Khảo sát hiệu quả của chế phẩm SiAgnpsOcts đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành

ĐẠI HOC
NGUYỄN TẤT THÀNH
NGUYEN TAT THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẴM

Si/AgNPs/OCTS ĐÓI VỚI KHẢ NĂNG
KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH

SINH TRƯỞNG TRÊN MÀM ĐẬU NÀNH

Sinh viên thực hiện :

Ngơ Quang Tú

MSSV

1411527830

GVHD

PGS.TS. Lê Quang Luân

ThS. Trần Lệ Trúc Hà

TP. HCM, 2020


MỤC LỰC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. i
MỤC LỤC......................................................................................................................ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... V

SUMMARY.................................................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG BIẺU......................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT................................................................................... ix
ĐẶT
• VÁN ĐÈ................................................................................................................ X

CHƯƠNG 1. TƠNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 1

1.1 Giới thiệu về silica................................................................................................... 1
1.1.1 Silica...................................................................................................................... 1
1.1.2 Cấu trúc của silica................................................................................................. 1

1.1.3 ứng dụng của silica.............................................................................................. 2
1.2 Giới thiệu về chitosan và oligochitosan.................................................................. 2

1.2.1 Chitosan................................................................................................................ 2

1.2.2 Oligochitosan........................................................................................................3
1.2.3 Vai trị của oligochitosan......................................................................................4
1.3 Tơng quan về chitinase........................................................................................... 4

1.4 Giới thiệu về nano bạc............................................................................................ 5

1.4.1 Tổng quan về nano bạc......................................................................................... 5

1.4.2 Tính chất của AgNPs............................................................................................ 5
1.5 Co chế gắn AgNPs lên vi hạt silica sử dụng chitosan làm chất ổn định................. 6
1.6 Độc tính của silica, nano bạc và oligochitosan....................................................... 7

ii


1.7 Tổng quan về nấm................................................................................................... 8

1.7.1 Nam Rhizoctonia solcini........................................................................................ 8

1.7.2 Nam Fusarium oxysporum................................................................................... 9
1.7.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides................................................................. 10
1.8 Đậu tương DT84.................................................................................................. 11
1.9 Tình hình nghiên cứu trong và người nước........................................................... 12

1.9.1 Các nghiên cứu trong nước................................................................................. 12

1.9.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài............................................................................. 12
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu........................... 14
2.1 Nơi thực hiện......................................................................................................... 14
2.2 Nội dung nghiên cứu............................................................................................ 14

2.3 Hóa chất và thiết bị................................................................................................ 14

2.3.1 Hóa chất...............................................................................................................14

2.3.2 Thiết bị................................................................................................................ 15
2.4 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 15

2.4.1

Xác định hiệu lực kháng nấm theo nồng độ được sử dụng của chế phâm

Si/AgNPs/OCTS............................................................................................................ 15
2.4.2

Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên mầm đậu nành. 17

2.4.3

Khảo sát hoạt tính của enzyme chitinase in vitro trong q trình nãy mầm của hạt

đậu nành.........................................................................................................................18

2.4.3.1 Thu nhận enzyme chitinase từ rễ mầm đậu nành............................................. 18
2.4.3.2 Xác định hoạt tính enzyme chitinase...............................................................18
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 20
3.1 Hoạt tính kháng nấm của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS.......................................... 20

3.1.1 Khả năng ức chế Rhizoctonia solani của chế phẩm........................................... 20

iii


3.1.2 Hoạt tính kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của chế phâm
Si/AgNPs/OCTS

....................................................................................................... 22

3.1.3 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của che phâm Si/AgNPs/OCTS... 24
3.2 Khả sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phâm

Si/AgNPs/OCTS...........................................................................................................25

3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm theo

thời gian nảy mầm......................................................................................................... 25

3.2.2 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm dựa

trên khối lượng đậu nành.............................................................................................. 26
3.2.3 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành của chế phẩm dựa

trên hoạt độ của enzyme chitinase................................................................................ 25
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ......................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 30

PHỤ LỤC..................................................................................................................... 33

IV


TÓM TẮT
Chế phẩm Si/AgNPs/OCTS được chế tạo bằng phương pháp bức xạ dựa trên sự
tạo thành nano bạc được gắn trên vi hạt silica sừ dụng oligochitosan làm chất ổn định
với mục đích chế tạo phân bón lá để gia tăng hiệu quả kháng nấm bệnh dựa trên hiệu

ứng kích kháng bệnh trên cây trồng. Khóa luận “Khảo sát hiệu quả của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh

trưởng trên mầm đậu nành” được thực hiện từ tháng 03/2020 đến tháng 9/2020 tại

phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu và Nano, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp. Hồ
Chí Minh với mục tiêu xác định khả năng kháng nấm bệnh, kích thích tăng trưởng và

tăng hoạt tính của enzyme chitinase trên mầm đậu nành của chế phâm

Si/AgNPs/OCTS.
Đe tài bao gồm ba nội dung: Xác định hiệu quả kháng nấm Rhizoctonia solani,
Colletotrichum

gloeosporioides

và

Fusarium

oxysporum

của

chế

phâm

Si/AgNPs/OCTS; Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên hạt đậu

nành nảy mầm; Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase ìn vitro trong quá trình nảy

mầm của hạt đậu nành.
Sau 6 tháng ngiên cứu, kết quả đạt được như sau:
1. Hiệu lực kháng nấm của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trên mơi trường PGA có
độ pha lỗng 50 lần cho hiệu quả kháng nấm cao nhất là 83,56% đối với nấm

Rhizoctonia solani, 79,52% đổi với nấm Colletotrichum gloeosporioides và

70,04% đối với nấm Fusarium oxysporum.
2. Ớ nghiệm thức bổ sung chế phẩm có độ pha lỗng 454 lần cho kết quả tốt
nhất, cụ thể tăng hơn 1,5 - 1,7 lần ở tiêu chỉ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm, từ

3,5 đến gần 5 lần ở tiêu chí khối lượng thân và rề đậu tươi lần sau sấy khô và

giảm 5,3 lần ở thời gian nảy mầm trong ngày.

