Báo cáo thi khoa học kĩ thuật dành cho học sinh, đề tài môn sinh học, khảo sát tế bào gây ung thư

A. PHẦN CHUNG
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Xu hướng ngày nay việc sử dụng dược liệu từ thiên nhiên đặc biệt là dược
liệu từ thực vật đang được con người ưa chuộng. Hiện nay ung thư là một căn
bệnh quái ác, đe dọa đến tính mạng và sức khỏe của con người. Do đó, việc điều
chế các loại thuốc điều trị và khống chế căn bệnh ung thư là một vấn đề cấp
bách trong xã hội.
Được sự bảo trợ của PGS TS. Mai Đình Trị và hướng dẫn của Thầy Nguyễn
Trung Duẩn, mong muốn tìm ra các chất có ích trong việc chữa bệnh cho con
người nhằm gìn giữ và bảo tồn loài cây dược liệu quý này, chúng em chọn đề tài
“Khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan,
vú, tử cung của các phân đoạn cao hexane lá cây trôm Sterculia foetida
Linn. (Sterculiaceae)”
II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Việt Nam chưa có tác giả nghiên cứu về thành phần hóa học trên lá trơm
cũng như dược tính. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và dược tính của
lá trơm (Sterculia foetida Linn.) là rất cần thiết.
III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng

Lá trôm thu hái huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận được định danh bởi TS.
Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp. HCM.
Mẫu tiêu bản (VH/TRI-0118) được lưu giữ tại Phịng các chất có hoạt tính
sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học.
2. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính cao hexane của
lá trơm thuộc phân đoạn III.
Nơi thực hiện: Phịng cơng nghệ hóa học hoạt tính sinh học - Viên Cơng Nghệ
Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, Tp HCM.
IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

∗
∗

Trích ngâm dầm bột lá cây trong etanol.
Chiết lỏng – lỏng với dung môi hexane.
1


∗
∗
∗

Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform.
Chiết lỏng – lỏng với dung môi etyl axetat.
Sử dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột pha thường để tách và tinh chế

chất.
∗ Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm để giải đoán cấu trúc của các hợp
chất tinh khiết: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối lượng
phun mù điện phân giải cao (HR-ESI-MS).
V. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Có những nội dung chính như sau:
-

Lá cây trơm được thu hái, lặt bỏ lá vàng úa, sâu bệnh, rửa sạch và
phơi khơ, sau đó đem xay thành bột.

-

Điều chế cao etanol thô từ bột cây khô bằng phương pháp ngâm

dầm.

-

Từ cao etanol thơ điều chế các cao có độ phân cực tăng dần từ
hexane, chloroform, ethyl axetat bằng phương pháp chiết lỏng –
lỏng.

-

Sắc ký cột cao hexane thành các phân đoạn nhỏ.

-

Sàng lọc hoạt tính gây độc trên các dịng tế bào ung thư các phân
đoạn của cao hexane.

-

Cô lập và tinh chế các hợp chất trong phân đoạn có hoạt tính cao
nhất.

-

Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết cô lập từ lá cây
trôm bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
và phổ khối lượng phun mù điện phân giải cao (HR-ESI-MS).

-

Thử hoạt tính gây độc trên các dịng tế bào ung thư các hợp chất
cô lập được.

2


VI. NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Lá trôm ở Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu khoa học nào về thành
phần hóa học các hợp chất cũng như dược tính của chúng.
Đặc biệt đề tài này đã phân lập ra một hợp chất mới mà trên Thế giới
chưa một nhà nghiên cứa nào tìm ra.
VII. Ý NGHĨA
Đề tài này có ý nghĩa góp phần trong việc tìm hiểu thành phần hóa học
nhằm nâng cao giá trị sử dụng lá cây trôm trong việc chữa trị một số bệnh ung
thư.
B. BÁO CÁO NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
I. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRÔM
1. Giới thiệu chung
* Nơi phân bố: Huyện Đức Linh - Tỉnh Bình Thuận.
* Tên gọi:
 Tên khoa học: Sterculia foetida Linn. (Sterculiaceae)
 Tên khác: Trôm.

