TÌM HIỂU đặc điểm mô BỆNH học ở tôm sú (p monodon) BỆNH HOẠI tử cơ QUAN tạo máu và cơ QUAN lập BIỂU mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THUỲ NGÂN

TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ
(P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ
QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and
Haematopoietic
Necrosis
Virus
) tập và nghiên cứu
Trung tâm Học liệu ĐH
Cần Thơ @
Tài liệu
học

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THUỲ NGÂN

TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ
(P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ
QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and
Haematopoietic
Necrosis
Virus
) tập và nghiên cứu
Trung tâm Học liệu ĐH
Cần Thơ @
Tài liệu
học

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths. BÙI THỊ BÍCH HẰNG

2008

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MỤC LỤC
Lời cảm tạ .................................................................................................................... i
Tóm tắt........................................................................................................................ ii
Danh sách hình........................................................................................................... iii
Danh mục từ viết tắt ................................................................................................... iii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................................... 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam ............................................. 3
2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV.............................................................................. 4
2.2.1 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh IHHNV................................................ 4
2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý..................................................................................... 5
2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh ..................................................................... 5
2.2.4 Chẩn đoán bệnh ...................................................................................... 6
2.2.5 Thiệt hại do IHHNV gây ra ..................................................................... 6
về @
bệnhTài
.....................................................................
Trung tâm Học2.2.6
liệuNhững
ĐH nghiên
Cần cứu
Thơ
liệu học tập và nghiên cứu 6
2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ................................................................... 7
2. 3. 1 Phương pháp PCR................................................................................. 7
2.3.2 Phương pháp mô học .............................................................................. 8
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................... 11
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................... 11
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .............................................................. 11
3.2.1 Chẩn đoán bệnh IHHNV bằng kỹ thuật PCR theo bộ kit IQ
2000 ...................................................................................................................... 11
TM

3.2.2 Kỹ thuật mô học .................................................................................... 14

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 17
4.1 Kết quả xét nghiệm PCR................................................................................ 17
4.2 Kết quả mô học .............................................................................................. 17
4.2.1 Những biến đổi mô học lớp biểu mô dưới vỏ tôm sú nhiễm
IHHNV. .................................................................................................................... 17

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


4.2.2 Những biến đổi mô học ở mang tôm sú nhiễm IHHNV......................... .17
4.2.3 Những biến đổi mô học ở mô liên kết gan tuỵ tôm sú nhiễm
IHHNV ..................................................................................................................... 19
4.2.4 Những biến đổi mô học ở tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV.................... 20
4.2.5 Những biến đổi mô học ở cơ tôm sú nhiễm IHHNV............................... 21
4.2.6 Những biến đổi mô học ở cơ quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV......... 21
Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT ....................................................................... 23
5.1 Kết luận ......................................................................................................... 23
5.2 Đề xuất........................................................................................................... 23
Tài Liệu Tham Khảo. ................................................................................................ 24

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CẢM TẠ

Xin trân trọng cảm tạ cô Bùi Thị Bích Hằng giáo viên hướng dẫn thực hiện đề
tài đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Xin trân trọng cảm tạ q thầy cơ phụ trách phong thí nghiệm cùng cán bộ phụ

trách thư viện khoa Thuỷ Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi hồn
thành luận văn này.
Có được kết quả ngày hôm nay tôi xin chân thành cảm ơn tất cả q thầy cơ
của trường, khoa thuỷ sản đã giáo dục, truyền đạt các kiến thức cần thiết ngay
từ những ngày đầu bước chân đến giảng đường.
Cảm ơn tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ Sản- K30 đã giúp đỡ và đóng góp những ý
kiến quý báo trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài.
Và cuối cùng xin chân thành cảm tạ cha mẹ tơi, gia đình tơi đã hết lịng nuôi
dưỡng, thương yêu, bảo bọc và tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể lớn lên,
được giáo dục và có được thành quả như ngày hơm nay.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

i

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TĨM TẮT
Để tìm hiểu đặc điểm mơ bệnh học bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan
lập biểu mô (IHHNV) trên tôm sú giống, trước tiên ứng dụng kỹ thuật PCR
(dùng bộ kit IQ 2000 TM) xét nghiệm 66 mẫu được15 mẫu dương tính. Sau đó,
tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu đã xét nghiệm bằng phương pháp
truyền thống (Lightner, 1996). Quá trình thực hiện từ tháng 01/ 2008 đến
tháng 05/ 2008 tại khoa thuỷ sản trường Đại Học Cần Thơ.
Kết quả quan sát trên tiêu bản mô học cho thấy khi tôm bị bệnh IHHNV biểu
hiện dưới mức độ vi thể là thể vùi IHHNV trong nhân phì đại của các tế bào
biểu mơ dưới vỏ, mang, cơ quan tạo máu, tuyến râu, cơ, mô liên kết gan tuỵ
cũng như hiện tượng hoại tử làm mất cấu trúc bình thường trên các cơ quan
này.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR........................................................... 13
Hình 4.1: Lớp biểu mơ dưới vỏ tơm nhiễm IHHNV .......................................... 17
Hình 4.2: Cấu tạo vi thể của mang bị nhiễm IHHNV......................................... 18
Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A trên mô liên kết gan tuỵ và sự hoại tử với
nhiều khoảng trống........................................................................................... .19
Hình 4.4: Tuyến râu tơm sú nhiễm IHHNV ....................................................... 20
Hình 4.5: (A) Cơ tơm sú bình thường; (B) Cơ tơm sú bị bệnh. .......................... 21
Hình 4.6: Mơ tạo máu nhiễm IHHNV ............................................................... 22
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
bp

= Base pair

ĐBSCL = Đồng Bằng Sông Cửu Long
IHHNV = Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus
NTTS