3. Hoạt tính enzyme chitinase của nghiệm thức có độ pha lỗng 454 lần có
hoạt độ là 18,06 u/ml cao nhất trong tất cả các mẫu, tăng 33,5 lần so với mẫu

đối chứng sừ dụng nước cất vô trùng.

V


DANH MỤC
• CÁC HÌNH ÃNH
Hình 1.1 Cấu trúc mạng của silica vơ định hình và tinh thể................................... 1

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan................................................................. 2
Hình 1.3 Cơ chế diệt vi khuẩn của AgNPs thông qua các tương tác với protein và

nucleic acid..............................................................................................................6
Hình 1.4 Các cơ chế tác động của AgNPs đến vi sinh vật..................................... 6

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo AgNPs gắn trên vi hạt SĨO2.................................... 7
Hình 1.6 Nam Rhizoctonia solani.......................................................................... 8
Hình 1.7 Nam Fusarium oxysporum...................................................................... 9
Hình 1.8 Nấm Colletotrichum gloeosporioides.................................................... 11
Hình 3.1 Đường kính tăng trưởng của nấm Rhizoctonia solani trên môi trường bô

sung chế phàm theo độ pha lỗng khác nhau........................................................ 20

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm
sau 52 giờ ni cấy trên mơi trường PGA............................................................ 21

Hình 3.3 Đường kính tăng trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides trên

mơi trường PGA có bổ sung chế phẩm theo độ pha loãng khác nhau.................. 22
Hình 3.4 Nấm c.gloeosporioides sau 168 giờ ni cấy trên mơi trường có bổ

sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS......................................................................... 23
Hình 3.5 Nam Fusarium oxysporum sau 144 giờ nuôi cấy trên môi trường PGA

có.......................................................................................................................... 24
Hình 3.6 Đường kính tăng trưởng của nấm Fusarium oxysporum trên mơi trường
PGA có bơ sung chế phâm theo độ pha lỗng khác nhau..................................... 24
Hình 3.7 Sinh trưởng và phát triển của hạt đậu nành trên giá thể có bổ sung chế

phẩm Si/AgNPs/OCTS ở các độ pha loãng khác nhau......................................... 25
Hình 3.8 Đậu nành sau 144 giờ phát triển trên giá thể bơng gịn có bổ sung chế

phẩm ở các độ pha loãng khác nhau..................................................................... 26
vii


DANH MỤC BẢNG BIẺU
Bảng 2.1 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm... 15
Bảng 2.2 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm
Colletotrichum gloeosporioides........................................................................... 16

Bảng 2.3 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm

Fusarium oxysporum............................................................................................ 16
Bảng 2.4 Khảo sát sự kích thích nảy mầm của chế phẩm....................................17
Bảng 2.5 So đồ phản ứng cho thử nghiệm enzyme............................................. 19
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của che phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm
Rhizoctonia solani................................................................................................. 21

Bảng

3.2

Anh

hưởng

của

chế

phẩm

đến

hiệu

lực

kháng

nấm

Colletotrichum gloeosporioides........................................................................... 23

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chế phâm đến hiệu lực kháng nấm Fusarium
oxysporum............................................................................................................ 25

Bảng 3.4 Chỉ số tăng trưởng của hạt đậu nành đã bổ sung chế phẩm.................. 27
Bảng 3.5 Hoạt lực của enzyme chitinase được đo trên máy ELISA........................
............................................................................................................................... 28

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AgNPs

Nano bạc

Ag’

lon bạc

CTS

Chitosan

OCTS

Oligochitosan

Mw

Khối lượng phân tử

Si/AgNPs/CTS

Che phẩm nano silica gắn nano bạc sử dụng
oligochitosan làm chất ồn định

PGA

Môi trường potato glucose agar

R. Solani

Nam Rhizoctonia solani

Fusarium sp

Nam Fusarium oxysporum

c. Gloeosporìoides

Nam Colletotrichum gloeosporioides

TL

Tỉ lệ

KL

Khối lượng

TLNM

Tỉ lệ nảy mầm

TGNM

Thời gian nảy mầm

TĐNM

Toe độ nảy mầm

Cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

IX


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước có nền nơng nghiệp phát triển mạnh nhờ điều kiện và khí hậu

tương đối thuận lợi. số liệu thống kê từ Tồng cục Hải quan năm 2018, xuất khẩu mặt

hàng rau củ quả Việt Nam đạt 3,52 tỷ USD; tăng 10,8% so với năm 2017. Đậu nành
có nguồn gốc ở Đông Nam Á, tuy nhiên Mỹ là nước có diện tích trồng là 45% và đạt

55% sản lượng của thế giới, một số nước có lượng sản xuất đậu nành lớn khác
như Brasil, Argentina, Trung Quốc và Án Độ. Ờ Việt Nam, cây đậu nành là cây thực
phâm có truyền thống lâu đời, cung cap protein chủ yếu cho con người, là thành phần

không thể thiếu trong mồi bừa ăn. Diện tích trồng đậu nành ở Việt Nam vần còn thấp,

chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8 - 10% nhu cầu thị trường và dự kiến tới năm 2015 -

2020, Việt Nam thiếu hụt tới 3,5 - 4,0 triệu tấn/năm nên nhu cầu sản xuất đậu nành
trong nước là rất cần thiết. Tuy vậy, hiện nay các dịch bệnh như lở cổ rễ do nấm

Rhizoctonia solani, bệnh héo rũ, chết vàng xanh do nấm Fusarium sp và một số loại
cơn trùng chích hút gây thiệt hại lớn đến năng xuất và khơng có một biện pháp sinh
học nào tỏ ra có hiệu quả trong việc phịng trừ bệnh.

