy nhiên, ở nồng độ 1,0% (pH 1,4) TFA, thời gian lưu giữ lâu

-

hơn (4,6 phút) và pick rất rộng.
Đầu dị có bước sóng 240 nm , trên cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm)
Q trình thực hiện
Ngun lý :
5.

a.

5


-

Quá trình tách được thực hiện trên một cột C18. Pha động (0,1% Trifluoroacetic - TFA /
methanol là 90:10) được bơm với tốc độ dòng 0.3 mL/ phút với bước sóng phát hiện ở 240
nm. Melamine tách ra ở 3,7 phút. Một đáp ứng tuyến tính (r> 0,999) quan sát thấy đối với

các mẫu khác nhau từ 1,0-80 µgmL-1 Phương pháp này cung cấp khả năng thu hồi từ 97,2101,2% trong khoảng nồng độ từ 5-40 µgmL-1 . Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ) có giá trị là 0,1 µgmL-1 và 0,2 µgmL-1
Hóa chất và thuốc thử
Chất chuẩn: Melamine (99,0%)
Dung môi: Methanol
Dung môi rửa giải: Trifluoroacetic và Methanol
Mẫu thử :sữa dạng bột hoặc lỏng
Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc bằng hệ thống Q-pod
Millipore.
b.

-

Pha dung dịch
- Dung môi
Dung mơi 50% methanol (về thể tích) được chuẩn bị bằng cách pha thể tích bằng nhau của
methanol và nước.
- Dung dịch chuẩn Melamine:
Cân chính xác 100 mg melamine vào bình định mức 100 mL, hòa tan với Methanol 50% bằng
cách rung trong bể rung siêu âm 30 phút. Lên thể tích 100 mL thu được dung dịch có nồng độ
melamine 1000 µgmL-1.
Pha lỗng 5mL melamine trên (1000 µgmL -1) bằng 50 ml 50% methanol để được nồng độ
melamine 100 µgmL-1.
Pha lỗng tiếp 5mL melamine 100 µgmL-1 bằng 50 ml methanol 50% để được nồng độ
melamine 10 µgmL-1.
c.

Chuẩn bị mẫu
Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) hoặc 1,0 g (mẫu khô) vào bình định mức 100 ml. Mẫu được pha
với 10 ml dung dịch melamine của 1000 µgmL-1, được pha lỗng với 50 ml dung dịch

methanol 50% và rung siêu âm 30 phút. Sau khi làm lạnh về nhiệt độ phòng, lên thể tích 100
ml bằng dung dịch methanol 50% và thu được dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine là
100 µgmL-1
Cho dung dịch mẫu thu được vào ống li tâm và ly tâm ( ≥ 3200 rpm) rồi lấy phần dung dịch
phía trên ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, và lên thể tích 50 ml bằng dung dịch
methanol 50%. Mẫu được lọc qua bộ lọc 0.45 µm (Acrodisc, 25mm, màng Nylon). Nghiên
cứu về dịch lọc chỉ ra rằng các bộ lọc hấp thụ melamine tại các mức sau: 22% (cho 1ml ban
đầu), 10% (2 mL), <1% (3, 5 và 7ml). Như vậy, 3ml ban đầu của dịch lọc bị loại bỏ phần lọc
còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC để phân tích.
d.

-

-

6


Phương pháp kiểm chứng
Khảo sát độ tuyến tính
Độ tuyến tính của dung dịch thử nghiệm đã được chuẩn bị từ dung dịch melamine ở các
e.

-

nồng độ khác nhau từ 1,0-80 µgmL-1. Một đường cong hiệu chuẩn được thu được bằng cách
vẽ đồ thị tuyến tính giữa diện tích peak với nồng độ. Giá trị % R.S.D (độ lệch chuẩn tương
đối) từ năm lần tiêm mẫu chuẩn được lặp đi lặp lại ở mỗi nồng độ và % hệ số độ lệch chuẩn
đã được tính tốn.

Hình 1 : Mối quan hệ tuyến tính của nồng độ melamine với diện tích của peak
-

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• LOD và LOQ của phương pháp này được ước tính ở một tỉ số tín hiệu cực đại trên đọ
nhiễu (Signal-to-noise) 03:01 và 10:01, bằng cách tiêm một loạt các dung dịch pha lỗng
•
•

với nồng độ nhất định.
LOD đã được xác định là 0,1 µgmL-1 và LOQ đã được xác định là 0,2 µgmL -1 . Giá trị %
của R.S.D được nghiên cứu chính xác ở mức độ LOQ là trong khoảng 5%.
Một nghiên cứu chính xác cũng đã được tiến hành ở mức LOQ bằng việc tiêm sáu lần
riêng rẽ chất pha chế và giá trị % RSD của diện tích peak được tính tốn. Một nghiên
cứu về hiệu suất thu hồi được thực hiện trong ba lần, mức LOD và LOQ cho mẫu bột và
chất lỏng cho thấy hiệu suất trung bình là 75 ± 2% của LOD và 90 ± 1% của LOQ