= Nuôi Trồng Thuỷ Sản

Trung tâmTSHọc liệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

= Thủy Sản
ORF

= Open Reading Frame

PCR

= Polymerase Chain Reaction

µl

= Micro lít

nm

= Nano mét

ADN

= Acid Deoxyribonucleotide

%

= Phần trăm

WSSV

= White spot syndrome virus

YHV

= Yellow head virus

iii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Trung

Việt Nam có truyền thống lâu đời trong các hoạt động khai thác và NTTS
(Nuôi Trồng Thuỷ Sản). Ngành thuỷ sản đóng góp hơn 3% GDP trong hơn
mười năm qua và được xem là một trong những ngành có bước trưởng thành
nhanh chóng nhất trong thập kỷ vừa rồi. Tháng 12/ 1999 Chính phủ đã thơng
qua chương trình phát triển NTTS Việt Nam giai đoạn 2000- 2010, trong đó
chỉ ra rằng đến năm 2010 tổng sản lượng NTTS phải đạt 2 triệu tấn, kim ngạch
xuất khẩu đạt 2,5 tỷ đơ la (Tạp chí TS, số 6, 2007). Riêng sản lượng tôm nuôi
năm 2004 theo Bob Rosenberry, Việt Nam đứng thứ hai trên thế giới (350.000
tấn) vượt cả Thái Lan (300.000 tấn). Thu nhập ngoại tệ từ NTTS tăng lên hàng
năm và chỉ riêng tôm đã mang lại ước tính gần một tỷ USD. Thật vậy, hiện
nay tơm sú (Penaues monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm
cao và cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở
Châu Á. Tuy nhiên khi nuôi thuỷ sản phát triển theo hướng năng suất cao thì
ln đi kèm theo sự phát triển của dịch bệnh và đó ln là một trong những
khó khăn của NTTS. Ở Việt Nam, dịch bệnh trong NTTS trong vài năm qua
đã cho thấy đây là một trong những yếu tố giới hạn rất quan trọng mà cần phải
các giải
phụcThơ

nhằm@
đưaTài
nghề
nihọc
thuỷ tập
sản phát
triển theo cứu
tâmcóHọc
liệupháp
ĐHkhắc
Cần
liệu
và nghiên
hướng bền vững. Bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng trong nuôi tôm sú hay
bệnh mủ gan và ký sinh trùng trên cá da trơn là những bệnh nguy hiểm và gây
tác hại nghiêm trọng cho nghề ni. Trong đó, tơm sú nhiễm virus gây bệnh
đốm trắng có tỷ lệ chết rất cao (> 80%) mà chưa có thuốc trị hiệu quả (Tạp chí
TS, số 6, 2007). Trong khi đó thì IHHNV (Infectiuos Hypodermal and
Haematopoietic necrosis) là tác nhân nguy hiểm nhất ở tôm P. stylirostris và
P. vannamei (Kalagayan et al., 1991). IHHNV là virus gây bệnh hoại tử cơ
quan tạo máu và cow quan lập biểu mô ở tôm Penaeid, lần đầu tiên phát hiện
vào năm 1981 ở Hawai khi gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris (Lightner et
al., 1983). Theo Carpenter & Brock (1992) IHHNV gây thiệt hại nặng nề về
mặt kinh tế vì gây chết 90% tơm P. stylirostris sau hai mươi ngày thả nuôi.
Tuy virus này không gây chết cho tôm sú nhưng lại là một trong những tác
nhân gây chậm lớn, dị hình (Flegel, 1997). Mặc khác các đợt dịch bệnh do
IHHNV gây ra có thể xảy ra bất cứ mùa nào trong năm và tôm giống là rủi ro
nhất.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì các phương pháp
chẩn đốn bệnh trong thuỷ sản cũng ngày càng tiến bộ. Trước tiên phải kể đến

PCR (Polymerase Chain Reaction), đây là kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


một cách nhanh nhất, được phát minh và đặt tên bởi Mullis & ctv vào năm
1985. Bên cạnh đó phương pháp mơ bệnh học là một phương pháp góp phần
quan trọng vào việc chẩn đoán bệnh thuỷ sản, đặc biệt là bệnh tôm. Mô bệnh
học không chỉ mô tả các tổn thương ở các mô và tế bào ở mức độ vi thể mà
còn so sánh đối chiếu các tổn thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá,
tơm, nhuyễn thể (Lightner and Bell, 1988). Để ứng dụng mô bệnh học vào
việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh IHHNV trên tơm sú cũng như tìm hiểu về
đặc điểm mơ học của virus này đề tài ”Tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học ở tôm
sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)” được thực
hiện.
Mục tiêu:
Mô tả đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú nhiễm IHHNV ở Việt Nam.
Nội dung:
Xét nghiệm IHHNV trên tơm sú giống bằng PCR nhằm tìm ra mẫu bị bệnh.
Tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu dương tính với IHHNV.
Quan sát đặc điểm mơ bệnh học ở tôm nhiễm IHHNV.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam
Trên thế giới:
Các quốc gia tham gia sản xuất tôm khu vực Châu Á hiện nay như Thái Lan
đã cơ bản giải quyết được các vấn đề về kỹ thuật, công nghệ nuôi tôm. Ấn Độ
cũng đang có nhiều cố gắng để cải tiến các biện pháp khoa học công nghệ. Ở
các quốc gia này nhiều biện pháp kỹ thuật tiên tiến đã được áp dụng vào sản
xuất tơm giống có chất lượng cao như: sàng lọc tôm bố mẹ sạch bệnh bằng
phương pháp kiểm tra PCR, hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường sử
dụng các chế phẩm sinh học, áp dụng các phương pháp kiểm dịch vệ sinh
nghiêm ngặt, … Ấn Độ và Thái Lan đã thành lập các ngân hàng tơm bố mẹ có
khả năng kháng bệnh và đang nghiên cứu phát triển đàn tôm bố mẹ thông qua
phương pháp thuần hố, … Tóm lại đẩy mạnh phát triển khoa học cơng nghệ
nhằm nâng cao tính bền vững của ni tôm là ưu tiên hàng đầu của người sản
xuất và các quốc gia xuất khẩu tôm (Nguyễn Thị Ngọc, 2007).
song
với ĐH
việc tăng
số lượng
bệnh
tơmhọc
cũng tập
ngày và
càngnghiên
phát triển cứu
Trung tâmSong
Học
liệu
Cần
Thơ tơm
@ thì