Những năm gần đây vật liệu sinh học và công nghệ nano đang được xem là một
vật liệu quan trọng của khoa học tương lai, đã và đang phát triển rất nhanh. Vật liệu

nano được đánh giá vượt trội với khả năng ứng dụng cao và đa dạng trong nhiều lĩnh
vực như thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, ... Đây là loại vật liệu thu hút được sự quan

tâm của nhiều nhà khoa học do các tính chất nổi trội mà nó mang lại như có khả năng

kháng khuẩn, kháng nấm cao. Trong đó có thể kể đến như silica được chế tạo từ vỏ

trấu đang được quan tâm rộng rãi như là một nguồn phụ phâm rẻ tiền từ nông nghiệp,
nano silica tăng cường khả năng chống xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh vào tế bào
thực vật thông qua cơ chế tăng cường hoạt động của các enzyme chitinase, peroxidase,

polyphenoloxydase, hạn che q trình chích hút của cơn trùng bằng cách tăng cường
độ cứng của vách tể bào... Nano bạc được biết đến là một tác nhân có khả năng kháng

khuân, kháng nấm và kháng virus cao. Chitosan có khả năng kháng khuẩn, ức chế nấm,
cịn oligochitosan là sản phẩm từ chitosan được cắt mạch và có khối lượng phân tử

thấp với khả năng tăng cường sinh trưởng, nâng cao sức chống chịu trên thực vật.
X


Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả kháng nấm bệnh gây hại đặc trưng trên cây
đậu nành và khảo sát khả năng tăng cường sinh trưởng trên hạt đậu nành nảy mầm của

phân bón lá Si/AgNPs/OCTS. Từ đây đề tài “Khảo sát hiệu quả của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh

trưởng trên mầm đậu nành” được thực hiện.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum
gloeosporioides và Fusarium oxỵsporum theo nồng độ sử dụng chế phẩm

Si/AgNPs/OCTS;

- Đánh giá được khả năng tăng cường nảy mầm đậu nành của chế phâm theo
nồng độ sử dụng;

- Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy mầm của
hạt đậu nành.

xi


Chương 1. Tông quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về silica

1.1.1 Silica
Silica hay silicon dioxide (SÌO2) là một oxit kim loại nhóm IV, xuất hiện tự nhiên

ở cả dạng tinh thể và vơ định hình . Silica là thành phần chính trong vỏ trái đất, kết
hợp các oxit khác như magie, nhôm, canxi, sắt tạo thành khoáng silicat trộn lần trong

đất đá.
Cách đây hàng triệu năm, silica ở dạng thạch anh đã được tách ra từ đá silicat

bằng phương pháp rửa với nước. Một số nơi trên trái đất silica tồn tại ở dạng vơ định

hình như khống opan.
Các phân tử khơng tồn tại ở dạng đơn lẻ mà liên kết lại với nhau thành phân tử
rất lớn. Silica có hai dạng cẩu trúc là dạng tinh thể và vơ định hình. Trong tự nhiên
silica tồn tại chủ yếu ở dạng tinh thế hoặc vi tinh thể (thạch anh, triđimit, cristobalit,
cancedoan, đá mã não), đa so silica tổng hợp nhân tạo đều được tạo ra ở dạng bột hoặc

dạng keo và có cấu trúc vơ định hình (silica colloidal).
1.1.2 Cấu trúc của silica

a) Dạng vơ đinh hình
Hình 1.1 Cấu trúc mạng của silica vơ định hình và tinh thề

Silica cấu trúc vơ định hình có hình thức trái với silica tinh thể được xác định
thông qua sự sắp xếp ngầu nhiên các đơn vị phân tử. Silica vơ định hình có kích thước
nhỏ, hoạt tính cao, diện tích bề mặt lớn. Vì vậy, silica vơ định hình có nhiều ứng dụng.

Các dạng khác nhau của silica tinh thể là : thạch anh, tridymite, cristobalite,
1


Chương 1. Tông quan tài liệu

keatite, coesite, stishovite và moganite. Dạng silica phong phú nhất là thạch anh a và
thuật ngừ thạch anh thường được sử dụng thay cho thuật ngừ silica tinh thể chung1.

1.1.3 Úng dụng của silica
Silica có khả năng hạn chế sự xâm nhiễm của vi sinh vật bao gồm: nấm, vi khuần,

virus và tuyến trùng với 3 cơ chế chính:
- Silica là thành phần tham gia trong cấu trúc vách tể bào, biểu bì. Sự có mặt
của silica làm tăng cường độ cứng cáp, đàn hồi của tế bào từ đó kháng lại sự

xâm nhiễm của vi sinh học gây hại2.
- Silica còn thúc đây quá trình hình thành các hợp chết thứ cấp có tác dụng tiệu
diệt và ức chế quá trình xâm nhiễm của vi sinh vật gây hại như salicylic acid

(SA), jasmonic acid (JA), and ethylene (ET)3.

