Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Cattleya mini

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC
VẬT VÀ CHITOSAN ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY LAN CATTLEYA MINI
Nguyễn Trọng Nguyễn và Nguyễn Thị Xuân Đào*
*Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
GVHD:: TS. Trịnh Thị Lan Anh

TĨM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(auxin, cytokinin) và chitosan lên sự tăng trưởng và nhân nhanh chồi của lan Cattleya mini. Kết quả cho
thấy việc bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 1,5 mg/l NAA mẫu cấy tăng trưởng và tạo chồi tối ưu sau 12 tuần
nuôi cấy. Khi bổ sung chitosan với nồng độ (0; 5; 10;15; 20; 25) vào môi trường nuôi cấy tối ưu thu được
kết quả cho thấy việc bổ sung chitosan ở nồng độ 0 mg/l thì mẫu cấy tăng trưởng và phát triển tối ưu về
trọng lượng tươi, số chồi, số lá, hình thái của mẫu cấy, chất lượng chồi, thí nghiệm này cho thấy việc bổ
sung chitosan ở các nồng độ (5; 10;15; 20; 25) không phù hợp cho q trình tạo chồi lan Cattlaya mini.
Từ khóa: chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nhân giống, Cattlaya mini, chitosan, tạo cây hoàn chỉnh.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cattleya là một giống lan đẹp nhất trong họ Orchidaceae, gồm nhiều loài xuất phát từ châu Mỹ, mặc dù
Ben tham và Hooker chỉ chấp nhận có khoảng 20 lồi, nhưng con số này hiện nay tăng lên rất nhiều khoảng
65 loài, chưa kể vô số cây lai. Được biết, Cattleya là một giống lan có nhiều cây lai nhất trong họ lan. Kích
thước hoa rất lớn với bề rộng 15 – 20 cm và hoa có màu sắc cực kỳ phong phú. Cattleya được gọi là Nữ
hồng của lồi hoa bởi vì hoa đã to mà hương sắc lại vẹn toàn, Queen of the flowers: (William Cattlye
1818). Ngồi ra Cattleya có đặc tính là nở hoa quanh năm. Đa số hoa nở vào mùa Xuân và Thu nhưng các
cây đã lai ghép giống nở bất cứ lúc nào trong năm.
Đặc biệt hiện nay dòng lan Cattleya mini đang được rất nhiều người ưa chuộng. Kích thước nhỏ, hương
thơm, nhiều màu sắc lạ hơn những dịng lan Cattleya phổ thơng giúp tạo được nhiều ấn tượng trong lòng
người chơi lan. Đối với các nước có nền cơng nghiệp hoa lan phát triển mạnh như Thái Lan, Hà Lan, Đài
Loan và Trung Quốc, lan nói chung và Cattleya nói riêng đều được đầu tư đi sâu nghiên cứu để khơng chỉ
tạo ra giị lan đẹp mà cịn có giá cả cạnh tranh. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp cho người
sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề bức xúc hiện nay. Chính vì vậy để giải quyết vấn đề này tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về mơi trường ni cấy. Mục tiêu của đề tài

này: Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan Cattleya mini, đánh giá hoạt
tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường nuôi cấy mô cây lan Cattleya mini.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
505


Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các chồi có chiều cao 5 mm, của giống phong lan Cattleya
mini tại phịng thí nghiệm của Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí
Minh.
2.2. Mơi trường ni cấy
Các thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật thường quy. Mơi trường sử dụng trong
thí nghiệm là mơi trường MS (Murashige và Shoog, 1962), tùy vào từng giai đoạn ni cấy mà các hóa
chất khác nhau, các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp. Các chất bổ
sung bao gồm: chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzylaminopurine); chitosan (là một polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các D-glucosamine và NGlucosamine liên kết tại vị trí β-(1-4) được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các lồi giáp xác: tơm, cua,...),
agar, nguồn carbon: sucrose; nước dừa.
2.3. Phương pháp
2.3.1. Điều kiện thí nghiệm
Để đảm bảo điều kiện vơ trùng, các thí nghiệm được thực hiện trong phịng ni riêng với các điều kiện:
nhiệt độ: 25 ± 2oC; cường độ sáng: 2500 – 3000 lux; thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày; độ ẩm trung bình:
85 – 90%.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm
2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya
mini
Bảng 1: Bố trí nghiệm thức kết hợp BA với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya mini
Nghiệm thức