Tài
liệu
nhiều và xuất hiện nhiều bệnh lạ chưa có giải pháp điều trị. Theo Bùi Quang
Tề (2006) thì có gần 30 bệnh và hội chứng của tôm nuôi với một số tác nhân
gây bệnh quan trọng như virus, vi khuẩn, nấm và nguyên sinh động vật. Hiện
nay chưa có phương pháp nào điều trị bệnh virus thành công ở tôm.
Ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thực sự phát triển vào năm 1987 và nuôi tôm
thương phẩm phát triển vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ trước. Đến
giữa thập kỷ 90 (1994 – 1995) phát triển nuôi tơm ở Việt Nam có phần chững
lại do gặp phải nạn dịch bệnh tôm. Trong các năm 1996 – 1999 dịch bệnh có
giảm nhưng vẫn tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi (Phạm Văn Công, 2007).
Năm 2000 được xem là năm đánh dấu sự bùng nổ của nghề nuôi tơm thương
phẩm khi chính phủ ban hành nghị quyết 09 cho phép chuyển đổi một phần
diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hố sang NTTS (Tạp
Chí Thuỷ Sản, số 6, 2007)
Theo Hanafi & T. Ahmad (1999) (trích dẫn từ Lê Khanh (2006)) thì diện tích
ni tơm ở Việt Nam tăng từ 250.000 ha năm 2.000 sang 478.000 ha năm
2001 và 540.000 ha năm 2003, cho đến nay diện tích ni tơm vẫn tiếp tục

3

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


tăng tuy nhiên tốc độ đã có phần chững lại. Theo số liệu hiện có Việt Nam là
nước có diện tích ni tơm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonesia, nước
có diện tích ni tơm lớn nhất vào năm 1996 (khoảng 360.000 ha).
Phần lớn diện tích ni tơm tập trung ở ĐBSCL, rãi rác dọc các cửa sông,
kênh, gạch, ven biển miền Trung và ở đông bằng sông Hồng, sơng Thái Bình

ở miền Bắc. ĐBSCL được đánh giá là vùng trọng điểm về NTTS của Việt
Nam với hơn 1 triệu ha diện tích mặt nước ngọt và lợ. Năm 2003, ĐBSCL sản
xuất khoảng 0,67 triệu tấn thuỷ sản chiếm 64,6% sản lượng thuỷ sản nuôi cả
nước và hơn 55% tổng giá trị xuất khẩu (Bộ Thuỷ Sản, 2004).
Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng ni tôm cũng tăng mạnh từ
những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000. Các lồi tơm ni chính ở Việt
Nam bao gồm: tôm sú (Penaeus monodon), tôm he (Penaeus merguiensis),
tơm đất (Metapenaeus ensis), … trong đó tơm sú là tơm ni chủ đạo đóng
góp sản lượng cao nhất. Các thị trường xuất khẩu tôm quan trọng của Việt
Nam là: Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc và Liên Minh Châu Âu (Hanafi & T.
Ahmad, 1999 trích dẫn từ Lê Khanh, 2006).
2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV
2.2.1 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh IHHNV

Trung tâmIHHNV
Học làliệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
virus nhỏ nhất thuộc họ Parvoviridae, họ phụ Densovirinae, giống
Brevidensovirus hoặc Contravirus (Shike et al., 2000). Virus có cấu trúc khối
20 mặt, khơng có màng bao, đường kính từ 19 – 22 nm, ADN sợi đơn
(Lightner et al., 1983). Hệ gen của IHHNV gồm 3 đoạn ORF (Open Reading
Frame): ORF1, ORF2, ORF3 (Nunan et al., 2000). Trong đó đoạn ORF1
chiếm khoảng 50% hệ gen và khơng chứa protein cấu trúc, có khả năng mã
hố một chuỗi polypeptit dài 666 amino acid (Tratschin et al., 1984; Hermonat
et al., 1984). Đoạn ORF2 cũng không chứa protein cấu trúc, có khả năng mã
hố chuỗi polypeptit gồm 434 amino acid (Shike, 2000). Cuối cùng là đoạn
ORF3, đoạn này có khả năng mã hoá chuỗi polypeptit dài 329 amino acid.
Thành phần cấu tạo gen của IHHNV là: 20,68% A, 19% C, 24,04% G, 36,28%
T và A + T= 56,96%; G + C= 43,04%. Đoạn ORF3 có 4 chuỗi polypeptit với
trọng lượng phân tử lần lượt là 74, 47, 39, 37,5 kda. ADN có tính phân cực

(85% âm cực, 15% dương cực) (Regenmortel et al., 2000 được trích dẫn bởi
Bùi Thị Bích Hằng, 2007).
Về đặc điểm mơ học, sau khi IHHNV tấn công vào tế bào vật chủ tạo thể vùi
Cowdry loại A trong nhân tế bào làm nhân phì đại. Thể vùi ưa eosin nằm ở
trung tâm nhân, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể bởi một vịng sáng khơng
nhuộm màu. Thể vùi xuất hiện trong nhân tế bào ở một số cơ quan: mang, biểu
4

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


mô dưới vỏ, tế bào hệ thần kinh, tuyến râu, mô tạo máu, tế bào tuyến sinh dục
tổ chức limpho, mô liên kết, cơ, tim, hồng cầu. (Bell & Lightner, 1984,
Lightner, 1996).
2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý
Theo Bell & Lightner (1984) thì biểu hiện chung khi 3 lồi tơm P. stylirostris,
P. vannamei, P. monodon nhiễm IHHNV là hội chứng dị hình, còi cọc (RDS:
runt deformity syndrome). Biểu hiện riêng của từng lồi như sau:
Khi tơm P. stylirostris nhiễm IHHNV dạng cấp tính, tơm nổi lên mặt nước,
xoay trịn rồi chìm xuống đáy, bỏ ăn, hôn mê, xuất hiện chấm lốm đốm ở lớp
vỏ ngoài, cơ đục, tỷ lệ chết cao. Biểu hiện về mặt mô học là sự hoại tử, viêm
sưng lớp biểu mô dạ dày, ruột, mang, cơ, hệ thần kinh, mô liên kết và mô tạo
máu, đồng thời xuất hiện thể vùi Cowdry loại A trong nhân của những tế bào
trên (Lightner et al., 1983).