- Silica tham gia vào quá trình tương tác giữa vật chù và mầm bệnh, kích thích
sự hoạt động của các gen liên quan đến sự hình thành cơ che phịng chống vi

sinh vật xâm nhiễm thơng qua một loại các phản ứng sinh lý, sinh hóa và

truyền tín hiệu thực vật3.
1.2 Giới thiệu về chitosan và oligochitosan

1.2.1 Chitosan

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan là một polymer tự nhiên được hình thành từ N-deacetyl hóa chitin,

mang điện tích dương, khơng có độc tính, có khả năng phân hủy sinh học, và tương
hợp sinh học. Thuật ngừ chitosan được dùng khi hàm lượng nitơ cao hơn 7% khối
lượng phân tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và

chitosan là khá năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid lỗng, chitosan hịa tan

2


Chương 1. Tông quan tài liệu

nhiều trong các dung dịch pH thấp cịn chitin hầu như khơng tan. Chitosan được điều
chế bằng cách deacetyl hóa chitin thu dược từ vỏ tôm và cua.

Thuật ngừ chitosan được dùng khi hàm lượng nitơ cao hơn 7% khối lượng phân

tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và chitosan là khả

năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid lỗng, chitosan hịa tan nhiều trong các

dung dịch pH thấp cịn chitin hầu như khơng tan. Chitosan được điều chế bằng cách
deacetyl hóa chitin thu được từ vở tơm và cua. Việc tạo ra nhóm amin từ
acetamindideoxy carbohydrate có thể thực hiện được trong các điều kiện acid và kiềm
nhưng một số trở ngại về mặt lập thể có thể gây cản trở phàn ứng. Nhiều nồ lực đã
được đưa ra nhưng nhóm N-acetyl khơng thể loại bỏ bang acid nếu không kèm theo sự
thủy phân mạch polysaccharide 4.

1.2.2 Oligochitosan

Oligochitosan là sản phâm từ chitosan được cắt mạch và có khối lượng phân tử
thấp. Cho đến nay, nhiều phương pháp che tạo oligochitosan đã được sử dụng sử dụng
bao gồm:

- Phương pháp siêu âm 5.
- Phương pháp sử dụng tác nhân hóa học 4.
- Phương pháp dùng tác nhân sinh học sừ dụng các enzyme 6.
- Phương pháp vi sóng 7.
- Phương pháp chiểu xạ (tia y-Co-60, electron beam)8.
Cắt mạch chitosan bằng phương pháp hóa học được cho là phương pháp đơn giản

nhất. Tuy nhiên, phương pháp này thường gặp bất lợi do quá trình cắt mạch thường

kèm theo sự thay đổi cấu trúc của chitosan và các chất thải tồn dư sau quá trình cắt
mạch gây hại tới mơi trường và khó kiểm sốt được Mw chitosan như mong muốn. Do
vậy phương pháp được sử dụng pho biến hiện nay là phương pháp sinh học sử dụng

enzyme đê cắt mạch. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng enzyme đê thủy phân chitosan chế
tạo oligochitosan ứng dụng cho cây trồng. Phương pháp này cũng cho thấy một số

nhược điểm như phải sử dụng enzyme đặc hiệu nên chi phí cao, q trình này được
thích hợp bởi nhiệt độ tối ưu cũng như thời gian phản ứng.

3


Chương 1. Tông quan tài liệu

Gần đây, khi công nghệ bức xạ được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi hơn.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy phương pháp bức xạ có nhiều ưu diêm như chế tạo sản

phẩm có độ tinh sạch cao, dề dàng điều chỉnh khối lượng phân tử oligochitosan, không
làm ảnh hưởng tới cấu trúc của sản phàm, chi phí thấp, an tồn mơi trường và dễ sản

xuất ở quy mơ cơng nghiệp.
1.2.3 Vai trị của oligochitosan

Oligochitosan là một chất điều hòa miễn dịch thực vật mạnh, kích hoạt miền dịch
bẩm sinh thực vật, bao gồm: nhận thức tín hiệu, truyền tín hiệu gen và protein phản
ứng, gây ra sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến phòng thủ. Tác dụng

của oligochitosan trên thực vật tương tự như vắc-xin nói chung tác động lên người và
động vật9.
1.3 Tổng quan về chitinase

Chitinase xúc tác quá trình thủy phân chitin, một homopolymer mạch thẳng của

P-1,4 liên kết N-acetylglucosamine (GlcNAC), và là chất tạo màng sinh học phong
phú thứ hai trong tự nhiên sau cellulose. Không có cơ chất nào cho nhóm enzym này

được xác định trong thực vật, trong khi chitin thường là một thành phần của thành tế
bào nấm và bộ xương ngoài của động vật chân đốt bao gồm nhiều mầm bệnh và sâu

bệnh quan trọng. Do đó, chitinase trong thực vật sẽ phát triển như một cơ chế bảo vệ
chống lại những kẻ thù này. Hầu hết các chitinase thực vật thuộc nhóm endochtinase
thủy phân ngẫu nhiên các polyme chitin 10.

Nhiều loại chitinase khác nhau được tinh chế từ các nguồn thực vật khác nhau
với sự cải tiến về đặc tính của chúng đã được khám phá chi tiết. Cùng với đó, các

chitinase tinh khiết cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm mạnh mè chống lại nấm gây

bệnh và nấm không gây bệnh ở cây. Ngồi ra, chúng cịn tham gia vào các quá trình
tăng trưởng và phát triên như trong quá trình chín của trái cây, tham gia vào q

trình chết tế bào, hoạt động như các protein lưu trừ canxi liên kết các ion canxi với
dung lượng cao 11 .

4


Chương 1. Tơng quan tài liệu

1.4 Giói thiệu về nano bạc

1.4.1 Tổng quan về nano bạc

Nano bạc (AgNPs) là những hạt bạc có kích thước từ 0,1 đến 100 nm. AgNPs

thường ở dưới dạng dung dịch keo với các chất ôn định là polymer giúp cho các hạt
bạc không bị kết tụ. Bạc có kích thước nano thể hiện một số đặc tính ưu việt so với bạc
bình thường, đó là một kháng sinh tự nhiên có khả năng phịng ngừa sự truyền nhiễm

và vơ hiệu hố các enzyme trọng yếu tham gia trao đổi oxy của vi khuân, virus và vi

nấm, từ đó phá hủy màng tế bào của vi sinh vật. Vi khn khơng thê có bất kỳ khả

năng miền dịch nào đối với bạc. Trong tự nhiên bạc khơng độc, khơng dị ứng, khơng
tích tụ và vơ hại với cả động vật hoang dã và môi trường.

