(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC HÀNH môn THỰC HÀNH VI SINH y học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÔNG Á


BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN: THỰC HÀNH VI SINH Y HỌC

Nhóm 2
Phân nhóm 8
Thành viên: 1) Cao Ngọc Tuấn
2)

Trần Thị Khánh Tường

3)

Huỳnh Thị Vi

Đà Nẵng , ngày 21 tháng 03 năm 2022


I. Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria?
1.
Mục đích thực hiện :
Phân lập vi khuẩn
2.
Hóa chất, dụng cụ :
Hố chất:
+
Mơi trường BHI
+
Mẫu vi khuẩn

- Dụng cụ:
+ Đèn cồn
+ Que cấy vòng
+ Bật lửa
+ Đĩa thạch
3.
Các bước thực hiện
- Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy mẫu vi
khuẩn
- Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que cịn nóng sẽ làm
chết vi khuẩn) rồi lấy mẫu vi khuẩn vừa đủ
- Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch (ria sát nhau), sau đó đốt
que cấy
- Xoay đĩa, ria lần 2 thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng
lên 1 nửa đường ria cuối của đường thứ nhất
- Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối của
đường thứ 2
Đốt que cấy
4.
K ết quả
- 3 đĩa 1, 2, 3 chỉ tách được vi khuẩn ở đường số 1, không
tách được ở số 2 và 3
- Đĩa 3 có hiện tượng lạ, mặc dù không tách được vi khuẩn
đường số 2, 3 nhưng lại xuất hiện 1 nhóm vi khuẩn lan rộng


Hình 1: kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria.

5.
Phân tích kết quả

- Ở 3 đĩa trên, khi thực hiện thao tác ria mẫu vi khuẩn, ở
đường thứ 2 đã không chạm đường cấy thứ 1 dẫn đến việc
đường cấy thứ 2 và 3 không xuất hiện vi khuẩn nên không cấy
tách được khuẩn lạc đơn.
- Đặc biệt ở đĩa thứ 3, mặc dù đường thứ 2 và 3 đều không
cấy được vi khuẩn nhưng trong quá trình làm, vì sai sót làm
rơi khuẩn trên thạch nên dẫn đến hiện tượng như trong ảnh.
 Kết luận: cả 3 đĩa không đạt yêu cầu.
II. Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy truyền ?
1. Mục đích thực hiện: Khảo sát sinh hóa các vi sinh vật ban
đầu sau q trình truyền vi sinh vật từ mơi trường này sang mơi
trường khác, bảo quản, nhân giống
2. Hóa chất, dụng cụ
Hoá chất:
+ Vi khuẩn E. coli
+Đĩa petri chứa thạch có mơi trường BHIA
- Dụng cụ:
+
Que cấy vịng
+
Đĩa petri vô khuẩn
+
Đèn cồn
+
Găng tay cao su
3. Các bước thực hiện
- Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy mẫu vi khuẩn
- Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que cịn nóng sẽ làm chết vi
khuẩn) rồi lấy khuẩn lạc đã được tăng sinh trong môi trường BHI
lượng vừa đủ

- Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch, sau đó đốt que cấy
- Xoay đĩa, ria lần 2 thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng lên 1
nửa đường ria cuối của đường thứ nhất.
- Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối của
đường thứ 2.
- Đốt đỏ que cấy.
4. Kết quả


Hình 2: Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy truyền.

5.

Phân tích kết quả
- Cả 2 đĩa đều không đạt yêu cầu.
- Ở đĩa của Vi cấy: lượng vi khuẩn dày đặc do lấy lượng
vi khuẩn mẫu ra quá nhiều. Đường cấy số 1 hết nửa đĩa, vi
khuẩn không tách được.
- Đĩa Tường cấy: Đường cấy số 1 tương đối đạt yêu cầu,
tuy nhiên đường cấy thứ 2, thứ 3 không thấy rõ.
III. Kết quả thử nghiệm môi trường MR-VP, SIM, simmon citrat:
1. Mục đích thực hiện
- Thử nghiệm MR-VP khảo sát khả năng lên men sinh acetoin của vi khuẩn.
- Thử nghiệm khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất của vi
khuẩn
- Thử ngiệm SIM: khảo sát tính di động của vi khuẩn
2. Hóa chất, dụng cụ
- Hóa chất: Mơi trường: MR-VP, simmon citrate agar ,SIM; vi khuẩn E.coli đã
được phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria.
- Dụng cụ: đèn cồn, găng tay y tế, que cấy thẳng, que cấy vòng.

3. Các bước thực hiện
Thử nghiệm MR-VP:

Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn là kết
quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn.

Bỏ vi khuẩn vào mơi trường MR-VP sau đó lắc đều cho vi khuẩn tan
ra.

Đốt đỏ que cấy.

Đợi 20 phút sau đó nhận xét.
Thử nghiệm Simmon citrate agar:

Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn là kết
quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn.

Cấy vi khuẩn vào môi trường simmon citratte agar lên mặt của môi
trường theo đường zig-zag.

Đốt đỏ que cấy.