Trung

Đối với tôm P. vannamei thì IHHNV khơng gây tỷ lệ chết cao như P.
stylirostris nhưng cũng không kém phần nguy hiểm. IHHNV làm tôm chậm
lớn, dị hình, cịi cọc (Kalagayan et al., 1991). Tơm giống chậm phát triển, dị

hình, râu quăn queo, vỏ kitin xù xì hoặc biến dạng. Tuy vậy, khi tơm mới
nhiễm bệnh thường khơng có biểu hiện rõ ràng (Bell & Lightner,1984;
tâmLightner
Học liệu
Tài
họccótập
vàhiện
nghiên
et al., ĐH
1983).Cần
Phân Thơ
tích mơ@
bệnh
họcliệu
cho thấy
sự xuất
thể vùi cứu
Cowdry loại A ở tế bào thần kinh, tuyến râu, lớp biểu bì dưới vỏ, mơ tạo máu
nhưng khơng tìm thấy ở tổ chức limpho cũng như cơ tim (Kalagayna et al.,
1991).
Tôm sú P. monodon khi nhiễm IHHNV lúc sắp chết thường chuyển sang màu
xanh, cơ phần bụng mờ đục (Lightner et al., 1983). P. monodon ở Philippin
khi nhiễm bệnh chậm phát triển, cịi cọc, riêng tơm đực thì chất lượng tinh
dịch không tốt (Primavera & Quinitio, 2000). Tuy nhiên, ở Thái người ta chưa
đánh giá mức độ ảnh hưởng của IHHNV trên tôm sú (Chayaburakul et al.,
2005).
2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh
IHHNV được phát hiện đầu tiên vào năm 1981ở Hawai khi gây chết hàng loạt
tôm P. stylirostris (Lightner et al., 1983). Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi
như Tahiti, Florida, Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize,

Ecuador, Brazil, Honduras, France và Jamaica (Vega- Villasante & Puente,
1995). Ấu trùng tôm P. stylirostris thường lây nhiễm IHHNV từ nguồn tôm bố
mẹ, tuy nhiên virus không gây ảnh hưởng ngay trong vài tuần đầu, nó chỉ gây
chết khi ấu trùng tôm đạt trọng lượng 0,05 – 0,1g (Lightner et al., 1983). Bệnh

5

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


xuất hiện từ giai đoạn ấu trùng đến tôm trưởng thành. Tuỳ vào mức độ nhiễm
mà có biểu hiện bệnh khác nhau. Bệnh xuất hiện cả ở Singapore, Thái Lan,
Philippines, Indonesia, Malaysia. Virus có thể lây lan theo chiều dọc và chiều
ngang (Bell & Lightner, 1984). Lightner (1996) cho biết khi nuôi ấu trùng và
tôm giống với mật độ cao rất dễ mắc bệnh. IHHNV có thể lây nhiễm ở nhiều
lồi tơm Penaeid: P. stlirostris, P. vannamei, P. monodon, P. japonicus, P.
aztecus và P. duoraum nhưng chỉ gây thiệt hại nặng nề cho P. stylirostris, P.
vannamei (Lightner, 1996). Ngoài những lồi tơm kể trên cịn có P.
occidentalis, P. californiensis, P. semisalcatus, P. setiferus, P. indicus, P.
merguiensis cũng có khả năng nhiễm IHHNV (V A. Graindorge & T W.
Flegel, 1999 trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006).
2.2.4 Chẩn đoán bệnh
Dựa vào dấu hiệu bệnh lý
Xét nghiệm PCR
Quan sát tế bào tuyến râu, mang, biểu mô dưới vỏ,…của tôm trên tiêu bản cắt
mô nhuộm màu hematoxylin & eosin.
2.2.5 Thiệt hại do IHHNV gây ra
gây thiệt
nặngThơ
nề về

tế học
vì gâytập
chếtvà
90%
tơm P. cứu
Trung tâmIHHNV
Học liệu
ĐHhại
Cần
@mặt
Tàikinh
liệu
nghiên
stylirostris sau 20 ngày thả nuôi (Carpenter & Brock, 1992). Theo Lightner &
Redman (1998) thì thiệt hại do IHHNV gây ra trên tôm P. vannamei là 10% 50%, tôm tự nhiên ở Ecuador 63%, tôm nuôi Panama 95%. Trong bài báo của
mình, Lê An (2007) cho biết virus gây hoại tử xuất hiện thành dịch gây thiệt
hại 70% - 80% tôm nuôi P. vannamei năm 2004 tại các vùng nuôi ở Brazil và
vẫn còn nguy cơ báo động trở lại. IHHNV thường xuất hiện sau khi thả 30
ngày làm tôm bị biến dạng chuỷ, cơ thể cong queo, nếu tôm bệnh nhẹ tỷ lệ
biến dạng là 10% - 20%, trường hợp bệnh nặng biến dạng 70% - 80%. Các đợt
dịch có thể xảy ra bất cứ mùa nào trong năm.
2.2.6 Những nghiên cứu về bệnh
Khi tơm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như: mang,
biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh, … Những bộ phận này thường
được sử dụng để chẩn đoán bệnh bằng phương pháp mô bệnh học (Lightner et
al.,1983; Bell & Lightner, 1984). So sánh trình tự nucleotit của IHHNV gây
bệnh trên tơm P. vannamei Mỹ và P. stylirostris, Bonami et al (1990), Shike et
al (2000) cho biết sự giống nhau đó là 99,5%. Jimenez et al (1999) đã phát
triển phương pháp lai tại chỗ để chẩn đoán bệnh IHHNV, phương pháp này
nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng cần thời gian dài để hoàn thành (2- 3

6

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


ngày). Nghiên cứu sâu hơn ở mức độ phân tử, dịng IHHNV trên tơm M.
rosenbergii có trình tự nucleotit tương đồng với IHHNV trên tôm P. monodon
ở Đài Loan là 99,7% (Hsieh et al., 2003). IHHNV có thể gây ra tỷ lệ chết cao
ở tôm post Macrobrachium rosenbergii cũng như P. stylirostris nhưng cơ
quan đích khác nhau (Hsieh et al., 2006).