AgNPs là một ứng dụng hoàn thiện của khoa học và cơng nghệ nano đối với bạc

đe tăng tính năng diệt khuân, sát trùng và khử mùi, được ứng dụng trong sản xuất rau

sạch. Các hạt nano có kích thước siêu nhỏ làm cho các hạt có diện tích bề mặt lớn cân
đối với khối lượng của chúng. Kích thước nano cho phép bạc tương tác dễ dàng với
các hạt khác và tăng hiệu quả kháng khuẩn. Hiệu quả này lớn tới mức 1 gam AgNPs

có the tạo tính chất kháng khn tới hàng trăm mét vng chất nền '2.

1.4.2 Tính chất của AgNPs
Công nghệ nano đã tạo ra được những hạt bạc có kích thước nano có đặc tính
sinh học cao, độc tính thấp. Ngồi ra, AgNPs cịn có thể làm tăng hoạt động chuyển
hoá của tế bào dẫn đến sự tăng tốc độ tăng trưởng của thực vật.

Một số giả thuyết cho rằng, AgNPs có khả năng kháng khuẩn là do tính chất hóa
học của các ion Ag+. lon này gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế

bào làm tê liệt vi khuân nhờ vào sự liên kết mạnh với peptidoglycan, thành phần cấu

tạo nên thành tế bào của vi khuân. Neu các ion bạc được loại ra khỏi tế bào ngay sau
đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Mặt khác, do động vật

khơng có thành tế bào, vì vậy chúng ta khơng bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion
này 13’14.
Ngồi ra cũng có nghiên cứu cho rằng AgNPs có thể điều chỉnh việc truyền tín

hiệu trong vi sinh vật. Sự phosphoryl hóa protein trong cytosol của vi khuẩn làm ảnh
hưởng đến sự truyền tải tín hiệu của vi khuẩn và sự phosphoryl hóa này thường xảy ra
5


Chương 1. Tơng quan tài liệu

ở vị trí của gốc tyrosine của peptide dẫn đến ức chế truyền dẫn tín hiệu và do đó ngăn
chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn I3.

Hình 1.3 Cơ chế diệt vi khuân của AgNPs thơng qua các tương tác với protein và

nucleic acid

Hình 1.4 Các cơ chế tác động của AgNPs đến vi sinh vật

1.5 Cơ chế gắn AgNPs lên vi hạt silica sử dụng chitosan làm chất ổn định

Ag+ được khử thành Ag° chủ yếu bang electron solvát (e-aq) và gốc tự do

hydrogen (Hw) được hình thành từ phản ứng xạ ly các phân tử nước có mặt trong dung
dịch. Ngồi ra, gốc tự do hydroxyl (WOH) hình thành trong phản ứng xạ ly nước có thể

phản ứng với các alcohol như etanol, metanol, isopropanol, v.v. tạo thành các gốc tự

6


Chương 1. Tơng quan tài liệu

do hydroxyalkyl cũng góp phần vào phản ứng khử Ag+ ở dạng cụm (Ag+ ion clusters)
thàng cụm Ag° (Ag° clusters) 15.

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo AgNPs gắn trên vi hạt SĨO2

Trong khi đó, khi có mặt của hệ keo SÌO2 (được tạo thành do các hạt mang diện
tích âm) các hạt Ag+ đề dàng được hấp thu lên trên bề mặt của hạt S1O2, và khi chiếu

xạ Ag+ trên bề mặt hạt SÌO2 sẽ bị khử như phản ứng ở trên tạo thành các clusters kim

loại bao quanh các hạt SÌO2.
Hơn nữa, do có mặt của chitosan trong dung dịch khi đi chiếu xạ, vi hạt SÌO2 đã

được gắn bạc sẽ được gắn trên mạch của chitosan đồng thời chitosan sẽ bị cắt mạch

tạo thành oligochitosan và cuối cùng tạo thành hệ ổn định đồng nhất Si/AgNPs/CTS.
1.6 Độc tính của silica, nano bạc và oligochitosan

Hầu hết lượng nano silica được hấp thụ qua đường uống đều được đào thải qua

đường nước tiểu (70 - 80%) và 7- 8% qua đường phân. Một hàm hàm lượng nhở của
silica được tích lũy trong gan, thận, lá lách sau 6 giờ cho uống. Các thí nghiệm trên
người cũng cho thấy khơng có tác dụng phụ quan sát thấy trên các tình nguyện viên

khi uống oligochitosan với nồng độ 4,5 g/ngày (đối với nam) và 2,5 g/ngày đối với nữ
sau 12 ngày sử dụng liên tục 16. Khơng quan sát thấy độc tính cấp khi sử dụng 6,75

g/ngày đối với cả nam và nữ trong vòng 12 tuần sử dụng oligochitosan 17J1.

Có nhiều ý kiến trái chiều ve độc tính của AgNPs nói riêng và nano kim loại

nặng nói chung. Hầu hết các thí nghiệm trên in vitro chỉ ra rằng AgNPs có độc tính rất
cao đối với tế bào thử nghiệm. Tuy vậy các kết quả nghiên cứu trên in vivo lại cho kết

7

Chương 1. Tông quan tài liệu

quả ngược lại. Các kết quả nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng AgNPs được bài tiết hầu

hết ra khỏi cơ thể bằng đường phân (90 - 99,6% tùy loại động vật). Cụ thể, trên chuột

nhắt là 99,6 và 98% đối với chuột lớn; 90% đổi với chó và 94% đối với khỉ18. AgNPs
(kích thước hạt bạc khoảng 60 nm) hồn tồn khơng gây đột biến gen chuột sau 28

ngày quan sát19.