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

0

A0

0,5

A1

0,5
1,0

A2

1,5

A3

2,0

A4

2,5

A5

2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya
mini
Bảng 2: Bố trí nghiệm thức kết hợp NAA với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya mini
Nghiệm thức

NAA (mg/l)

506

BA (mg/l)


0

A0

0,5

A1

1,0
1,0

A2

1,5

A3

2,0

A4

2,5

A5

2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya
mini
Bảng 3: Bố trí nghiệm thức kết hợp Chitosan với nồng độ BA, NAA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya
mini
Nghiệm thức

Chitosan

A0

0

A1

5

A2

10

A3

15

A4

20

A5

25

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

1,0

1,5

2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu sinh học thông dụng: khối lượng tươi (g), số
chồi (chồi/mẫu), số lá (lá/cây), số rễ (rễ/cây), đặc điểm.
2.3.3.Thống kê và xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.1. Tất cả các số liệu
sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình
cùng ký tự a,b,… thì khơng có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,…) chỉ sự sai khác
có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

507


3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya mini sau
12 tuần nuôi cấy
Chồi lan Cattleya mini được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi
được ni cấy trên mơi trường thạch MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20%

nước dừa và nồng độ BA tăng dần (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5) mg/l. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết
quả được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan sau 12 tuần nuôi cấy
NT

A0

BA

Khối

Số chồi

Số lá

Số rễ

(mg/l)

lượng

(chồi/mẫu

(lá/cây)

(rễ/mẫu)

tươi (g)

)

2,170c

6,33c

15,66c

24,67b

0,0

Đặc điểm

Cây to phát triển bình thường, rễ
dài, lá to nhưng ít chồi và lá.

A1
A2

0,5

3,174b

10,33b

35,67b

23,67b

Cây phát triển tốt, lá to và dài.

1,0

7,415a

13,33a

44,67a

51a

Cây phát triển xanh tốt, chồi
nhiều, lá nhiều, nhiều rễ, chồi
cao.

A3

1,5

1,528c

5,67cd

12,33c

13,67c

Cây phát triển khơng đều, ít chồi
và lá rễ nhiều mà ngắn.

A4

2,0

1,807c

1,33e

15c

17,33bc

Cây phát triển khơng đều, nhiều
chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn.

A5

2,5

2,364bc

3,33de

3,33c

17,00bc

Cây phát triển chậm, ít chồi, lá
nhỏ và ít, rễ dài, cây thấp.

Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… thì khơng có sự khác biệt về mặt
thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05
Khi kết hợp 0,5 mg/l NAA với nồng độ BA tăng dần từ ( 0; 0,5; 1,0 mg/l) thì các chỉ tiêu với trọng lượng
tươi (7,415a), số chồi (13,33a), số lá (44,67a), số rễ (51a) trên một mẫu cấy đều lần lượt tăng. Tuy nhiên nếu
tiếp tục tăng nồng độ BA cao hơn 1,0 mg/l cho đến 2,5 mg/l thì các chỉ tiêu tăng trưởng có xu hướng giảm
dần, đều này cho thấy rằng việc bổ sung sung BA ở nồng độ (1,0 mg/l) kết hợp với NAA cố định (0,5 mg/l)
vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tối ưu. Kết quả trên phù hợp với kết quả thí nghiệm của Đàm Sao Mai
và cộng sự (2009) cho rằng nồng độ BA phù hợp cho sự hình thành chồi Thơng đỏ trong thí nghiệm này là
1,0 mg/l. Tương tự với kết quả trên, trong trường hợp cây Populus tremila L. thì Bueno và cộng sự (2003)
đã dùng BA 1,0 mg/l để tạo chồi là tối ưu.
508


3.2 Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya mini sau
12 tuần nuôi cấy
Chồi lan Cattleya mini được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi
được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1,0 mg/l BA, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính, 20%
nước dừa và nồng độ NAA tăng dần (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5) mg/l. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu.
Kết quả được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan sau Cattleya mini
12 tuần nuôi cấy
NT

B0

NAA

Khối

Số chồi

Số lá

Số rễ

(mg/l)

lượng

(chồi/mẫu

(lá/cây)

(rễ/mẫu)

tươi (g)

)

8,034b

48,66 b

20,33b

0,00c

0

Đặc điểm

Cây phát triển bình thường, lá to
nhưng ít chồi và lá.

B1
B2

0,5

5,504d

36,33d

15,00c

0,00c

Cây phát triển khơng tốt, lá ít.

1,0

6,875 c

43,33c

19,00 b

0,00c

Cây phát triển khơng đều, ít

chồi và lá.