Trung

Hiện nay đã sản xuất được kháng thể đơn dòng của IHHNV. Bên cạnh đó, Dot
blot, lai western, hố mơ miễn dịch là những phương pháp chuẩn để đánh giá
sự tiện dụng của loại kháng thể này. Kháng thể có thể phát hiện IHHNV với
độ nhạy 0,1- 0,5x 10-3 µg/µl protein GP3. Đồng thời cũng thể hiện băng đậm
khi phát hiện vi khuẩn Ecoli chứa protein tái tổ hợp GP3- pETI 5b ở vị trí 37
kda với độ pha lỗng 1: 1000. Mặt khác, kháng thể với nồng độ 1: 10 cũng cho
phản ứng đặc hiệu khi bao xung quanh các thể vùi IHHNV ở nhiều bộ phận
của tôm bị nhiễm bệnh như: mang, dây thần kinh, cơ, tế bào biểu bì (Bùi Thị
Bích Hằng & Timothy W. Flegel, 2007). Melena et al (2005) thực hiện cảm
nhiễm lần đầu cho ấu trùng và hậu ấu trùng tôm P. vannamei virus IHHN
hoặc WSSV đã được bất hoạt bằng formalin. Kết quả sau quá trình gây cảm
nhiễm và kiểm chứng kết luận: tiền cảm nhiễm IHHNV cũng như WSSV bất
hoạt đều có tác dụng làm chậm khả năng sao chép của WSSV, giảm tỷ lệ tơm
chết. Qua đó cho thấy vai trị bảo vệ của IHHNV như một virus ức chế quá
tâmtrình
Học

ĐH
Cần(Melena,
Thơ @
Tài liệu học tập và nghiên cứu
sinhliệu
sản của
WSSV
2005).
2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh:
2.3.1 Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự
ADN chuyên biệt một đoạn ADN với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi
(Olygonucleotides), enzyme tổng hợp ADN, các nucleotit tự do, dung dịch
đệm theo các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis
và các cộng sự (Mỹ) vào năm 1985. Đây là một kỹ thuật rất nhạy bén và đặc
biệt cho phép tìm ra rất nhanh chóng chỉ với một lượng virus rất thấp . Những
virus ẩn khơng có các biến đổi về mơ học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật
này và hiện nay nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để
phát hiện và tạo ra đột biến gen, chẩn đoán bệnh, …
Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều
chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1 (giai đoạn biến tính): phân tử ADN được làm biến tính ở nhiệt độ cao
hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử ADN, thường là 92 – 95oC trong 30 – 60
giây. Mạch đôi ADN tách ra thành mạch đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp các
đoạn mồi.
7

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Bước 2 (giai đoạn gắn mồi): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt
độ nóng chảy, các đoạn mồi sẽ bắt cặp mạch đơn ADN khuôn ở vị trí bổ xung.
Nhiệt độ này dao động từ 45 – 65oC trong khoảng thời gian là 1phút. Nhiệt độ
này có thể thay đổi vì thay đổi cặp mồi.
Bước 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho ADN
polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Lúc này các đoạn mồi đã bắt cặp
ADN khuôn mẫu sẽ được kéo dài. Thời gian của bước này tuỳ thuộc độ dài
của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
Mỗi chu kỳ trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp
đôi mẫu của lần trước. Đây là sự lặp lại theo cấp số nhân, tối đa là 40 chu kỳ
với khoảng 106 bản sao.
Sau phản ứng PCR các ADN được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể
quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và đọc kết
quả dưới bàn đọc UV.
2.3.2 Phương pháp mô học:
Các định nghĩa về mô bệnh học:

Trung

Mô học là môn khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào. Nghĩa
mô tả liệu
đầy đủĐH
mọi Cần
chi tiết Thơ
của tổn@
thương
ở mức
độ tập
vi thể.và
Mônghiên

bệnh học cứu
tâmlà Học
Tài đó
liệu
học
khơng chỉ mơ tả tổn thương mà cịn là cơng việc so sánh, đối chiếu các tổn
thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá, tôm, nhuyễn thể, nghĩa là tìm
hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng,
trên cơ sở đó xác định việc chẩn đốn (Lightner and Bell, 1988 trích dẫn từ
Phạm Trần Ngun Thảo, 2003).
Mơ học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiết kính hiển vi đầu tiên được chế
tạo bởi Antoni Van Leuwenhock người Hà Lan, đến cuối thế kỷ XVIII Robert
Hooke đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Ơng đã nghiên cứu
rất nhiều về mơ và có viết một tài liệu ngắn về mơ bệnh học nói về đặc điểm
của những tế bào chết (sự hoá lỏng, hoá rắn và sự biến đổi hình dạng nhân của
tế bào chết), phản ứng sinh lý của cơ thể khi bị nhiễm bệnh và phương pháp
kỹ thuật để làm tiêu bản mơ bệnh học.
Mơ học có thể được định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào
có cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành do q trình
tiến hố sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hố .
Trong thuỷ sản mơ học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh
tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đốn được bệnh bằng phương pháp
này. Tuy nhiên cũng có những hạn chế là thao tác chậm, tốn nhiều thời gian và
8

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


chỉ phát hiện rõ khi tôm đã bị nhiễm nặng. Phương thức mô chỉ nên sử dụng
như là một lĩnh vực trong việc xác định nguyên nhân của bệnh. Nó phải được

kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khoẻ tôm nghĩa là so sánh
và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài để có được một chẩn đốn
đúng. Nếu chỉ dựa vào các hình thái tổn thương bên trong mà khơng biết các
dữ kiện khác có liên quan thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình
thái tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau .
Một số ứng dụng cuả mô bệnh học:
Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong
việc hệ thống bệnh thường gặp trong nuôi tôm ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner
et al, 1992). Thời gian sau, Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của
vi rút đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc quan sát
tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử. Một năm sau đó, năm
1998, Sudha và ctv bằng phương pháp mơ học đã xác định mối quan hệ giữa
các loài vi rút gây nhiễm trên các lồi tơm biển ở Ấn Độ.