1.7 Tổng quan về nấm
1.7.1 Nam Rhizoctonia soỉani

Rhizoctonia solani là một loại nấm gây bệnh phổ biến trên thực vật và phân bố

trên tồn thế giới, được mơ tả lần đầu tiên vào năm 1858 do Julius Kuhn thực hiện khi
quan sát một loại nấm trên khoai tây. R. solani thường tồn tại trong đất và gây bệnh

trên nhiều loại cây trồng khác nhau, nhưng đặc biệt là các cây thân thảo. Các loại bệnh
chủ yếu là thối cô rễ, thối rề, v.v. Thường tấn công vào giai đoạn phát triển ban đầu

của cây.

Nấm R. solani khơng tạo ra bào tử vơ tính mà chỉ thỉnh thoảng tạo ra hệ thống vơ
tính (bào tử đảm). Tự nhiên, R. solani sinh sản bằng hình thức vơ tính, tồn tại chủ yếu

dưới dạng sợi nấm sinh dường hay hạch nấm.
Phân loại:

Giới Nấm

Nghành Basidìomycota
Lớp Agaricomycetes

Bộ Cantharellales
Họ Ceratobasidiaceae
Chi Rhizoctonia
Lồi R. solcini
Hình 1.6 Nấm Rhizoctonia solani

Ở giai đoạn vơ tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khu cịn non thì

khơng màu, khi đã già thì chun sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa

8


Chương 1. Tơng quan tài liệu

bào, có đường kính từ 8 - 13 pm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chồ phân nhánh hơi
thắt lại và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh. Nấm sinh trưởng thích họp ở

nhiệt độ 25 - 30°C, dưới 10°C và trên 38°c làm nấm ngừng sinh trưởng. Hạch nấm
thành nhiều ở nhiệt độ 30 - 32°c. Nấm có thể phát triển trong phạm vi pH rộng từ 3,4
đến 9,2 hợp nhất là ở độ pH 6 - 7. R. solani có thể được lưu trừ trong ống nghiệm chứa

môi trường PGA ở nhiệt độ phòng (25 - 30°C) từ 6 - 12 tháng20.

R. solani có 3 loại sợi: sợi nấm bị (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate

hyphae) và tế bào dạng chuồi (moniloid cells). Lúc già, các tế bào tách ra và biển

thành thạch. Hạch nấm khi cịn non có màu trăng ngà nhưng khi già hạch có màu thay
đổi từ nâu đến xám, trên vỏ hạch có lơng. Đường kính hạch nấm từ 1 - 6 mm. Hạch

nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi đã già thì có thê nơi lên trên tế bào
ngồi hạch trở nên rồng .R. solani phô biến ở nhiều nơi và có thể gây bệnh cho 180

loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau. Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi
nhiệt độ 23-31 °C, nhiệt độ thích họp 27°c, ẩm độ tương ứng từ 70 - 100%21.

1.7.2 Nấm Fusarium oxysporum

Hình 1.7 Nấm Fusarium oxysporum

Nấm Fusarium oxysporum là nấm gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ

phận, đặc biệt là bộ phận gốc và rễ cây. Nam Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ đầu
thế kỷ XIX. Bệnh héo vàng cà chua được mô tả đầu tiên do Massee. G. E ở Anh năm

1895. Đây là căn bệnh nghiêm trọng trên cây cà chua đối với các nước trên the giới.
Bệnh héo do Fusarium sp. thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng, nấm xâm nhiễm

vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra. Theo Binder và Hutchinson (1959), cà

9


Chương 1. Tông quan tài liệu

chua bị bệnh héo vàng do Fusarium sp. sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị
tuyến trùng (Meloidogine incognita} xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống

bệnh cà chua đối với nấm Fusarium oxysporum.
Nấm phát triển mạnh, màu sắc thay đôi từ màu trắng đến tím violet, tản nấm

thường sinh sắc tố màu hồng đến màu tím đậm. Bào tử lớn, trong suốt, có nhiều ngăn,
bào tử hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, hình thành

trên cành bào phân sinh đơn nhánh ngắn thường không có ngăn ngang, đơi khi có một
ngăn. Một số lồi Fusarium sp. có bào tử nhỏ, bào tử hậu và quả thể hoặc khơng có

bào tử hậu. Hậu bào tử thường thành trên mẫu phân lập sau 3-6 tuần nuôi cấy trên bề
mặt thạc của môi trường PGA.

Sợi nấm và hậu bào chỉ xuất hiện trong mạch xylem mà không hình thành bên
ngồi mạch. Sau khi xâm nhiễm, nấm làm cho bó mạch chuyển sang màu xám hoặc
nâu đen, lá cây bị độc tố nấm tiết ra làm tắc bó mạch. Điều này làm cho cây bị mất

chức năng quang hợp và dẫn đến cây chết.
Fusarium sp. có 2 giai đoạn trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và giai đoạn
tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Với điều kiện thích hợp, mơi trường có đầy đủ chất

dinh dưỡng, nấm sè sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi, lượng
dinh dưỡng đất cịn ít, thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này các lồi
Fusarium sè hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào từ hậu. Do đó, nhằm đảm bảo sự tồn

tại của chúng trong thời gian dài, chúng sẽ sử dụng cường độ hơ hấp và nguồn dinh
dưỡng dự trừ được tích lũy trong hệ sợi nấm ở mức thấp nhất. Một số lồi khơng sinh
bào tử hậu thì chúng sẽ tiếp tục tồn tại băng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh

hay ký sinh trong cơ thể vật chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch mùa với cây bị bệnh do
Fusarium thì khả năng trong đất cịn sót lại Fusarium là rất cao.