Đem ủ ở nhiệt độ 37℃ tròng vòng 24h.


-

4.

Thử nghiệm SIM:

Đốt que cấy thẳng, làm nguội, dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn là kết
quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn.

Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào khối giữa thạch tròn và rút que
cấy ra theo đường cấy thẳng để tránh làm rách thạch.

Đốt đỏ que cấy.

Đem ủ ở nhiệt độ 37℃ tròng vòng 24h.
Kết quả

Hình 3: Kết quả thử ngiệm mơi trường Simmon citrat, SIM và MR-VP

5.

Phân tích kết quả

A. Mơi trường MR - VP:
- Nếu vi khuẩn phản ứng dương tính (+) thì bề mặt mơi trường sẽ chuyển sang
màu nâu đỏ, phản ứng âm tính (-) thì bề mặt mơi trường sẽ khơng thay đổi màu.
Từ hình ảnh của nhóm, có thể thấy môi trường VP không bị thay đổi màu
Kết luận: Phản ứng âm tính (-) . Cho thấy vi khuẩn E.coli khơng sinh acetoin trong
q trình lên men đường glucose.
B. Mơi trường Simmon citrat agar:
- Theo lí thuyết nếu vi khuẩn phản ứng dương tính thì mơi trường sẽ chuyển
sang màu xanh lam( xanh dương), phản ứng âm tính thì mơi trường sẽ khơng thay

đổi màu( giữ ngun màu xanh rêu cũ).
- Từ ảnh của nhóm thì ở mơi trường này không bị thay đổi màu chứng tỏ vi
khuẩn E.coli không phản ứng với môi trường Simmon citrat agar.
Kết luận : phản ứng âm tính, vi khuẩn E.coli khơng sử dụng citrat như nguồn carbon
duy nhất của vi khuẩn.


C. Mơi trường SIM
-

Trên mơi trường sim ta có thể khảo sát khả năng di động của vi khuẩn.

- Theo lý thuyết nếu vi khuẩn phản ứng dương tính thì các vi khuẩn sẽ di chuyển về
2 phía, phản ứng âm tính thì vi khuẩn sẽ ở im tại chỗ.
- Từ hình ảnh, ta có thể thấy vi khuẩn E.coli di chuyển về 2 phía (dương tính). Đúng
với lí thuyết đưa ra.
Kết luận: phản ứng dương tính, nhóm thực hiện đúng thao tác và kết quả theo lý thuyết.
IV. Kết quả thử nghiệm mơi trường KIA
1. Mục đích thực hiện
Mơi trường KIA cùng lúc phát hiện khả năng sử dụng đường (glucose,
lactose) và khả năng sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh và sinh gas.
2. Hoá chất và dụng cụ:
- Đèn cồn, bật lửa, que cấy nhọn, khuẩn lạc.
3. Các bước thực hiện.
- Vi khuẩn khảo sát được cấy 2 lần
+
Lần 1: Dùng que cấy vòng cấy trên mặt lớp thạch nghiêng
theo đường zigzac.
+
Lần 2: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào giữa khối thạch

tròn đường cấy thẳng và rút que cấy ra theo đường cấy thẳng để
tránh làm rách thạch.
4.Kết quả:
- Theo lý thuyết kết quả gồm 3 phần:
+ Phần thạch trong: đọc phản ứng sử dụng glucose: + màu vàng, màu đỏ, sự sinh ga nếu có sự nứt thạch.
+ Phần thạch nghiêng: Đọc phản ứng sử dụn lactose: + màu vàng, màu đỏ.
+ Vùng tiếp giáp giữa hai phần: Đọc phản ứng sinh H2S, nếu
dương tính có màu đen.
- Lọ 1,2,4,5 có sự sinh ga và lọ 1,2,3,4,5 có sử dường glucose và
lactose


Hình 4: Kết quả thử nghiệm mơi trường KIA

5. Phân tích kết quả
-

Phần thạch nghiêng: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng lactose.

-

Vùng thạch trịn: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng glucose.

-

Vùng tiếp giáp giữa 2 phần: khơng có màu đen (-) → khơng sinh ra H2S.

-

Cả 5 ống ta đều có có hiện tượng nứt thạch, chứng tỏ có sự sinh gas xảy ra.

- Ở vùng thạch nghiêng, vi khuẩn đang mọc lên theo đường cấy và thấy được
sự di động của vi khuẩn. Tuy nhiên đường cấy ziczac hơi sát nhau dẫn đến vi
khuẩn
- Vùng thạch trịn ta khơng thấy được khi khuẩn mọc lan ra, nguyên nhân có
thể là thao tác cấy chưa đúng hoặc là thời gian ta đem đi ủ chưa đủ để vi khuẩn có
thể di động mọc lan ra.
V.
Kết quả phân tích định lượng
1.
Mục đích thực hiện : Xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu là pha
loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó.
2.
Hóa chất, dụng cụ :
- Mẫu vi khuẩn.
- Ống nghiệm.
- Micropipette.
- Dung dịch NaCl 0,9%.
- Đèn cồn.
- Đầu tuýp gắn với micropipette.


