Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của loài địa y roccella montagnei

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
MỤC LỤC ...........................................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... v
DANH MỤC PHỤ LỤC ..................................................................................................... v
LỜI MỞ ĐẦU ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN ........................................................................................... 2

1.1. Định nghĩa và phân loại địa y ................................................................................ 2
1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y ......................................... 3
1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y ................................................... 3
1.4. Nghiên cứu hóa học của một số lồi địa y thuộc chi Roccella .............................. 4
1.5. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y ........................................................ 5
1.5.1.

Hoạt tính đối với động vật ........................................................................... 7

1.5.2.

Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao ............................. 7

1.5.3.

Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y ....... 8

1.5.4.

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y..................... 9

1.5.5.

Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y .......... 12

CHƢƠNG 2.

THỰC NGHIỆM .................................................................................... 15

2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất .................................................................................. 15
2.2. Thu hái và xử lý mẫu ngun liệu, ly trích và cơ lập các hợp chất ..................... 15
CHƢƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 18

3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất DS......................................................... 18

ii


3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất R1 ......................................................... 18
CHƢƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................... 19

4.1. Kết luận ................................................................................................................ 19
4.2. Đề xuất ................................................................................................................. 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 20
PHỤ LỤC .............................................................................. Error! Bookmark not defined.

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
Ac

Acetone

AcOH

Acid acetic

br

Mũi dãn rộng (Broad)

C

Chloroform

DMSO

Dimethyl sulfoxide

d

Mũi đôi (Doublet)

EA

Ethyl acetate

H

n-hexane

HMBC

Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

HSQC

Tương quan 1H-13C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation)

IC50

Nồng độ ức chế sự phát triển của 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal
Inhibitory Concentration)

J

Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin)

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

s

Mũi đơn (Singlet)

SKC

Sắc ký cột

δ

Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học)

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1.

Ba dạng chính của địa y

Hình 1.2.

Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

Hình 1.3.

Các hợp chất cơ lập từ địa y thuộc chi Rocella

Hình 1.4.

Một số hợp chất cơ lập từ địa y

Hình 2.1.

Địa y Rocella montagnei

Hình 3.1.

Một số tương quan HMBC trong hợp chất DS

Hình 3.2.

Một số tương quan HMBC trong hợp chất R1

Hình 4.1.

Cấu trúc hai hợp chất đã cô lập

Sơ đồ 2.1.

Sơ đồ sắc ký cột trên cao n-hexane

Sơ đồ 2.2.

Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.

Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Bảng 1.2.

Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y

Bảng 1.3.

Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cơ lập từ địa y

Bảng 1.4.

Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y

Bảng 1.5.

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y

Bảng 1.6.

Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y

Bảng 3.1.

So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất DS, acid lecanoric và acid

diorcinolic.
Bảng 3.2.

So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất R1 và lecanorin

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1.

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất DS

Phụ lục 2.

Phổ HSQC và HMBC của hợp chất DS

Phụ lục 3.

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất R1

Phụ lục 4.

Phổ HSQC và HMBC của hợp chất R1

v


LỜI MỞ ĐẦU
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y
trên thế giới trở nên phổ biến. Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của
tảo và nấm. Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi như trên đất đá, thân
cây, lá cây, trong những điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến khắc nghiệt. Ở Việt
Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân
bố phong phú và đa dạng.
Từ xưa, con người đã biết sử dụng địa y vào nhiều mục đích khác nhau như làm
thực phẩm, men rượu, phẩm nhuộm. Địa y Evernia prunastri hiện vẫn được sử dụng
trong ngành kỹ nghệ mỹ phẩm để làm chất định hương. Một vài loại hợp chất polyphenol
có trong địa y có khả năng hấp thu tia UVB nên chúng được sử dụng làm kem chống
nắng. Quan trọng hơn hết là địa y đã được sử dụng để chữa một số bệnh như bệnh lao,