1.7.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides
Nấm Colletotrichum gloeosporioides thuộc giới nấm, lớp Sodariomycetes, bộ

phyỉlachorales trong họ phyllachoraceae và thuộc chi Colletotrichum. Cành bào tử

thành hình trên vết bệnh các long gai trịn và dài, khơng đều, màu nâu thường nhẹ ở
góc và thon nhọn nhẹ ở đỉnh. Tản nấm trong mơi trường PGA có màu trắng sáng xám

đến xám đậm, quả thể mở hình thành lẻ hoặc tập trung thành đám, hình cầu hoặc hình
10


Chương 1. Tơng quan tài liệu

quả lê với kích thước khoảng 85-350 micromet. Chủng nấm c. Gloeosporioides phát

triển tốt nhất vào mùa mưa có độ ẩm khơng khí và nhiệt độ cao.

Hình 1.8 Nấm Coỉletotrichum gloeosporioides

Bệnh thán thư, do nấm c. gloeosporioides gây ra, là bệnh sau thu hoạch phồ biến
và nghiệm trọng nhất của nhiều loại trái cây nhiệt đới bao gồm xoài, đu đủ, thanh long
và bơ. c. gloeosporioides gây bệnh trên cây xồi từ khi cịn non đến ngày thu hoạch,

vết bệnh lúc đầu là những đốm nhỏ hình trịn có màu nâu hoặc nâu đen sau đó lan dần

ra, nhiều đốm kết hợp với nhau thành những đốm lớn lõm vào phần thịt quả làm cho

thịt quả bị thối. Đối với xoài và đu đủ, bệnh được kiểm soát theo lối truyền thống bằng

thuốc diệt nấm hóa học tơng hợp và xử lý nước nóng. Tuy nhiên, khi trái cây thu
hoạch được xử lý bằng thuốc diệt nấm, khả năng tiếp xúc trực tiếp của y cịn với

chúng ta và thuốc có khả năng kháng trong mam bệnh sẽ cao hơn8.
1.8 Đậu tương DT84

Giống đậu tương DT84 được công nhận là giống Quốc gia năm 1995. Giống DT

84 là giống cao sản có tính thích ứng rộng, dề trồng. Giống có hạt trịn hơi dài, màu vỏ

vàng sáng, rốn hạt màu nâu nhạt. Giống có năng suất cao : 1,9-2 tấn hạt/ha, phâm
chất hạt đậu ăn ngon. Thời gian sinh trưởng từ trồng đến thu hoạch là 85 - 95 ngày,

cây cao TB 50-60cm. DT 84 là giống chịu nhiệt trung bình, thích hợp cho cả 3 vụ : vụ

xuân: từ 5/2-10/3, vụ hè: từ 25/5 - 30/6 và vụ đơng: Từ 15/8 - 5/10. Có thể trồng trên

nhiều loại đất khác nhau như đất bãi cao, đất chuyên màu, đất ven đồi, thích hợp nhất

11


Chương 1. Tông quan tài liệu

ở chân đất cát pha, thịt nhẹ, thoát nước tốt. Tránh đất quá trũng dễ ngập nước khi mưa

to.
1.9 Tình hình nghiên cứu trong và người nước

1.9.1 Các nghiên cứu trong nước

ơ Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về các chế phẩm nano silica, nano bạc và
oligochitosan được công bố. Các chế phẩm này đang được chú trọng trong nông

nghiệp xanh và cho thấy hiệu quả cao trong việc tăng cường sinh trưởng, phát triển
cây trồng cũng như khả năng kích kháng.

PGS.TS. Lê Quang Luân và cộng sự đã hoàn thành nghiên cứu chứng minh
chitosan có khả năng thúc đẩy hoạt động của các enzyme phytoalexin khác như

phenylalanine ammonia lyase, peroxidases và chitinase trong quá trình nảy mầm của
hạt đậu nành và đại mạch2. Ngoài ra, thầy cùng cộng sự đã chứng minh chitosan được
cắt mạch bang phương pháp chiếu xạ có khả năng tăng cường khả năng sống sót ngồi
vườn ươm, đề kháng lại các vi sinh vật gây hại trên đối tượng: cây cúc, cây Salem, cây

hoa cát tường và dâu tây in vitro bằng cơ chế kích kháng (thúc đẩy hoạt động của

enzyme chitosanase)8.
Trên lúa thì chế phâm nanosilica/chitosan với kích thước hạt nano silica khoảng

32,5 nm và nồng độ sử dụng là 100 ppm cho thấy chế phâm hoàn tồn có khả năng
hạn chế bệnh đạo ơn và bệnh bạc lá với tỉ lệ bệnh giảm từ 6 - 7 lần so với đối chứng

sau 15 ngày sử dụng 22.

Nano bạc cũng có rất nhiều ứng dụng mà chưa được khai phá hết. Có thể kể đen
như là nghiên cứu tông hợp chế phâm phối hợp nano bạc-chitosan ứng dụng bảo quản

thanh long sau thu hoạch 23. Ngoài ra, nano bạc cịn tham gia vào một số chu trình

chuyển hóa của cây trồng, hấp phụ ethylen, hợp chat phenolic và tăng cường sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng 23.

