(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP
CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Nhóm: 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm: 03
1. Lê Minh Tuấn
2. Tơ Thành Trung
3. Phan Văn Quốc Việt

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP
CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Nhóm: 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm: 03
4.

Lê Minh Tuấn

5.

Tơ Thành Trung

6.

Phan Văn Quốc Việt

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021
2


MỤC LỤC
BÀI 1.. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT…………………………………………...……
1
1.1.. Tóm tắt lý thuyết…………………………………………………………………...…
1
1.2.. Kết quả…………………………………………………………….………….………
5
1.3.. Bàn luận…………………………………………………………..……………..……9

BÀI 2.. TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT…………………………..
….12
2.1.. Tóm tắt lý
thuyết…………………………………………………………………….12
2.2.. Kết quả………………………………………………………………………………
16
2.3.. Bàn
luận……………………………………………………………………………...18
BÀI 3.. CỐ ĐỊNH CGTase LÊN
ALGINAT………………………………………………..19

3.1.. Tóm tắt lý
thuyết…………………………………………………………………….19
3.2.. Kết quả………………………………………………………………………………
20
3.3.. Bàn
luận……………………………………………………………………………...24
BÀI 4.. TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ ÁI
LỰC………………………………...27
4.1.. Tóm tắt lý
thuyết…………………………………………………………………….27
4.2.. Kết quả………………………………………………………………………………
30
4.3.. Bàn luận……………………………………………………………………………..32
i


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

ii


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

BÀI 1.
1.1.

CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

Tóm tắt lý thuyết

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình công nghệ do các ưu thế như dễ nuôi
cấy ở qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng được các cơ chất rẻ tiền và khả năng cho
nhiều sản phẩm đa dạng. Phân lập và tuyển chọn giống vi sinh vật từ các nguồn gen tự nhiên
hoặc cải tạo từ việc gây đột biến nhằm tạo ra giống có hoạt tính, có các đặc tính mong muốn
và khả năng cạnh tranh cao. Bên cạnh đó việc chọn lọc giống sẽ khơng có ý nghĩa nếu
chủng khơng được bảo quản để có thể sống sót và ổn định các tính trạng thu được.
1.1.1. Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng từ tự nhiên hay gây đột biến và phát hiện
dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn
Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên
Để chọn lọc được giống vi sinh vật thích hợp, bước đầu tiên là chúng ta có thể phân lập
chúng theo kiểu “săn lùng” từ các nguồn tự nhiên như mô, xác của động vật, thực vật, đất,
chất thải, nước thải hoặc khu trú và định hướng vào các nơi sinh sống tự nhiên của vi sinh
vật như lớp bùn trầm tích dưới ao hồ, các lò mổ, giếng dầu,…
Nguyên tắc của phương pháp
Trước hết chọn và kiểm tra sơ bộ địa điểm lấy mẫu để thu được mẫu vi sinh vật có đặc
tính mong muốn. Lấy mẫu (ví dụ trong bài thực tập mẫu sẽ được lấy từ đất), thêm 10 ml
PBS, vortex, để lắng và pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp số 10 đến ống số 6.
Hút 100 µl huyền phù vi sinh vật ở 3 cấp độ cuối (4, 5, 6), trải lên mơi trường thích hợp
và ủ ở nhiệt độ thích hợp (37 ˚C trong 24 giờ đối với vi khuẩn, nhiệt độ phòng trong 7
ngày đối với vi nấm, xạ khuẩn)

1


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Hình 1.1. Hình minh họa nguyên tắc phân lập vi sinh vật từ mẫu đất
Các phương pháp đột biến
Các tác nhân gây đột biến chia thành ba nhóm:
-

Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y hoặc bắn phá bằng hạt

nơtron hay electron.
-

Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozomethylguanidin,

methyldicloroetylamin, nitrit, hydroxylamin hay ethylametansunfonat.
-

Những tác nhân sinh học: Gây đột biến bằng Transposon. Thông qua tiếp hợp, các

plasmid mang Transposon (yếu tố Tn) đến tế bào cần gây đột biến và có thể chuyển đến
các vị trí khác trên nhiễm sắc thể hay plasmid và làm gián đoạn các gen tại đó dẫn đến
đột biến.
Để phân lập và tăng sinh thể đột biến có thể đạt được bằng một số cách thơng dụng sau
-

Nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa chất ức chế như kháng sinh, chất

độc hay thực khuẩn, chỉ những thể đột biến kháng chất ức chế mới mọc được
-

Nuôi cấy trên môi trường thiếu chất tăng trưởng nhưng chứa kháng sinh như

Penicillin hay các chất khác chỉ để tiêu diệt tế bào đang tăng trưởng, thể đột biến
khuyết dưỡng không mọc trên môi trường tối thiểu nên sống sót. Sau đó trải lên mơi
trường hồn chỉnh thì mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên thể đột biến mọc
được

-

Thêm mơi trường ni cấy chất kháng chuyển hóa, do có cấu trúc giống với chất

chuyển hóa thơng thường nên các chất kháng chuyển hóa tham gia vào quá trình trao
đổi chất, nhưng do khơng có chức năng sinh học nên làm các tế bào bình thường
koong thực hiện được đầy đủ chức năng sống dẫn tới tác dụng ức chế và chết tế bào.
Các thể đột biến mất khả năng sử dụng được các chất này hoặc do đột biến mất khả
năng điều hòa nên sản xuất vượt mức chất chuyển hóa bình thường nên khơng sử dụng
các chất kháng chuyển hóa dẫn tới vẫn tăng trưởng bình thường.


2


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Phát hiện dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn
Bảng 1.1.

Bảng trình bày một số loại đặc tính của vi sinh vật và phương pháp sàng lọc

STT

Loại hoạt tính

1

Amylase ngoại bào

2

Protease ngoại bào

3

Kháng sinh

4

Không di động

5

Không tạo nha bào

6

Khuẩn lạc xù xì

7

Dinh dưỡng

8

Lên men đường

9

Kháng thuốc

10

Kháng virus


11

Nhạy cảm với nhiệt
độ bình thường

12

Mất sắc tố

3


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định được khả năng sinh enzym phù
hợp với yêu cầu sản xuất qui mơ lớn trong cơng nghiệp hoặc hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm, virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập. Để xác định khả
năng sinh enzym, phương pháp áp dụng là trải vi khuẩn lên môi trường có chứa chất cảm
ứng và sử dụng chỉ thị thích hợp để phát hiện. Phương pháp chủ yếu được sử dụng trong
việc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh thường dùng hai kiểu kỹ thuật:
Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định.
Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định.

Đối với trong bài thực tập thì sẽ sử dụng 4 chủng Bacillus và khảo sát tác dụng với 2
chủng thử nghiệm là Staphylococcus và E.coli.
1.1.2. Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật
Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: (thời gian cấy truyền 1 tuần - 1 tháng)
-

Cấy truyền trên môi trường dịch thể.

Cấy truyền trên môi trường

thạch.  Ưu điểm: đơn giản, dễ làm.
 Nhược điểm: tốn công sức, môi trường và thời gian: không ổn định.
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng: vaselin,
parafin,..
(giữ chủng 1- nhiều năm)
- Đơn giản, hiệu quả cao.
-

Môi trường không bị mất nước.

-

Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với cấy truyền vi sinh vật.

Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt
-

Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử.

-

Thời gian bảo quản 1- nhiều năm.

Phương pháp đông lạnh
-

Phương pháp đơn giản.

-

Vi sinh vật giữ được lâu 6 tháng - 10 năm.

4


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp
-

Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp.

-

Làm giảm hoặc làm ngừng quá trình phân chia của vi sinh vật.

-

Vi sinh vật khơng bị biến đổi về các đặc tính di truyền.

-

Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm.

-

Được dùng nhiều trong sản xuất.

1.2.

Kết quả

1.2.1. Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease
Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym

Mơi trường phát
lỗng

Hình 1.1.