bệnh dại, cảm sốt, ho, vết thương ngoài da. Địa y Lobaria pulmonaria được sử dụng để
chữa bệnh liên quan đến đường hô hấp, viêm khớp (Atalay 2011 [1], Suleyman 2003 [2]),
địa y Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não, loài Peltigera được sử dụng để chữa trị
các bệnh dại (Barrington 1974 [3]). Địa y Cetraria islandica được sử dụng ở Thuỵ Điển
làm thuốc chữa bệnh đái tháo đường, viêm phổi (Ahmadjian 1963 [4]). Các nghiên cứu
cho biết địa y thường chứa các loại hợp chất thơm như depside, depsidone, depsone, dẫn
xuất dibenzofuran và các hợp chất có màu như xanthone, antraquinone và dẫn xuất acid
usnic (Devehat 2007 [5]). Nhiều loại depsidone có đa dạng hoạt tính sinh học đặc biệt
trong ức chế enzyme liên quan đến các bệnh chuyển hóa ở người [6].
Nhằm phát triển các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài địa y sinh trưởng
ở Việt Nam nói chung cũng như mở rộng các nghiên cứu trên lồi địa y Roccella
montagnei, chúng tơi đã lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate
của loài địa y Roccella montagnei”.

1


CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN

1.1. Định nghĩa và phân loại địa y
Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm
(mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi
khuẩn lam (cyanobacterium). Hiện nay có khoảng 17.000 lồi địa y đã được tìm thấy.
Thơng thường địa y chia làm 3 dạng: dạng khảm, dạng phiến và dạng sợi (Choi và cộng
sự, 2008)[7]:

Xanthoria sp.,
(Crustose lichen)

Flavoparmelia caperata,
(Foliose lichen)

Letharia vulpina,
(Fructicose lichen)

Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn
thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và
các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này
giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở
vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá
cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi và cộng sự, 2008)[7].
Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực
vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm. Mặc dù cả hai thành phần được nuôi
cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn.

2


1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y
 Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao.
 Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại.
 Các acid carboxylic từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được
các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi và cộng sự, 2008)[7].
 Giúp xua đuổi thú ăn thịt và cơn trùng.

1.3. Nghiên cứu hố học về các hợp chất trong địa y

Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó được sử dụng
nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và công sự đề nghị (Huneck 1997)[8]:
Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc
sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2).
 Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic.
 Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid.
 Nguồn gốc acetate-malonate: các acid dây dài và các acid phenol.
Tảo

Nấm

Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y
3


1.4. Nghiên cứu hóa học của một số lồi địa y thuộc chi Roccella
Địa y Roccella đã được nghiên cứu hóa học trong hơn 50 năm. Nghiên cứu hóa
thực vật trên chi Roccella được cơng bố trên một số lồi Roccella fuciformis, R. phycopis
Ach., R. capesis Follm., R. galapagoensis, R. hypomecha Bory., R. montagnei, R.
portentosa và R. capesis Follm. D-Montagnetol và D-erythrin là các hợp chất chính, được
tìm thấy trên tất cả các loài địa y Roccella [9].
● Roccella capesis
9-Methyl pannarate (R10) được cô lập bởi Huneck S. và cộng sự (1991) [10].
● Roccella fuciformis
D-Tagatose

(R3) từ R. fuciformis được cô lập bởi Culberson C. F. (1969) [11].

Ethyl orsellinate (R4) được ly trích từ R. fuciformis (Huneck S., 1997) [8]. Acid lepraric
(R7) được cô lập từ R. fuciformis bởi Aberhart D. J. (1969) [12]. 2-Methyl-5-hydroxy-6hydroxymethyl-7-methoxychromone (R8) được cô lập từ R. fuciformis bởi Huneck S. và