Trung

Ở Việt Nam năm 1999, Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú
nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR, bằng việc kết hợp hai
phương pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc điểm mô học của các tác nhân
bệnhliệu
trên tôm
Năm Thơ
sau ông@
cũng
ứngliệu
dụnghọc
kỹ thuật
nghiên cứu
tâmgây
Học

ĐHsú.Cần
Tài
tậpnàyvàtrong
nghiên
cứu đề tài về bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ. Phương pháp mơ học cũng được
Hồ năm 2001 ứng dụng trong việc xác định cường độ cảm nhiễm MBV. Bùi
Quang Tề (2003) đã ứng dụng kỹ thuật mô học vào chẩn đốn bệnh tơm và
nêu ra phương pháp phòng trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003
đã ứng dụng kỹ thuật mơ học trong chẩn đốn bệnh đốm trắng ở tơm sú. Qua
đó, tác giả đã mơ tả hầu hết đặc điểm các cơ quan trên tôm bình thường và tơm
bệnh.
Cho đến nay, mơ bệnh học vẫn ln đựơc ứng dụng trong nhiều trường hợp để
chẩn đốn tác nhân gây bệnh trên cá, tơm, nhuyễn thể nói chung.

9

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu:
Địa điểm:
Phịng thí nghiệm bệnh học thuỷ sản, khoa thuỷ sản, trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian:
Tháng 01/ 2008 đến tháng 05/ 2008.
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:
Vật liệu nghiên cứu:
Mẫu tôm sú giống được thu từ những hộ dân đem mẫu đến phòng thí nghiệm
để xét nghiệm bệnh.

Phương pháp nghiên cứu:
3.2.1 Chẩn đốn bệnh IHHNV bằng kỹ thuật PCR theo bộ kit IQ

Trung tâm2000
Học
TM liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Dụng cụ và hố chất:
Máy PCR

Máy chụp hình gel

Bộ micropippet

Cân

Ơng típ 2ml và 0.5ml

Bơ kit WSSV/ IQ 2000

Đầu cone xanh, vàng

Agarose

Máy ủ

Ethanol

Máy trộn mẫu

Ethidium bromide

Máy li tâm

Dung dịch điện di TAE

Máy điện di

Nước cất

Ly trích ADN bằng lysis buffer
Lấy 500µl lysis buffer
Cho 20 – 25 tơm bột vào ống eppendoff 1.5ml và nghiền kỹ.
Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 95 oC trong 10 phút, sau đó ly tâm (12000 vòng/ phút)
trong 10 phút.
10

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Chuyển 200µl phần trong ở trên sang ống eppendoff 1.5ml mới có chứa 400µl
dung dịch 95 ethanol.
Lắc nhẹ và ly tâm (12000 vịng/ phút) trong 5 phút. Sau đó rút bỏ dung dịch
ethanol và làm khơ ADN.
Hồ tan ADN với 200µl dung dịch TE. Sau khi hồ tan xong trữ mẫu ở tủ lạnh
-20oC cho đến khi sử dụng.
Thực hiện các thao tác PCR
Chuẩn bị hố chất phản ứng:
PCR: 13µl/ phản ứng.
Chuẩn bị các hoá chất cần thiết sau:
Pre- Mix reagent:

12,5µl

Iqzyme ADN polymerase 2UI/ µl: 0.5µl
Các thao tác thực hiện phản ứng
Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng PCR được thực hiện dựa theo số lượng
mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị cần tính thêm đối chứng dương và một
mẫu đối chứng âm.

Trung tâmCho
Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13µl hỗn hợp trên vào típ nhựa 0.2ml đã được làm dấu.
Thêm 2µl ADN mẫu hoặc mẫu chuẩn vào mỗi phản ứng.
Thực hiện PCR theo điều kiện phản ứng sau:
94oC trong 20 giây
70oCtrong 20 giây
Lặp lại chu kỳ trên 10 lần
94oC trong 20 giây
56oC trong 20 giây
72oC trong 30 giây
Lặp lại chu kỳ trên 35 lần
72oC trong 30 giây
20oC trong 30 giây
Điện di:
Chuẩn bị bản thạch

11

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Qúa trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch (1%
agarose).
Đun nóng dung dịch agarose bằng lị vi sóng cho tới khi agarose tan hồn
tồn. Sau đó, để dung dịch agarose nguội khoảng 50 - 60oC, cho Ethidium
bromide vào và đổ từ từ agarose vào khay đựng gel đã chuẩn bị trước. Thể tích
gel tuỳ thuộc vào khay gel. Khi gel đặc lại cẩn thận gỡ lược gel và các keo dán
ở hai bên ra khởi khay đựng gel. Gel sẽ được điện di.
Điện di
Đầu tiên, đặt gel vào bồn điện di (phân tử ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang
cực dương vì ADN mang điện tích âm), thêm dung dịch điện di TAE 0.5X vào
bồn cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel.
Dùng pipette hút 10µl mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X Loading Dye
cho vào từng giếng một.
Phải dùng thang ADN cho từng gel để xác định trọng lượng phân tử của mẫu
cần phân tích.