Khuẩn lạc được phân lập trên môi trường thạch tinh bột tương ứng từng cấp độ pha loãng

5


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Mơi trường phát
lỗng

Hình 1.2. Khuẩn lạc được phân lập trên mơi trường thạch gelatin tương ứng từng cấp độ pha loãng

Đĩa phân lập Amylase ngoại bào trên thạch tinh bôt và Protease ngoại bào trên thạch
gelatin
Phát hiện Amylase ngoại bào

Hình 1.3. Đĩa thạch tinh bột hiện màu tím than sau khi tráng bề mặt với dung dịch Lugol dùng
để phát hiện Amylase ngoại bào

6


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Phát hiện Protease ngoại bào

Hình 1.4. Đĩa thạch gelatin bị đục sau khi tráng bề mặt với TCA 50% dùng
để phát hiện Protease ngoại bào

1.2.2. Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

Mặt trước

Mặt sau

Hình 1.1. Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2, B3,
B4 kí hiệu tương ứng trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải Staphylococcus
7

Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Mặt trước

Hình 1.2.

Mặt sau

Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2, B3, B4 kí hiệu tương

ứng trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải E.coli

1.2.3. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào và sinh kháng
sinh
Bảng 1.1.

Chủng

Mơ tả khuẩn lạc (*)

1

Khóm trịn, trắng đục, bề mặt có
nhẵn bóng, bìa ngun, màu trắn
đục, khóm lồi, có chỏm ở giữa. d
khoảng 5 mm
Khóm trịn, trắng đục, bề mặt nh
nheo, bìa răng cưa, khơng nhơ
khóm dẹt. d khoảng 5mm
Khóm trịn, trắng đục, bề mặt có

nhẵn bóng, bìa ngun, màu trắn
đục, khóm lồi, có chỏm ở giữa. d
khoảng 3 mm.

2

3

4

Khóm tròn, trắng đục, bề mặt nh
8


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

nheo, bìa răng cưa, khơng nhơ,
khóm dẹt. d khoảng 2mm

*Mơ tả khuẩn lạc gồm: hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.
*
Ghi nhận đường kính vịng phân giải, hoặc đường kính vùng kháng khuẩn.

1.2.4. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Bảng 1.1.

Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh

Chủng Đường kính

Bacillus 1
Bacillus 2
Bacillus 3
Bacillus 4
Ghi nhận đường kính vùng kháng khuẩn, trong đó đường kính vùng kháng khuẩn = đường kính
vịng phân giải – đường kinh lỗ

1.3.

Bàn luận

Hinh 1.2 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch tinh bột tương ứng 3 cấp độ pha loãng khác
nhau và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng
và kích thước khác nhau sau khi nuôi cấy 24 giờ. Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên
các đĩa thạch tương ứng.
Hinh 1.3 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch gelatin tương ứng 3 cấp độ pha lỗng khác nhau
và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng và
kích thước khác nhau sau khi ni cấy 24 giờ. Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên
các đĩa thạch tương ứng.
Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch tinh bột số 4 (Hình 1.2) tương ứng với cấp độ pha lỗng 10 -4
có tổng cộng 63 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Amylase. Khi tráng bề mặt môi
trường thạch tinh bột với dung dịch Lugol, nền mơi trường sẽ có màu tím than do màu
của iod với tinh bột (Hình 1.4), ngồi vịng sáng do các khóm để lại sau khi đã bị rửa trơi