Follmann G. (1972) [9].
Picroroccellin (R14) được cô lập bởi Marcuccio S. M. và Elix J. A. từ R.
fuciformis (1983) [13].
● Roccella galapagoensis
Galapagin (R9) được cô lập bởi Huneck S. (1992) [14].
● Roccella hypomecha
Acid 3-O-Demethylschizopeltic (R11) được cô lập bởi Huneck và cộng sự (1993)
[15].
● Roccella montagnei
Năm 1969, D-(+)-montagnetol (R5) được cô lập từ R. montagnei bởi Culberson C.
F. và cộng sự [11]. Năm 2017, Duong T. H. và cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất mới

4


orsellinylmontagnetol A–D và hydrofurylmontagnetol (R15-R19) cùng với (+)-Dmontagnetol (R5), (+)-D-erythrin (R6), 1-acetylerythritol (R20), acid lecanoric (R21),
lecanorin (R22), acid orsellinic (R23), methyl orsellinate (R24).
● Roccella phycopis
Acid roccellic (R1) được cô lập từ R. phycopis Ach. Bởi Huneck S. và cộng sự
(1994) [12]. Meso-erythritol (R2) và erythrin (R6) được cô lập từ R. phycopis bởi
Culberson C. F. (1969) [11].
● Roccella portentosa
Acetylportentol (R12) và portentol (R13) được cô lập từ R. portentosa bởi
Aberhart D. J. và cộng sự (1970) [12].

1.5. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y
Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và
nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy
vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát
triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phịng thí

nghiệm cũng khơng dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên
chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự
nhiên. Lê Hồng Duy (2012)[16] đã nghiên cứu ni cấy thành cơng 10% trên khoảng 50
lồi địa y lấy từ Việt Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu
như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên.
Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt
tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy
đủ của Boustie (2010)[6], Huneck (1999)[17], Muller (2001)[18] về kháng khuẩn, kháng
virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

5


Hình 1.3. Các hợp chất được cơ lập từ lồi địa y thuộc chi Roccella

6


1.5.1. Hoạt tính đối với động vật
Acid caperatic và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và
Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của lồi ốc Pallifera varia.
Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis.
Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic,
acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid
norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic và acid usnic làm giảm sự tăng
trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng khơng ảnh hưởng đến sự sống
cịn của chúng.
1.5.2. Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng đối với thực vật bậc cao
Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc
cao như Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng đối với thực vật bậc cao
Địa y hoặc các hợp chất của địa y

Hoạt tính

Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau
diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β- diếp
orcinolcarboxylic, acid orsellinic
Ergochrome AA (acid secalonic A)

Gây độc cho thực vật

Acid evernic

Giảm các nồng độ chất diệp lục
trong lá rau bina

Acid lecanoric

Nguyên nhân gây bất thường cho
gốc của cây Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng

Hoạt tính ức chế của độc chất thực
vật

Các quinone từ Pyxine spp

Ức chế sự nguyên phân của rễ cây

Allium cepa

Acid usnic

Ức chế sự nảy mầm và phát triển của
Lepidium sativum

7


1.5.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y
Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus. Hypericin
có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral). Các hợp
chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus
HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế
monochloro có hoạt tính giảm hơn. Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl
trong cấu trúc (Muller 2001)[18].
Các hợp chất thơm cơ lập từ các lồi địa y như depsidone, depside và diphenyl ether
thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhiều loại enzyme.
Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y
Hợp chất

Virus và enzyme của virus

Depsidone: acid virensic và dẫn xuất
tương tự

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực
khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV.

Acid butyrolactone: acid
protolichesterinic

Nhân bản của HIV

(+)-Acid usnic và 4 depside khác

Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-Omethylemodin, 5,7-dichloroemodin,
hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

Từ địa y Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm, thu hái trên núi Zelengora (Bosnia), hai
hợp chất depsidone đã được cơ lập, đó là: diacid 4-formyl-8-hydroxy-1,9-dimethyl-3methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-6,7-carboxylic

và

7,8-diacetoxy-4-

formyl-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin [6]. Thử nghiệm
hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho
thấy hợp chất diacid khơng có hoạt tính nhưng hợp chất mang hai nhóm acetate lại có
hoạt tính khá ở nồng độ 1 g/ mL, so với chất đối chứng dương galanthamine hoạt tính ở
nồng độ 0,01 g/ mL [6].