Trung

Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện, điều chỉnh dòng điện là 90V và thực
hiện quá trình điện di. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển đến khoảng
đến 2/3
gel.ĐH
Sau đó
tiến hành
quả.liệu học tập và nghiên cứu
tâm1/2Học
liệu
Cần

Thơđọc
@kếtTài
Đọc kết quả:
Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng 438bp, 644bp thì mẫu dương tính với
IHHNV.
Nếu mẫu chỉ hiện lên vạch tương ứng vạch 243bp thì mẫu âm tính với
IHHNV.

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR (Nguồn Interligene Farming)

Cột 1: mẫu chuẩn một, 20000 bản sao/ phản ứng.
Cột 2: mẫu chuẩn một, 2000 bản sao/ phản ứng
Cột 3: mẫu chuẩn một, 200 bản sao/ phản ứng
Cột 4: nước cất

12

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Cột 5: mẫu nhiễm IHHNV nặng.
Cột 6: mẫu nhiễm IHHNV trung bình
Cột 7: mẫu nhiễm IHHNV nhẹ.
Cột 8: mẫu khơng nhiễm IHHNV.
Cột M: trọng lượng phân tử được đánh dấu 848, 630, 333bp.
3.2.2 Kỹ thuật mô học: (phương pháp của Lightner, 1996)
Dụng cụ và hoá chất:
Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, máy cắt lát, lame, lamelle, khn đúc,
khai nhuộm, máy ảnh, …
Hoá chất: dung dịch cố định Davidson’s, nước cất, cồn tuyệt đối, xylen,

parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin, keo Canada palsam, …
Phương pháp làm tiêu bản mô học
Cho tôm post trực tiếp vào dung dịch cố định Davidson’s trong vịng 12 đến
24 giờ, sau đó mẫu được chuyển sang giữ ở cồn 70o.
Xử lý mẫu
trìnhliệu
xử lýĐH
mẫu Cần
mơ tômThơ
(Coolidge
và Howard,
1997)
được
đặt trong cứu
Trung tâmQui
Học
@ Tài
liệu học
tập
vàcàinghiên
máy xử lý mô theo các bước:
STT

Hoá chất sử dụng

Thời gian (phút)

1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12

Cồn 80o
Cồn 95o
Cồn 95o
Cồn 100o
Cồn 100o
Cồn 100o
Cồn 100o
Xylen
Xylen
Parafin - Xylen (7:3)
Parafin - Sáp ong (1: 1)
Parafin - Sáp ong (7:1)

30
60
30
60
180
180
180

30
30
60
60
60

Sau khi hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mơ thì tiến hành cho sọt
chứa mẫu mô vào lọ số 1 và cho chương trình được cài đặt trên vận hành.
Đúc khối:

13

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Sau q trình xử lý, chuyển khn nhựa chứa mẫu sang vị trí số 2 của máy đúc
khối. Để khối mơ trong parafin khoảng 30 phút, sau đó tiến hành đúc khối.
Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối
bằng parafin nóng chảy ở 65oC. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho
paraffin nóng chảy vào khn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí cho
khn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí ở trong khn. Đặt
khn nhựa xử lý có kí hiệu lên trên, cho thêm ít parafin để cố định khn
nhựa. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để parafin rắn lại,
sau đó tách khối parafin có chứa mẫu ra khỏi khuôn.
Cắt lát mẫu mô
Chuẩn bị máy cắt
Đặt dao vào máy cắt vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của
khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15- 30 o.
Cắt mẫu
Trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt. Có thể bắt đầu

bằng những lát cắt 10- 12µm. Sau khi khối mẫu đạt đến vị trí mong muốn điều
chỉnh độ dày của lát cắt khoảng 4µm và tiến hành cắt lát mẫu.
cắt vào
phiến
kính@ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trung tâm HọcDán
liệulátĐH
Cần
Thơ
Chuẩn bị một chậu nước ấm 40 – 50 oC lát cắt sẽ được thả nổi và thẳng ra
trong nước ấm, nhúng phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một
đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính
ra khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính.
Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khơ tiêu bản trong khoảng 12 giờ trong tủ
sấy ở nhiệt độ 37oC hoặc sấy khô bằng bàn sấy ở 45- 60oC để loại bỏ parafin.
Nhuộm tiêu bản: theo Mayer’s gồm các bước sau:
STT

Hoá chất sử dụng

Thời gian (phút)

1
2
3
4
5
6
7
8

9

Xylen
Xylen
Xylen
Cồn 100o
Cồn 100o
Cồn 70o
Nước cất
Haematoxylin
Nước máy

5
5
5
5
5
2
5
1
5

14

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


10
11
12

13
14
15
16
17

1% acid alcohol
Nước máy
Eosin
Cồn 95o
Cồn 100o
Cồn 100o
Xylen
Xylen

10 giây
1
2
5
5
5
5
5

Dán tiêu bản:
Sử dụng keo Canada để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ một giọt keo lên trên lam
có chứa mẫu, dán lamelle lên trên ngay vùng có miếng mơ. Thao tác này cần
làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong khơng khí vào miếng mơ.
Đọc kết quả:
Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40X - 100X. Hình

được chụp ở vật kính 100X khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh ở những cơ quan
của tôm.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

15

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả xét nghiệm PCR
Qua 66 mẫu tôm sú giống do các hộ dân mang lên xét nghiệm PCR (WSSV,
IHHNV, YHV) từ tháng 03/ 2008 đến tháng 04/2008 được 15 mẫu dương tính
với IHHNV và âm tính với các tác nhân WSSV, YHV.
1

2

3

4

5

6

Cột 1: Thang AND

Cột 2: Đối chứng dương

Cột 3: Đối chứng âm

Cột 4: Mẫu dương tính

Cột 4: Mẫu dương tính

Cột 5: Mẫu âm tính

Trung tâm 4.2
HọcKếtliệu
Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
quả ĐH
mô học
4.2.1 Những biến đổi mô học ở lớp biểu mô dưới vỏ tôm sú nhiễm
IHHNV.
Lớp biểu mô dưới vỏ là một trong những cơ quan đích mà IHHNV tấn cơng.
Lớp này được cấu tạo bởi nhiều tế bào biểu mô. Kết quả quan sát mô học cho
thấy hầu hết các mẫu nhiễm IHHNV đều xuất hiện thể vùi. Thể vùi IHHNV có
dạng trịn, nhân tế bào phình to và bắt màu hồng đậm với eosin.