9


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

và đổ bỏ cùng với dung dịch Lugol còn tồn dư trên bề mặt thạch, khơng thấy sự xuất hiện
của vịng sáng đặc trưng xung quanh vị trí các khóm ban đầu (vòng sáng đặc trưng do
tinh bột bị amylase ngoại bào thủy phân nên không tạo màu với iod làm cho xung quanh
vị trí đó khơng có màu tím). Như vậy, khuẩn lạc mọc trên thạch tinh bột khơng có khả
năng sinh ra Amylase ngoại bào.
Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch gelatin số 4 (Hình 1.3) tương ứng với cấp độ pha lỗng 10 -4 có
tổng cộng 59 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Protease. Sau khi đã nuôi cấy sau
24 giờ, môi trường thạch gelatin mọc lên 2 loại khuẩn lạc, tiếp đó cho TCA 50% vào mơi
trường thạch gelatin, nền mơi trường sẽ đục vì gelatin bị kết tủa trắng (Hình 1.5) . Trong
đó, vịng sáng bao quanh các khóm trên đĩa là do vi sinh vật có sinh Protease ngoại bào
làm gelatin bị thủy phân nên khơng bị tủa nên đường kính của vịng phân giải gelatin tỷ
lệ với hoạt tính. Quan sát kĩ hơn thì nhóm thấy xung quanh chủng 4 xuất hiện vịng sáng
nhỏ, rõ, bao xung quanh khuẩn lạc, chủng 3 thì vòng sáng to hơn và rõ hơn, chứng tỏ
chủng 3 có hoạt tính enzym cao hơn so với chủng 4. Như vậy, nhìn chung thì khuẩn lạc
mọc trên thạch gelatin có khả năng sinh ra Protease ngoại bào.
Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng
trưởng của nó với vi sinh vật khác, trên đĩa trải E. coli (Hình 1.7), trong 4 lỗ gồm B1-B4
xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ với kích thước vịng kháng khuẩn lớn nhất là B1,
giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất là B4. Lỗ chứng chỉ chứa môi trường và không
xuất hiện vịng ức chế xung quanh lỗ, điều đó chứng tỏ môi trường không bị tạp nhiễm từ
môi trường bên ngồi.
Đối với S. aureus (Hình 1.6), lỗ chứng chỉ chứa mơi trường và khơng xuất hiện vịng ức
chế xung quanh lỗ, trong 4 lỗ B1-B4 xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ trong đó khi
quan sát đường kính vịng kháng khuẩn, khả năng sinh enzym mạnh nhất vẫn là B1 và
giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất vẫn là B4. Điều này tương tự với bên đĩa trải
E.coli nên chứng tỏ hoạt tính sinh kháng sinh mạnh nhất là B1, thấp nhất là B4, hai chủng
B2 và B3 ở cả 2 đĩa trải 2 chủng thử nghiệm khác nhau đều có kích thước gần nhau và có
hoạt tính sinh kháng sinh ở mức trung bình.
Tuy nhiên, khi so sánh đường kính vịng kháng khuẩn giữa hai đĩa trải 2 chủng thử
nghiệm bao gồm 1 vi khuẩn Gram dương (S.aureus) và 1 vi khuẩn Gram âm (E.coli) thì

có thể thấy vịng kháng khuẩn ở đĩa S.aureus có kích thước lớn hơn rất nhiều so với kích
10


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

thước vịng kháng khuẩn bên đĩa E.coli. Từ đó nhóm có nhận xét là cả 4 chủng Bacillus
B1-B4 dùng để khảo sát có khả năng sinh kháng sinh có phổ kháng khuẩn nghiêng về
Gram dương nhiều hơn và có tác động ít hơn trên vi khuẩn Gram âm. Các vòng kháng
khuẩn bên đĩa trải S.aureus có sự tiếp xúc và chồng lấp ở phần mép ngồi vịng khống
khuẩn với nhau. Tuy nhiên điều này khơng gây ảnh hưởng gì nhiều tới việc nhận định và
bàn luận của nhóm.
Vì thời hạn cho phép của bài thực tập nên việc sàng lọc hoạt tính sinh kháng sinh của 4
chủng Bacillus chỉ dừng lại ở việc cung cấp sơ bộ thông tin về hoạt tính của từng chủng
cũng như phổ kháng khuẩn của cả 4 chủng khảo sát lên 2 chủng thử nghiệm. Để có thể
đưa ra thêm nhiều nhận định khách quan và chính xác hơn, Nhóm 3 đề nghị thực hiện
thêm một vài khảo sát như phương pháp Kirby-Bauer, phương pháp E-test để có thể xác
định được mức độ kháng khuẩn và các giá trị MIC mà các chủng B1-B4 có thể mang lại.
Từ đó có thể chọn lọc và cải tạo giống theo chiều hướng tốt hơn.

11


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

BÀI 2.
2.1.

TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

Tóm tắt lý thuyết

2.1.1. Enzym Amylase
Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glycosidic bên trong
tinh bột thành các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, chẳng hạn như các đơn vị
glucose, maltose và maltotriose.