8

Depsidone acid lobaric [9] ức chế mạnh được nhiều loại enzyme như 12(S)lipoxygenase platelet-type (IC50 28,5 µM), 5-lipoxygenase (IC50 7,3 µM), protein
tyrosine phosphate 1B (PTP1B, IC50 0,87 µM), cyclogenase (IC50 29,2 µM). Các hợp
chất diphenyl ether pseudodepsidone (H1) và (H2) [7] có khả năng ức chế mạnh dịng
enzyme PTP1B với giá trị lần lượt IC50 6,86 và 2,48 µM và depside acid baeomyceric ức
chế enzyme 5-lipoxygenase với giá trị IC50 8,3 µM. Một số hợp chất địa y khác ức chế
vài loại enzyme được thống kê bởi Boustie (2010) [6] và Muller (2001) [15], lần lượt
minh họa trong Bảng 1.1 và 1.2.
1.5.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y
Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả.
Acid protolichesterinic được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid
này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller
2001)[18]. Một số lượng lớn các hợp chất địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay
nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, acid evernic,
acid leprapinic và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, acid puvinic và dẫn xuất, acid
usnic và dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[18]. Khả năng kháng nấm của các hợp chất
địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin,
fallacinal, emodin (Boustie 2010) [6]. Trong các hợp chất địa y, acid usnic và dẫn xuất
của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn.

9


Hình 1.4. Một số hợp chất cơ lập từ địa y

10


Bảng 1.3. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y [6]
Tên hợp chất

Loại enzyme

(H8)

Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 63,5 µM).

Depside acid baeomycesic

Ức chế yếu enzyme 12(S)-lipoxygenase platelettype (100 µg/mL: 15%)

Depside atranorin

(H4)

Ức chế enzyme 5-lipoxygenase từ porcine leukocyte
(IC50= 8,3 µM)

Tridepside tenuiorin (H7)

Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 59,6 µM).

Orcinol (H10)

Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial
fluid A2 (IC50= 0,22 mM).

Methyl β-orsellinate (H11)

Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial

fluid A2 (IC50= 0,26 mM).

Acid usnic (H14)

Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,4 µM).

Usimines AC (H15, H16)

Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,423,0 µM).

Acid
(H13)

protolichesterinic Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type
(IC50= 77,0 µM)
Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 20,0 µM)

Acid lichesterinic (H9)

Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type
(IC50= 77,0 µM)

Stereocalpin A (H17)

Ức chế mức độ yếu đối với enzyme protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 40,0 µM).

cis-9-Octadecenamide

(H12)

Ức chế enzyme cyclogenase (IC50= 64,3 µM).

11


Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế enzyme của một số hợp chất cô lập từ địa y [18]
Hợp chất

Enzyme

Atranorin (H8)

Trypsin, Pankreaselastase,
Phosphorylase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, divarinol, cao
chiết thô của địa y Cetraria
juniperina, Hypogymnia physodes and
Letharia vulpina

Tyrosinase

Chrysophanol

Glutathione reductase

Acid
confluentic,

methylperlatolic

acid

2β-O-

Monoaminoxidase B

Acid 4-O-methylcryptochlorophaeic

Prostataglandinsynthetase

Acid (+)-protolichesterinic

5-Lipoxygenase (ngăn cản sự sao chép
ngược virus HIV)

Acid vulpinic

Phosphorylase

Acid norsolorinic

Monoamino oxidase

Acid physodic

Arginine decarboxylase

Acid usnic (H14)