B3

1,5

9,887a

60,00a

27,66a

43,00a

Cây phát triển xanh tốt, chồi
nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to
xanh.

B4

2,0

4,483e

29,00e

14,00c

33,00b

Cây phát triển không đều, nhiều
chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn.

B5

2,5

4,265e

28,66e

12,00c

0,00c

Cây phát triển chậm, ít chồi, lá
nhỏ và ít.

Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… thì khơng có sự khác biệt về mặt
thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05
Khi kết hợp 1,0 mg/l BA với nồng độ NAA tăng dần từ ( 0; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l) thì các chỉ tiêu với trọng
lượng tươi (9,887a), số chồi (60,00a), số lá (27,66a), số rễ (43,00a) trên một mẫu cấy đều lần lượt tăng. Tuy
nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ BA cao hơn 1,5 mg/l cho đến 2,5 mg/l thì các chỉ tiêu tăng trưởng có xu
hướng giảm dần, đều này cho thấy rằng việc bổ sung sung NAA ở nồng độ (1,5 mg/l) kết hợp với BA cố
định (1,0 mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tối ưu. Kết quả này cũng tương ứng với kết quả thí
nghiệm của Đàm Sao Mai và cộng sự, (2009) trên cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) cho rằng khi
bổ sung NAA ở nồng độ 1,5 mg/l vào mơi trường ni cấy sẽ cho sự hình thành rễ tốt nhất, hay kết quả thí
nghiệm của Nguyễn Văn Ây và Lê Văn Hòa (2010) trên cây Tre rồng cũng cho thấy bổ sung NAA ở nồng
độ 2 – 4 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo rễ invitro.
509

3.3 . Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya
mini sau 12 tuần nuôi cấy
Chồi lan Cattleya mini được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi
được nuôi cấy trên mơi trường thạch MS có bổ sung 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1,0 mg/l
BA, 1,5 mg/l NAA và nồng độ chitosan tăng dần (0; 5; 10; 15; 20; 25) mg/l. Chúng tôi tiến hành thu thập
số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 6.
Bảng 6: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên tạo chồi lan Cattleya
mini sau 12 tuần ni cấy
NT

C0

Nồng

Khối

Số chồi

Số lá

Tỷ lệ

độ

lượng

(chồi/mẫu

(lá/cây)

sống xót

(mg/l)

tươi (g)

)

0

7,643a

332,66a

Đặc điểm

(%)
152,33a

100

Cây phát triển xanh tốt, lá to
xanh, nhiều chồi, nhiều lá.

C1

5

1,444d

47,66c

28,33cd

66

Cây phát triển khơng tốt, lá nhỏ
và ít.

C2

10

3,236b

133,00b

63,33b

95

Cây phát triển đều, nhiều chồi,
lá và mẫu sống tốt.

C3

15

1,919c

32,00d

33,66c

70

Cây phát triển khơng đều, chồi
ít, lá ít.

C4

20

1,246d

25,00d

25,00d

68

Cây phát triển khơng đều, mẫu
chết dần

C5

25

1,338d

21,66d

22,00d

60

Cây phát triển chậm, ít chồi, lá
và mẫu chết nhiều.

Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… thì khơng có sự khác biệt về mặt
thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05
Sau thí nghiệm 1 và 2, chúng tơi xác định được nồng độ BA, NAA tối ưu cho sự tăng trưởng chồi Cattleya
Hybrid White, chúng tơi tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ chitosan kết hợp với nồng độ BA,
NAA cố định cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White.
Mục đích: xác định nồng độ chitosan thích hợp cho sự hình thành chồi lan Cattleya Hyrid White.

510


Khi kết hợp 1,0 mg/l BA, NAA 1,5 mg/l với nồng độ chitosan tăng dần từ (0; 5; 10; 15; 20; 25 mg/l) thì ở
nghiệm thức C0 (0 mg/l chitosan) cho các chỉ tiêu với trọng lượng tươi (7,643a), số chồi (332,66a), số lá
(2152,33a), tỷ lệ sống sót (100) trên một mẫu cấy đều lần lượt tăng. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ
chitosan cao hơn 0 mg/l cho đến 25 mg/l thì các chỉ tiêu tăng trưởng có xu hướng giảm dần, đều này cho
thấy rằng việc bổ sung sung chitosan ở nồng độ (0 mg/l) kết hợp với BA cố định (1,0 mg/l), NAA cố định
(1,5 mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tối ưu. Qua thí nghiệm này việc bổ sung Chitosan ở các
nồng độ (5; 10;15; 20; 25) không phù hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattlaya mini. Theo Uthairatanakij và
cộng sự (2007), mức độ khử acetyl và nồng độ chitosan có hiệu quả khác nhau lên sự sinh trưởng và phát
triển của lan nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, các nồng độ chitosan xử lý từ 5 – 25 mg/l trong thí nghiệm này

cho hiệu quả lên sự sinh trưởng của cụm chồi lan Cattleya khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê.