1.9.2 Các nghiên cứu ờ nước ngồi
Theo cơng bố, hạt nano silica được chứng minh là có khả năng rút ngắn thời gian

nảy mầm cũng như làm tăng chiều dài, số lượng rề ở bắp và tăng cường hoạt động của
các emzyme như phenylalanine ammonia lyase, peroxidase và polyphenol oxidase
12


Chương 1. Tông quan tài liệu

giúp kháng lại các tác nhân gây bệnh như Fusarium oxysporum và Aspergillus niger

trên cùng đối tượng là cây bap 24. Nano silica còn được chứng minh là có khả năng
kích thích tăng trưởng và nảy mầm ở dưa leo thông qua kênh K7Na+ 25. Mặt khác,
nano silica cũng đã được chứng minh là có khả năng hạn chế những tác động từ sâu

bệnh ở cây cà chua, đặc biệt là bướm đêm (Spodoptera littoralis)26.
Năm 2014 , Anusuya và Sathiyabama đã thực hiện nghiên cứu đánh giá về khả

năng tạo ra các chất thủy phân chống nấm trong cây nghệ dễ bị nhiễm bệnh (Curcuma
longa L.) . ơ điều kiện đồng ruộng , việc phun chitosan qua lá cho cây củ nghệ tạo ra
các enzyme bảo vệ như chitinase và chitosanase làm sức đề kháng tăng đối với bệnh
thối thân rề do Pythium aphanidermatum gây ra , trong khi cây đổi chứng biểu hiện

bệnh thối thân rễ nghiêm trọng . Việc tăng hoạt động của các enzyme bảo vệ trong lá

của chitosan đóng một vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự phát triển của các triệu
chứng bệnh . Cho thấy rang chitosan là một chất chống nấm tiềm năng để kiểm soát

bệnh thối thân rễ ở củ nghệ 27.
Tại Hàn Quốc, AgNPs có kích thước là 7 nm gắn kết trên vi hạt S1O2 có kích

thước 350 nm. Với nồng độ 100 ppm AgNPs-SiO? thì vi khuẩn s. enterica bị ức chế

hồn tồn sau 58 giờ28.

Năm 2007, Prapagdee và cộng sự đã tiến hành nghiên cửu về vai trò của chitosan
trong việc bảo vệ đậu tương chống lại bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra , từ
đó đã cho thấy chitosan ức chế sự phát triển của nấm F solani. Tại nồng độ 1 mg/ml

cho thấy đặc tính kháng nấm và ở mức 3 mg/ml có thể làm chậm biểu hiện triệu chứng

SDS trên lá đậu nành trong hơn ba ngày sau khi gây nhiễm nấm. Chitosan kích thích

hoạt động của chitinase trong đậu tương dần đến sự chậm phát triển SDS ở lá đậu

nành.29

13


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noi thực hiện

Đề tài dược thực hiện từ 03/2020 đến 9/2020 tại phòng Công nghệ Sinh học Vật

liệu và Nano, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.Hồ Chí Minh (2374 Quốc Lộ 1A,

phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp.Hồ Chí Minh).
2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hiệu quả kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum
gỉoeosporioides và Fusarium oxysporum của chế phẩm Si/AgNPs/OCTS;

- Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của chế phẩm trên hạt đậu nành nảy
mầm;

- Khảo sát hoạt động của enzyme chitinase in vitro trong quá trình nảy mầm của
hạt đậu nành.
2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Vật liệu

- Giống đậu nành DT84 (cơng ty Hồng Nơng, Tp.Hcm);
- Các chủng nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Colletotrichum
gỉoeosporioides do phòng CNSH Vật liệu và Nano cung cấp;

- Chế phẩm Si/AgNPs/OCTS được chế tạo từ phương pháp bức xạ dựa trên sự
tạo thành nano bạc được gắn trên vi hạt silica sử dụng oligochitosan làm chất

ổn định, do phòng CNSH Vật liệu và Nano cung cấp.

2.3.1 Hóa chất

-

Chitinase Assay Kit (Sigma-Aldrich, Israel);

-

Acid acetic (Merck, Đức);

-

Anomi sunfat (Merck, Đức);

-

Sodium hydroxide (Merck, Đức);

-

Natri axetat (Scharlau, Tây Ban Nha);

-

Glucose, agar.

14


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.2 Thiết bị

-

Nguồn xạ Granma Co-60 GC 5000 (Brit, Ấn Độ);

-

Máy khuấy đũa IKA Eurostar (Đức);

-

Nối hấp (Hirayama, Nhật Bản);

-

Tủ an toàn sinh học (Esco, Singapore);

-

Hệ thống lọc nước siêu tinh sạch Milli-Ọ IỌ 7000 (Merck, Đức);

-

Máy đồng hóa mẫu bang bi (QIAGEN, Đức);

-

Máy đọc vi đìa Versamax (Molecular Devices, Mỹ);

-

Một số máy móc, thiết bị khác,...

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Xác định hiệu lực kháng nấm theo nồng độ được sử dụng của chế phẩm
Si/AgNPs/OCTS
Nội dung thí nghiệm: Thử nghiệm khả năng ức chế nấm của chế phâm bằng

phương pháp gây độc môi trường với các nồng độ khác nhau.
Bảng 2.1 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS trong khảo sát kháng nấm

Rhizoctonia solanỉ

Nghiệm thức

Độ pha lỗng của Si/AgNPs/OCTS (lần)

ĐC

0

1

50

2

60

3

70

4

80

5

90

6

100

Tiên hành thí nghiệm: Nấm Rhizoctonia solani được ni cấy trên mơi trường
trong vịng 3 ngày, nấm Fusarium oxysporum và nấm Colletotrichum gloeosporioides

được nuôi cấy trong vịng 7 ngày. Sau đó, lấy các khoanh nấm ( đường kính 6 mm ở

rìa mép hệ sợi) chun lên mơi trường PGA có bổ sung chế phâm đê kiểm tra hiệu quả
của chế phâm. Cách chuân bị mơi trường PGA có che phâm: mơi trường PGA sau khi

15