Ornithine decarboxylase

1.5.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y
Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là acid usnic. Thử nghiệm
kháng u (antitumour) của acid usnic được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử
nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và
Kopperman (1975)[20]. Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được
12


khảo sát và kết quả đã chỉ ra rằng tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng
đối với khả năng gây độc tế bào. Hai liên kết hydrogen nội phân tử trong cấu trúc của
acid usnic đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của nó.
Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối. Acid depsidone
lobaric và acid depside baeomyceic cùng có khả năng ức chế sự phát triển của 14 dòng tế
bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 12-65 µg/mL (Boustie 2010) [6]. Depsidone
pannarin và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền
liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14 với IC50 trong khoảng 25-30 µg/mL (Bảng 1.4)
(Boustie 2010) [6].
Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày trong bảng 1.5.
Bảng 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y
Hợp chất

Vi khuẩn

Acid usnic và các dẫn xuất

Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium
perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,
Mycobacterium aurum

Acid protolichesterinic

Helicobacter pylori

Methyl orsellinate,
ethyl orsellinate,
methyl β-orsellinate,
methyl haematommate

Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M.
gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes,
Verticillium
achliae,
Bacillus
subtilis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Cvàida albicans

Alectosarmentin

Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis

1´-Chloropannarin, pannarin

Leishmania spp

Emodin, physcion

Bacillus brevis

Acid pulvinic và dẫn xuất

Drechslera rostrata, Alternaria alternata
Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí

Acid leprapinic và dẫn xuất

Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

13


Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y
Hợp chất

Hoạt tính trên loại tế bào

(-)-Acid usnic

Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu
P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại
tế bào sừng hóa HaCat

Acid protolichesterinic

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu
K-562 và khối u rắn Ehrlich

Pannarin, 1-chloropannarin,
sphaerophorin

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

Naphthazarin

Có hoạt tính chống lại dịng tế bào sừng hóa

Scabrosin ester và dẫn xuất,
euplectin

Gây độc chống lại tế bào murine P815
mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, acid salazinic, acid
stitic

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan
chuột

Acid psoromic, chrysophanol,
emodin và dẫn xuất

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

14

CHƢƠNG 2.

THỰC NGHIỆM

2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Phịng
Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM
(phổ 1H-NMR được đo ở tần số 500MHz và phổ 13C-NMR được đo ở tần số 125 MHz).
Dung mơi sử dụng gồm có: ethyl acetate, acid acetic, acetone, chloroform,
methanol, n-hexane được cung cấp bởi hãng Chemsol (Việt Nam). Sắc kí cột pha thường
sử dụng silica gel kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck). Sắc kí gel Sephadex sử dụng
hạt gel LH-20.

2.2. Thu hái và xử lý mẫu ngun liệu, ly trích và cơ lập các hợp chất
Địa y Roccella montagnei, họ Rocellaceae được thu hái ở chùa Cổ Thạch, huyện
Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam từ tháng 8-2012. Tên khoa học được xác định bởi
tiến sĩ Holger Thüs, Bảo tàng lịch sử tự nhiên, London, Anh. Mẫu ký hiệu số US-B024 và
được lưu trong quyển tiêu bản thực vật tại bộ mơn Hố hữu cơ, Khoa Hoá học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.

Hình 2.1. Địa y Roccella montagnei
Bột khơ địa y nghiền nhỏ (2,600.0 g) được ngâm dầm trong acetone và dịch chiết cô
quay dưới áp suất thấp. Trong quá trình acetone bay hơi, kết tủa trắng erythrin (204.7 g)
xuất hiện dần và được lọc riêng. Phần dung dịch lọc cịn lại được tiếp tục cơ quay thu
được cao acetone thô (395.3 g). Tiến hành chiết lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực
tăng dần và cơ quay dịch chiết thu được cao n-hexane (53.6 g), cao ethyl acetate (200.0
g) và phần còn lại (15.9 g).