Hình 2.1. Hình minh họa quá trình thủy phân liên kết α-1,4-glycosidic của Amylase để tạo
thành các tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử thấp chẳng hạn glucose

Amylase là một trong những enzym quan trọng nhất và có ý nghĩa to lớn đối với cơng
nghệ sinh học. Chúng có thể được lấy từ một số nguồn, chẳng hạn như thực vật, động vật
và vi sinh vật. Ngày nay, một số lượng lớn các amylase của vi sinh vật được bán trên thị
trường và chúng đã gần như thay thế hồn tồn q trình thủy phân hóa học tinh bột trong
cơng nghiệp chế biến tinh bột.

12


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

2.1.2. Ứng dụng của enzym Amylase
Ứng dụng của enzym amylase trong chế biến thực phẩm gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong
khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng nguồn tinh bột,
người ta thường cho thêm enzym amylase vào.
Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho q trình
chuyển hóa tinh bột tốt hơn.
Ứng dụng của enzym amylase trong dược phẩm
Amylase được sử dụng đế phối hợp với coenzym A, cytocrom c, ATP, carboxylase điều

chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh. Mặt khác amylase phối hợp với enzym
thủy phân đế chữa bệnh thiếu enzym đường tiêu hóa.
Trong cơ thể, amylase là hormon tuyến tuỵ ngoại tiết, có tác dụng chống phù nề sau chấn
thương hoặc sau mổ. Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuấn đuờng hô hấp
trên hoặc dưới. Các sản phầm chứa enzym alpha- amylase sẽ kiểm soát lượng calo của cơ
thể.
Sản phẩm chứa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống
suy dinh dưỡng.
Sử dụng enzym amylase trong chuẩn đoán bệnh viêm tụy cấp ở trẻ
em Ứng dụng của enzym amylase trong công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh
bột và làm cho vải mềm.
Ứng dụng của enzym amylase trong việc tẩy màu giấy
Nguyên lý hoạt động của enzym là: chúng bẻ gẫy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéo
theo sự lảm lỏng các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho qúa trình khử
mực.
Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất bia

13


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase: khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang
trạng thái nảy mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ
thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm.
Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất cồn
Quá trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa.
Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase (không thể sử dụng
phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid).

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất HFCS
HFCS (High Fructose Com Syrup) là một nhóm bất kì của siro bắp mà trải qua quá trình
enzym để làm tăng hàm lượng fructose và sau đó được pha trộn với siro bắp sạch (100%
glucose) để tạo thành dạng sản phẩm cần thiểt.
Ngoài ra, enzym amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường
bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose fructose, sản xuất tương và
nước chấm... ở quy mơ cơng nghiệp.
Enzym amylase có thể thu nhận từ các nguồn vi sinh vật (nấm sợi, nấm men hay vi
khuẩn), thực vật (có trong ngũ cốc nảy mầm với hàm lượng cao), động vật (trong tuyến
tụy và tuyến nước bọt).
2.1.3. Gel alginate
Tổng quan về gel alginate
Alginate là một polyme anion có nguồn gốc tự nhiên thường thu được từ rong biển nâu,
và đã được nghiên cứu rộng rãi và sử dụng cho nhiều ứng dụng y sinh, do tính tương hợp
sinh học, độc tính thấp, giá thành tương đối thấp.
Các phân tử thuốc, từ thuốc hóa dược đến protein đại phân tử, có thể được giải phóng
khỏi gel alginate một cách có kiểm sốt, tùy thuộc vào loại liên kết chéo và phương pháp
liên kết. Ngoài ra, gel alginate có thể được dùng bằng đường uống hoặc tiêm vào cơ thể
và cho phép ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm. Gel alginate cũng có triển vọng
để cấy ghép tế bào trong kỹ thuật mô. Kỹ thuật mô nhằm mục đích cung cấp các mơ và
cơ quan thay thế nhân tạo cho những bệnh nhân bị mất hoặc hỏng cơ quan hoặc mô.
Trong cách tiếp cận này, hydrogel được sử dụng để đưa các tế bào đến vị trí mong muốn,
14


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

cung cấp khơng gian cho sự hình thành mơ mới và kiểm sốt cấu trúc và chức năng của
mơ được thiết kế.