* Hệ thống phân loại khoa học:
Theo tài liệu Sách tra cứu tên cây cỏ ở Việt Nam của tác giả Võ Văn Chi[3] chi
Sterculia thuộc:
− Ngành : Ngọc lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc lan : (Magnoliopsida)

-

Phân lớp : Hành (Liliidae)

- Bộ: Cẩm Quì (Malvales)

− Họ: Trôm (Sterculiaceae).

3


2. Hình ảnh mơ tả thực vật

Cây trơm

Lá trơm

Quả trơm chín và hạt trơm

Quả trơm xanh

Hoa trơm

Mủ trơm tươi

Hình 1: Hình ảnh về cây trơm (Sterculia foetida Linn.)
3. Hoạt tính sinh học lá trôm

Cao methanol của lá trôm với hàm lượng 200mg/kg và 400mg/kg trọng
lượng cơ thể vật chủ thí nghiệm thể hiện hoạt tính chống đái tháo đường và hạ
huyết áp.[6]
Cao ethanol nồng độ 95% của lá trơm có hoạt tính kháng khuẩn (Escherichia

coli, Staphylococcus aureus), kháng nấm, và khử độc tế bào.[7]
Cao hexane từ hạt trôm chứa hợp chất (2n-octylcycloprop- 1-enyl)-octanoic
acid với liều lượng 0,2mg/cm2 có hoạt tính chống muỗi vectơ và nồng độ 25
đến 65 mg / L kháng tế bào ung thư HeLa ở Ấn Độ. [22]
II. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Hóa chất
- Silicagel hạt cỡ 0,04 – 0,06 mm đối với pha thường.
- Sắc kí lớp mỏng tiến hành trên lớp mỏng tráng sẵn TLC Silica gel F254 hiệu
Merck đối với pha thường.
- Dung môi được sử dụng: metanol, etanol, etyl axetat, clorofom, hexane.


- Thuốc thử giúp hiện các vệt chất hữu cơ trên lớp mỏng: 10% H2SO4 trong
etanol.
2. Dụng cụ và thiết bị
Tủ sấy dùng sấy khô các dụng cụ bằng thủy tinh và làm khơ ngun liệu.
Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa
thủy tinh, pipet, phểu chiết, bếp điện, cân điện tử, ống mao quản, cột sắc ký …
Máy cô quay chân không.
Máy soi UV (bước sóng 366 nm và 254 nm) để soi bản mỏng.
3. Phương pháp thực hiện
- Điều chế cao etanol thô từ mẫu cây bằng phương pháp ngâm dầm.
- Điều chế cao hexane, chloroform, etyl axetat bằng phương pháp chiết lỏnglỏng.
- Cô lập các hợp chất trong cây bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng, sắc ký
cột pha thường.
- Cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết cô lập từ lá cây trôm được xác định
bằng các phương pháp phổ NMR và phổ HR-ESI-MS.
4. Tiến trình thực hiện

1HPhổ

4.1. Thu hái và xử lý mẫu
Lá trôm được thu hái tại huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận vào tháng
01 năm
NMR
2018. Lá cây tươi (30 kg), sau khi thu hái, được rửa sạch, phơi khô tự nhiên
- Phổ 13Ctrong không khí ở nhiệt độ phịng (khoảng 20oC-30oC), khơng tiếp xúc với ánh

NMR

nắng trực tiếp trong khoảng thời gian 14 ngày, thu được 12 kg lá cây khô.
4.2. Điều chế các loại cao

Cô
Từ cao hexane ( 450.5 g) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường cùng
quay
với hệ dung môi giải ly H:Ea 100%-0, 20-1, 10-1, 5-1, 1-1, 1-5, 0-100% hứng
cao
phần dịch vào bình 500 mL, cơ quay đuổi dung môi, tiến hành SKLM và chia
tổng
thành 07 phân đoạn: SFH-I (140 g), SFH-II (45 g), SFH-III (30 g), SFH-IV
(75 g), SFH-V (30 g), SFH-VI (55 g), SFH-VII (30 g).
Bảng 2.1. Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao hexane (450.5 g)