15

Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với cao n-hexane, giải ly với hệ dung môi
n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2) để thu được 9 phân đoạn H1 (10.8 g), H2 (8.0
g), H3 (5.7 g), H4 (4.5 g), H5 (2.4 g), H6 (1.3 g), H7 (0.7 g), H8 (1.5 g), H9 (4.0 g). Sắc
kí gel Sephadex với dung mơi methanol phân đoạn H5 thu được 7 phân đoạn H5.1 (516.0
mg), H5.2 (503.0 mg), H5.3 (784.0 mg), H5.4 (316.0 mg), H5.5 (178.0 mg), H5.6 (123.0
mg), H5.7 (1012.0 mg). Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phân đoạn H5.3,
giải ly với hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acetone: nước (1:2:2:0.01) thu được
DS (4.2 mg).
Bột địa y Roccella montagnei
(2,600.0 g)
- Ngâm dầm với dung môi actone (10x3.5 L)
- Cô quay dịch chiết

Kết tủa T (204.7 g)

Cao acetone (396.0 g)
-Chiết lỏng-lỏng với dung mơi
có độ phân cực tăng dần

- Cơ quay dịch chiết

Cao n-hexane
(53.6 g)

Phần còn lại
(15.91 g)

Cao ethyl acetate
(200.0 g)

SKC H:EA:Ac (5:1:0.2)

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9

(10.8 g)

(8.0 g)

(5.7 g)

(4.5 g)

(2.4 g)

(1.3 g)

(0.7 g)

(1.5 g)

(4.0 g)

Sephadex LH-20

H5.1

H5.2

H5.3

H5.4

H5.5

H5.6

H5.7

(516.0 mg) (503.0 mg) (748.0 mg) (316.0 mg) (178.0 mg) (123.0 mg) (1012.0 mg)
SKC C:EA:Ac:H2O (1:2:2:0.01)

DS (4.2 mg)
Sơ đồ 2.1. Sắc kí cột trên cao n-hexane

16


Rửa nhiều lần cao ethyl acetate với dung môi acetone thu được phần dịch hữu cơ
và phần tủa (80.0 g). Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phần dịch, giải ly
với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (5:1:2:0.2) để thu được
13 phân đoạn EA1 (1.7 g), EA2 (4.1 g), EA3 (1.4 g), EA4 (6.6 g), EA5 (9.0 g), EA6
(9.5 g), EA7 (15.3 g), EA8 (9.4 g), EA9 (5.2 g), EA10 (4.2 g), EA11 (3.9 g), EA12
(10.5 g), EA13 (9.0 g). Từ phân đoạn EA1 (1.7 g) thực hiện sắc kí cột silica gel pha
thường, giải ly nhiều lần với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2)
thu được hợp chất R1 (5.0 mg).
Cao ethyl acetate
(200 g)
Lọc nhiều lần với dung môi acetone

Phần tủa (80.0 g)

Phần dịch

SKC Hex:EA:Ac:AcOH (5:1:2:0.2)

EA1

EA2

EA3

EA4

EA5

EA6

EA7

EA8

EA9

EA10 EA11 EA12 EA13

(1.7 g) (4.1 g) (1.4 g) (6.6 g) (9.0 g) (9.5 g) (15.3 g) (9.4 g) (5.2 g) (4.2 g) (3.9 g) (10.5 g) (9.0 g)
SKC Hex:EA:Ac (5:1:0.2)

R1 (5.0 mg)
Sơ đồ 2.2. Sắc kí cột trên cao ethyl acetate

17


CHƢƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất DS
Hợp chất DS thu được từ phân đoạn cao n-hexane của loài địa y Roccella
montagnei là chất dầu, màu vàng.
Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 1).
Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 2).

3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất R1
Hợp chất R1 thu được từ phân đoạn cao ethyl acetate của loài địa y Roccella
montagnei.
Phổ 1H và 13C-NMR (phụ lục 3).
Phổ HSQC và HMBC (phụ lục 4).

18


CHƢƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. Kết luận
Từ mẫu địa y Roccella montagnei thu hái ở chùa Cổ Thạch, huyện Tuy Phong,
tỉnh Bình Thuận đã cơ lập được hai hợp chất DS và R1. Bằng các phương pháp phổ
nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định được cấu trúc của hai
hợp chất hữu cơ gồm

Acid diorcinolic

4-carboxydiorcinal

Hình 4.1. Cấu trúc hai hợp chất đã cơ lập

4.2. Đề xuất
Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề
tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp
tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao cịn lại.
Đồng thời chúng tơi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao

và hợp chất đã cô lập được.