Hình 4.1: Lớp biểu mô dưới vỏ tôm nhiễm IHHNV, mũi tên chỉ thể vùi IHHNV (E100).

16

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Trong nghiên cứu của mình về IHHNV trên tơm lai P. esculentus x
P.monodon ở Úc thì Owens & ctv (1992) cũng đã tìm thấy thể vùi Cowdry

loại A ở lớp biểu mô dưới vỏ. Thể vùi ưa eosin làm nhân phình to, nằm ở
trung tâm nhân. Ngồi ra ơng cịn tìm thấy thể vùi ở những cơ quan: mang, lớp
biểu mô dưới vỏ, tuyến râu, tuyến sinh dục, tim, tổ chức limpho, mô tạo máu,
hệ thần kinh, cơ.
4.2.2 Những biến đổi mô học ở mang tôm sú nhiễm IHHNV.
Cơ quan hô hấp của tôm sú là mang nằm ở gốc các đôi phần phụ của phần đầu
ngực, từ đôi chân hàm số 1 đến số 5. Mang được cấu tạo bởi các sợi mang
hình lơng chim. Các sợi mang có khung kitin nâng đỡ, mặt trong của sợi mang
được bao bọc bởi tế bào biểu mơ lát đơn, phía dưới có nhiều mạch máu phân
bố. Trục chính của mang gắn liền với vách của phần đầu xuyên qua cấu trúc
dạng ống. Những nhánh mang xuất phát từ trục chính gọi là sợi mang sơ cấp.
Từ sợi mang sơ cấp phân chia thành sợi mang thứ cấp (Phạm Trần Nguyên
Thảo, 2003).

Trung

Theo kết quả mô bệnh của 15 tôm nhiễm IHHNV, quan sát thấy thể vùi
Cowdry loại A trong tế bào biểu mơ mang làm nhân tế bào phì đại, thể vùi ưa
eosin nằm ở trung tâm nhân, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể bởi một vịng sáng
màu.ĐH
Mang
khơng
cịn giữ
trúchọc
bìnhtập
thường
một số cứu
tâmkhơng
Họcbắtliệu
Cần

Thơ
@được
Tài cấu
liệu
vànữa,
nghiên
sợi mang sơ cấp tách rời trục chính.

Hình 4.2: Cấu tạo vi thể của mang bị nhiễm IHHNV. Mũi tên vàng chỉ thể vùi Cowdry loại
A, mũi tên xanh chỉ tế bào mang bình thường ( E100).

Lightner et al (1983a) miêu tả biểu hiện bệnh IHHNV trên tôm P. stylirostris
về mặt mô học là sự hoại tử, viêm sưng lớp biểu mô dạ dày, ruột, mang, cơ, hệ
thần kinh, mô liên kết và mô tạo máu, đồng thời xuất hiện thể vùi Cowdry loại
A trong nhân của những tế bào trên. Trong trường hợp này, mẫu tôm sú P.

17

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


monodon chưa thấy sự hoại tử nặng hay viêm sưng các cơ quan như tơm P.
stylirostris.
Sau này trong thí nghiệm của Tang et al ( 2003) thì mơ mang của tôm cho ăn
thức ăn là tôm nhiễm IHHNV cũng quan sát thấy thể vùi Cowdry loại A. Đặc
điểm của thể vùi Cowdry loại A được Owens et al (1992) mô tả rất rõ ràng
bằng kỹ thuật TEM (Transmission electron microscopy) trên mang của tôm lai
P. esculentus x P. monodon. Thể vùi ưa eosin làm nhân lớn dần theo quá trình
phát triển của bệnh, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể bởi một vịng sáng khơng
nhuộm màu, bên trong có chứa nhiều virus.

4.2.3 Những biến đổi mô học ở mô liên kết gan tuỵ tôm nhiễm IHHNV
Gan nằm ở phần đầu cơ thể, gan tơm có dạng khối, có nhiều ống nhỏ hay còn
gọi là ống tiểu quản kết lại rồi tập trung thành ống đổ vào ruột giữa (Bá, 1978
trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003 ). Mô liên kết gan tuỵ nằm giữa
các ống tiểu quản gan tuỵ và có nhiệm vụ liên kết chúng lại. Khi nhuộm
hematoxylin và eosin thì nhân của tế bào này cũng bắt màu xanh dương, vùng
tế bào chất với lưới nội chất có màu xanh nhạt hay tím.

Trung

Qua kết quả quan sát thì mơ liên kết gan tuỵ tơm sú khi nhiễm IHHNV cũng
xuất hiện thể vùi Cowdry loại A. Thể vùi này khơng tìm thấy trên tế bào gan
tâmtuỵHọc
Thơ
Tài
liệu
tập
nghiên
cũng liệu
như tổĐH
chứcCần
limpho.
Đồng@
thời,
ở mơ
liênhọc
kết này
cịnvà
có hiện
tượng cứu

hoại tử làm mất liên kết giữa các ống tiểu quản gan tuỵ tạo nhiều khoảng trống
giữa các ống này.

Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A trên mô liên kết gan tuỵ và sự hoại tử với nhiều khoảng
trống. Mũi tên chỉ thể vùi Cowdry loại A (E100).

Trong một số nghiên cứu trước đây trên tôm P. stylirostris và tôm thẻ chân
trắng (P.vannamei) của Timenez, 1999 cũng cho biết rằng thể vùi IHHNV
thường xuất hiện ở mô liên kết gan tuỵ. Tuy nhiên, Hsieh et al (2006) khi
18

LUAN VAN CHAT LUONG download : add