-

Độ chính xác
• Độ chính xác của phương pháp này được đánh giá ở nồng độ bốn mức độ melamine (5, 10,
20 và 40 µgmL-1) với việc sử dụng 1 g khô hoặc10ml mẫu chất lỏng. Hiệu suất thu hồi
phản ánh một trung bình cộng của sáu lần phân tích tại mỗi nồng độ và được báo cáo trong
bảng dưới đây

7


Bang1 : Kết quả phục hồi của melamine trung bình trong 6 lần phân tích ở 4 nồng độ khác
nhau của Melamine

•

Độ chính xác được đo bằng độ ổn định và tính lặp lại của mẫu. Việc sử dụng một mẫu
được xử lý, độ lặp lại trong 1 hay nhiều ngày của phương pháp đã được chứng minh bằng
cách tiêm (trong ba lần) của mẫu vào ngày đầu tiên và ba ngày liên tiếp. Thu hồi khoảng
101,1-102,8 (0,8% RSD). Ngoài ra, độ tái lặp của một mẫu được xử lý (trong ba lần) một
cách riêng biệt vào ngày 0 và ngày 4 có kết quả trong thu hồi 99,5 đến 101,8 (0,8% RSD).
Nhận xét
Tính chất tuyến tính
Một đường hiệu chỉnh tuyến tính (hình 1) thu được trên dải hiệu chuẩn từ 1,0 đến 80 µgmL 1
với hệ số tương quan (r) 0,999. Giá trị R.S.D của các lần tiêm mẫu lặp lại < 0,02% đối với
mỗi nồng độ và hệ số lệch chuẩn y < 2%
6.

-

-

Độ chính xác:
Hiệu suất thu hồi hồi tỷ lệ melamine trong các mẫu dao động từ 97,2% đến 101,2% (Bảng
1).Phương pháp này cho thấy độ lặp lại trong 1 ngày và nhiều ngày cho các mẫu xử lý được
chỉ ra thông qua hiệu suất thu hồi từ 101,1-102,8% (0,8% RSD). Ngoài ra, khả năng tái lặp
của một mẫu riêng biệt xử lý (trong ba lần) vào ngày 0 và ngày 4 kết quả hiệu suất thu hồi từ
99,5-101,8 (0,8% RSD).
Săc kí đồ

8


Những sắc phổ chỉ ra rằng khơng có sự nhiễu và các tín hiệu melamine được phân biệt rõ ràng ở

2,4 phút. Một đường cong hiệu chuẩn tuyến tính được thể hiện trong hình1 . Ngồi ra, các mẫu
được pha với 5-40 µgmL-1 Melamine chỉ ra sự thu hồi melamine khác nhau, từ 97,2-101,2 với
các giá trị RSD khác nhau, từ 0,4% đến 2,9% cho thấy phương pháp này là chính xác trong
khoảng nồng độ này (Bảng 1). Phương pháp này liên quan đến việc xử lý mẫu tương đối đơn
giản bao gồm pha loãng với 50% Methanol. Sắc ký HPLC hồn thành q trình chạy trong 6
phút.


Đây là một phương pháp đơn giản để xác định ô nhiễm melamine trong các thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng sắc ký lỏng pha đảo HPLC. Phương pháp này thuận
lợi bởi vì pha động là acetonitril miễn phí và thời gian phân tích của ~ 6min mỗi mẫu.
Phương pháp phân tích này cung cấp độ nhạy cảm tuyệt vời, khả năng tái lặp, chính xác
cao.

IV. Tài liệu tham khảo
1. Bài giảng: PGS.TS Dương Thanh Liêm, Bộ môn Dinh dưỡng, Khoa Chăn nuôi Thú y
2.
3.
4.
5.

6.

Trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM.
Angelika Gratzfeld-Hüsgen and Rainer Schuster: HPLC for Food Analysis
Định lượng Melamine trong sữa bằng phương pháp HPCL – Trường ĐH Nông Lâm
TP HCM
wikipedia - Melamin
Phương pháp xác định melamine trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sữa bằng sắc
ký lỏng cao áp HPLC- Tham khảo: Gopalakrishnan Venkatasami, John R. Sowa

Jr. ∗ Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall University, 400 South
Orange Ave., South Orange, NJ 07079, USA
Tiểu luận độc tố thực phẩm Melamine – 123.doc

9


10