19


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Atalay F., Halici M. B., Mavi A., Cakir A., Odabasoglu F., Kazaz C., Aslan A.,
Kufrevioglu O. I. Antioxidant phenolics from Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm and
Usnea longissima Ach. lichen species, Turk J. Chem., 35, 647–661, 2011.
2. Süleyman H., Odabasoglu F., Aslan A., Cakir A., Karagoz Y., Gocer F., Halici M.,
Bayir Y., Anti-inflammatory and antiulcerogenic effects of the aqueous extract of
Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm., Phytomedicine, 10, 552–557, 2003.
3. Barrington E. J. W., Willis A. J., The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd
edition, Edward Arnold, London, 10, 159–163, 1974.
4. Ahmadjian V., Nilsson S. Swedish Lichens. Yb. Am. Swed. Hist. Fdn., 1963.
5. Devehat F. L.-L., Tomasi S., Elix J. A., Bernard A., Rouaud I., Uriac P., Boustie J.
Stictic acid derivatives from the lichen Usnea articulate and their antioxidant
activities, J. Nat. Prod., 70, 1218–1220, 2007.
6. Boustie J., Tomashi S., Grube M., Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an
untapped source, Phytochemistry Review, 10(3), 287–307, 2011.
7. Yit Heng Choi, Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide biosynthesis,
A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15, 2008.
8. Huneck S., Yoshimura I., Identification of lichen substances, Springer, Berlin,
155−311, 1997.
9. Duong T. H., Huynh B. L. C., Chavasiri W., Chollet-Krugler M., Nguyen V. K.,
Nguyen T. H. T., Hansen P. E., Pogam P. L., Thüs H., Boustie J., Nguyen K. P. P.,
New erythritol derivatives from the fertile form of Roccella montagnei,
Phytochemistry, 137, 156-164, 2017.
10. Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., 9-Methylpannarate from the lichen

Roccella capesis. Z Naturforsch, 969-970, 1991b.
11. Culberson C. F., Chemical and botanical guide to lichen products. Univ North
Carolina Press, Chapel Hill, 1969.
12. Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., Studies on lichen sunstance. Part LXII.
Aromatic constituents of the lichen Roccella fuciformis DC. A recised structure for
lepraric acid. J Chem Soc, 704-707, 1969.

20


13. Marcuccio S. M., Elix J. A., A structual revision of picroroccellin , Tetrahedron
Lett., 1445-1448, 1983.
14. O’Donovan D. G., Robert G., Keogh M. F., Structure of the β-orcinol depsidones,
connorstictic acid and consalazinic acid, Phytochemistry, 19, 2497−2499, 1980.
15. Sakurai A., Goto Y., Chemical studies on the lichen. I. The structure of
isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr.,
Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60, 1917−1918, 1987.
16. Le Hoang Duy, Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A thesis
for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8, 2012.
17.

Huneck

S.,

“The

significance

of

lichens

and

their

metabolites”,

Naturwissenschaften, 86, 559–570, 1999.
18. Muller K., Pharmaceutically relevant metabolites from lichens, Applied
Microbiology and Biotechnology, 56, 9−16, 2001.
19. S. Morris Kupchan, Herbert L. Kopperman, “l-Usnic acid: Tumor inhibitor isolated
from lichens”, Experientia, 31, 625-625, 1975.
20. Liu S., Wang H., Su M., Hwang GJ., Hong J., Jung JH., New metabolites from the
sponge-derived fungus Aspergillus sydowii J05B-7F-4, Natural product research, 2-5,
2017.
21. Choudhary M. I., Meher A., Wahab A., Khan A.; Rasheed S., New antiglycation
and enzyme inhibitors from Parmotrema cooperi, Science China Chemistry, 54, 19261931, 2011.

21