(a)

(b)

(c)

Hình 1: Vai trị của BA, NAA và chitosan trong sự tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần ni cấy
Hình a: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya mini sau 12
tuần nuôi cấy (nghiệm thức A2: 1,0 mg/l BA) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu.
Hình b: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya mini sau 12
tuần nuôi cấy (nghiệm thức B3: 1,5 mg/l NAA) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu.
Hình c: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya
mini sau 12 tuần nuôi cấy (nghiệm thức A0: 0 mg/l chitosan) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu.
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ nghiên cứu này chúng tôi thu được kết quả như sau: khi bổ sung BA ở nồng độ (1mg/l) kết hợp với
NAA cố định (0,5mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tối ưu bên cạnh đó việc bổ sung NAA ở nồng
độ (1,5mg/l) kết hợp với BA cố định (1mg/l) vào môi trường nuôi cấy giúp cho mẫu cấy tăng trưởng và
phát triển xanh tốt, chồi nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to.Qua thí nghiệm sử dụng chitosan ở nồng độ (0mg/l)
kết hợp với NAA cố định (0,5mg/l), BA cố định (1mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tối ưu nhất.

511


Thí nghiệm này cho thấy việc bổ sung chitosan ở các nồng độ trong nghiên cứu này không phù hợp cho
quá trình tạo chồi và nhân nhanh lan Cattlaya mini.
4.2. Kiến nghị
Vì thời gian tiến hành nghiên cứu cịn hạn chế nên chúng tôi chưa thực hiện được các nghiên cứu sâu hơn

cần tiếp tục nghiên cứu:
− Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường có bổ sung các dịch chiết khác nhau như chuối, táo, khoai
tây, cà rốt,... đến sự hình thành chồi lan Cattleya mini.
− Nghiên cứu các điều kiện ánh sáng, giá thể khác nhau để hồn thiện quy trình nhân giống lan Cattleya
mini đưa cây con ra vườn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Văn Ây và Lê Văn Hòa (2010). Nhân giống cây tre rồng (Dendrocalamus giganteus Wallich
ex Munro) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Kỷ yếu Hội nghị Khoa Học “Phát triển nông nghiệp bền vững
thích ứng với sự biến đổi khí hậu”. NXB Nơng Nghiệp, trang 298-306.
[2]. Trần Văn Bảo (2001). Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Tiến Bân ,1990, Các cây hạt kín ở Việt Nam, tuyển tập các cơng trình nghiên cứu sinh thái
và tài nguyên sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
[4]. Bueno, M.A., Gomez, A., Manzanera, J.A. (2003). Propagation and DNA Markers Characterization of
Populus Tremula L. and Populus Alba L.. In: Jain, S.M., Ishii, K. (eds) Micropropagation of Woody
Trees and Fruits.
[5]. Nguyễn Minh Chơn (2010). Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật. NXB Đại Học Cần Thơ.
[6]. Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên (1998). Sa Pa nguồn lan rừng quý hiếm. Tạp chí Rau hoa quả số
1/1998.
[7]. Đàm Sao Mai, Nguyễn Thành Sum, Trần Khánh Viễn (2009). Nhân giống in vitro cây thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.) lồi cổ thực vật có giá trị dược liệu cao. Tuyển tập hội nghị cơng nghệ sinh học
tồn quốc khu vực phía Nam 2009. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. TP Hồ Chí Minh, trang 259264.
[8]. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Plant Physiol., 15, pp. 473-74.
[9]. Lê Võ Thùy Ngân. 2011. Hiệu quả của BA, TDZ, NAA và AgNO3 trên sự tạo chồi, nhân chồi và sinh
trưởng cây Đỗ quyên (Rhododendron sp.) in vitro. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Hoa viên - cây
cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Đại Học Cần Thơ.

512

[10]. Uthairatanakij A., Jaime A. Teixeira da Silva, and K. Obsuwan. (2007). Chitosan for Improving
Orchid Production and Quality. Orchid Science and Biotechnology, 1(1), pp. 1-5.

513