Đặc điểm của gel alginate
Sản phẩm khi hịa tan hồn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành một
chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và glucuronate có thể
là một chuỗi (M-M-M)-(G-G-G) hoặc có thể đó là (M-G-M-G). Tỉ lệ cao của glucuronate
làm gia tăng sự bền vững của gel.
Phương pháp tạo hạt rất đơn giản. Hỗn hợp enzym và alginate được nhỏ xuống dung dịch
CaCl2 để tạo hạt gel bao bọc lấy enzym.
Khi cho hỗn hợp enzym và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dịch CaCl 2 sẽ tạo
thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0,5 - 4mm) chứa enzym bên trong. Hạt có
cấu trúc bền vững. Để ổn định hạt gel có thể cho hạt gel trong dung dịch glutaraldehyde.
Tuy nhiên gel này lại không bền trong mơi trường có phosphate
Enzym được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzym và các chất có
trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ
dàng. Điều này cho phép tinh chế enzym từ dịch enzym thô. Phương trình phản ứng
2 Na(Alginate) + Ca2+ —> Ca(Alginate)2 + 2 Na+
2.1.4. Qui trình tinh chế enzym
Thêm 10 ml
dịch chiết khoai
lang
Ủ 45 phút, úp
ngửa 5 lần mỗi 5
phút
Alginate trong đệm
CH3COONa 0,2 M
pH 4,8 30 ml

Amylase tinh chế

Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

2.2.

Kết quả

2.2.1. Hàm lượng protein
Bảng 2.1.

Mẫu

Hàm lương protein cua enzym thô và tinh chế

Thể tích (ml)

OD280

Hàm lượng protein
(mg)
Enzym thơ
Enzym tinh chế

2.2.2. Hoạt tính enzym
Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
Bảng 2.1.

Thơng số đường chuân tinh bôt dùng để xác định hoạt độ Amylase

Ống
U/ml

OD560
Hình 2.1.

Đường chuẩn từ dung dịch tinh bột 1% dùng để xác định hoạt độ enzym Amylase

16


Nhóm 11 - Chiều thứ 2 - Tiểu nhóm 03

Hoạt tính enzym
Bảng 2.2.

Hoạt tính enzym thơ và tinh chế

Mẫu
Enzym thơ
Enzym tinh chế
Tính: Hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
Xác định hàm lượng protein thô bằng OD280nmn (n: hệ số pha lỗng)
∑protein thơ = OD280nm x n x Vthơ = 0,3621 x 20 x 10 = 74,72 (mg)
∑protein tinh chế = OD280nm x n x Vtinh chế = 0,4436 x 1 x 23 = 10,2028 (mg)
Định lượng hoạt tính amylase
Từ phương trình đường chuẩn xác định được lượng tinh bột tương ứng:
∆OD280nm thơ = 1,0024–0,2585 =0,7439→ Hoạt tính enzym = 0,7376 (U/ml)
HTCemzym thơ = Hoạt tính enzym x n x Vthô = 0,7376 x 100 x 10 = 737,6 (U)
∆OD280nm tinh chế = 0,9651- 0,2547 = 0,7104 → Hoạt tính enzym = 0,7031 (U/ml)
HTCemzym tinh chế = Hoạt tính enzym x n x Vtinh chế = 0,7031 x 10 x 23 = 161,713 (U)

Hoạt tính riêng của enzym tinh chế:

HTRemzym tchế = HTCemzym tchế/∑Proteintchế = 161,713/10,2028 = 15,85(U/protein)
Hoạt tính riêng của enzym thô:
HTRemzym thô = HTCemzym thô / ∑Proteinthô = 737,6 / 72,42 = 10,185 (U/protein)
Hiệu suất cố định:
HS = (HTCenzym tinh / HTCemzym thô ) x 100 = (161,713 / 737,6) x 100 = 21,92
% Mức tinh chế = HTRemzym tinh chế / HTRemzym thô = 15,85 / 10,185 = 1,56
Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất khá cao 21,92 %,
Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng 1,56 lần

17