-

Đĩa petri thạch trong môi trường BHA.
Que bông vô khuẩn.
Que cấy vi sinh.
3.
Các bước thực hiện
Dùng micropipet hút 9 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% lần lượt vào 7 ống

nghiệm. (1)
Tiến hành pha loãng mẫu: dùng micropipet cho vào hút 1ml mẫu cho vào ống
nghiệm chứa 9ml dung dịch muối sinh lý ở trên rồi lắc đều, ta có được dung dịch có nồng
độ 10-1.
Sau đó lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống 9ml nước muối sinh lý ở ống nghiệm
đã chuẩn bị ở (1) sẽ thu được ống nghiệm thứ 2 có nồng độ 10 -2. Tiếp tục lấy 1ml dung
dịch 10-2 cho vào dung dịch nước muối sinh lý 0,9% ở ống nghiệm thứ 3 ta thu được
dung dịch có nồng độ 10-3, làm tương tự cho đến ống nghiệm thứ 7 thì ta thu được dung
dịch có nồng độ 10-7.
Sau khi pha xong, dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch có nồng độ 10-1 cho vào
đĩa petri đựng thạch trong môi trường BHA rồi dùng que bông vô khuẩn trải đều khắp
mặt thạch và quét 1 vòng quanh đĩa thạch. Cứ như thế cho đến khi xong hết 7 đĩa với đĩa
cuối cùng là dung dịch có nồng độ 10-7. Cuối cùng đem ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 24h.
4.
Kết quả
-

Đếm được 34 khuẩn lạc trên đĩa petri ở đĩa số 7.
 Số lượng tế bào trong dung dịch: Áp dụng công thức:
A=
A=

Với: A: tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn
V:

thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

Fi: độ pha lỗng tương ứng
5. Phân tích kết quả

Hình5: Kết quả phân tích định lượng.

VI. Kết quả kháng sinh đồ, MIC
1. Mục đích thực hiện
- Dùng để xác định mức độ nhạy cảm của kháng sinh thử nghiệm đối với vi
khuẩn gây bệnh, cũng có nghĩa là phát hiện sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
thử nghiệm. Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc
hiệu.
2. Hóa chất, dụng cụ
- Hóa chất: Đĩa thạch đã có mơi trường MHA, vi khuẩn E.coli đã được phân lập
vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria, nước muối sinh lý, 12 giấy kháng sinh khác
nhau.
- Dụng cụ: Đèn cồn, găng tay y tế, ống ngiệm có nút bơng, que cấy vơ khuẩn,
pipet nhựa.
3. Các bước thực hiện
Bư ớc 1: Pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý đến độ đục chuẩn 0.5
McFarland (1-3.108 vi khuẩn/ml)
Bư ớc 2: Trải vi khuẩn: dùng que bông vô trùng thấm dung dịch chuẩn đã được pha
loãng 0,5 McFarland, xoay que trên thành ông ngiệm để ép cho ráo nước,
rồi trải lên mặt đĩa thạch thật đều và kín. Khi trải được ½ hộp, xoay 60° và
trải lần 2, xoay hộp 60° và trải lần 3. Cuối cùng dùng que bơng qt 1 vịng
xung quanh, sát hộp thạch.
Bư ớc 3: Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở nhiệt độ 37℃ trong quá trình 15
phút.
Bư ớc 4: Đặt kháng sinh: dùng kẹp được tiệt khuẩn (đốt trên ngọn lửa đèn cồn, làm
nguội), kẹp khoanh giấy rồi đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, 1 đĩa
thạch được đặt 3 loại kháng sinh khác nhau sao cho khoảng cách giữa 3
kháng sinh đều nhất trên đĩa thạch. Các kháng sinh cách nhau tối thiểu 2,5

cm và cách thành hộp tối thiểu 2cm, không được xê dịch các kháng sinh sau
khi đặt. Chỉ được phép đặt khi bề mặt đĩa thạch đã khô.
Bước 5: Ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24h
4. Kết quả


Hình 6: Kháng sinh đồ, MIC

5.

Phân tích kết quả

Kết quả thưc hiện kỹ thuật kháng sinh đồ: Trong quá trình thao tác trải đĩa vi
khuẩn E. coli chưa được trải đều ra nên sản phẩm trên đĩa có những đường vệt dài,
nhưng vẫn có thể đo đường kính vịng vơ khuẩn được. Các giấy kháng sinh được
trải đều và cách nhau, dễ nhìn và có thể dễ dàng đo được đường kính vịng vơ
khuẩn.
- Do có sự nhầm lẫn dẫn đến thất lạc 1 đĩa MHI, nên nhóm 8 thí nghiệm thiếu 3
kháng sinh là Cefoxitin, Colistin, Tobramycin với yêu cầu bài và các nhóm thực
hành khác.
Số đĩa thí
nghiệm

Kí

Ac
Đĩa 1

Ci

Cz

M
Đĩa 2

Cu

Im


Kn
Đĩa 3

En
Ge