S
K
L
M


Cao

hexan

450.5 g

Hệ
dung
mơi

Tỉ lệ

Phân đoạn

H:Ea

100%:
0

SFH-I (140 g)

H:Ea

20:1

H:Ea

10:1

H:Ea

5:1

H:Ea

1:1

H:Ea

Sắc ký lớp mỏng

Có nhiều vết sát nhau, chưa
khảo sát
Có vết trịn đậm, chọn khảo
SFH-II (45 g)
sát
Có vết trịn đậm, chọn khảo
SFH-III (30 g)
sát
Có vết trịn đậm, chọn khảo
SFH-IV (75 g)
sát
Có vết trịn đậm, chọn khảo
SFH-V (30 g)
sát
SFH-VI (55 g) Kéo vệt, chưa khảo sát

1:5
0:100
H:Ea
SFH-VII (30 g) Kéo vệt, chưa khảo sát
%

4.3. Cô lập các hợp chất

Sử dụng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng các phân
đoạn của cao hexane để phân lập các hợp chất.
* Quá trình chuẩn bị sắc kí cột
Chọn cột phù hợp với cao, tiếp đó nhỏ metanol từ trên thành cột xuống
nhằm rửa sạch cột, sấy khô cột. Dùng kẹp sắt lắp cột vào giá sắt sao cho cột
thẳng đứng song song với trục giá. Chọn và pha hệ dung môi chạy cột, cân
silicagel cần dùng và sau đó lấy khoảng một lượng dung mơi đã pha hoà với
lượng silicagel đã cân vào cốc thủy tinh. Sau đó, lấy một ít bơng gịn đặt dưới
đáy cột để silicagel khơng chảy ra ngồi, cho một ít dung mơi chạy cộ vào cột
rồi rót nhẹ silicagel trong dung môi vào cột. Tiếp theo là xả cột để cố định
silicagel rồi rót thêm dung mơi vào cột để ổn định hệ.
Mẫu được cà nhuyễn với silcagel tạo thành hỗn hợp khô và cho hết vào
cột bằng phễu.Tiếp theo, rót dung mơi chạy cột vào từ từ bằng cách dùng ống
hút dung mơi nhỏ vào hoặc dùng phểu rót vào. Hoàn thành xong việc nạp mẫu.


Hình 3: Sắc ký cột.
* Qúa trình phân lập hợp chất
Các phân đoạn này được đem thử sàng lọc hoạt tính gây độc trên ba dịng
tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư gan HepG2 và ung thư cổ tử cung HeLa ở
nồng độ 100 µg/mL. Trong đó, phân đoạn SFH-III có hoạt tính tốt nhất với
phần trăm gây độc tế bào lần lượt ≈ 62%, 48% và 59% ở nồng độ 100 µg/mL
với ba dịng MCF-7, HepG2, HeLa.
Ở phân đoạn SFH-III (30 g), tiến hành SKC với hệ dung môi H:Ea
(10:1), dựa vào SKLM tách thành 5 phân đoạn từ SFH-III.1 (2.7 g), SFH-III.2
(2.8 g), SFH-III.3 (7.2 g), SFH-III.4 (3.5 g) và SFH-III.5 (4.8 g).
Phân đoạn

Bảng 1: Kết quả khảo sát phân đoạn SFH-III.3.
Hệ dung môi
Khối lượng Kết quả SKBM
chạy cột

SFH-III.1

H-Ea (20-1)

0.8 g

Nhiều vết

SFH-III.2

H-Ea (15-1)

2.8g

Nhiều vết

SFH-III.3

H-Ea (10-1)

7.2 g

3 vết tím rõ

SFH-III.4

H-Ea (5-1)

3.5 g

Nhiều vết

SFH-III.5

H-Ea(1:1)

4.8 g

Nhiều vết

Ghi chú
Khơng
khảo sát
Khơng
khảo sát
LT02
(15 mg)
LT03
(18 mg)
LT06
(12mg)
Không
khảo sát
Không
khảo sát

Ở phân đoạn SFH-III .3 (7.2 g) có 3 vết to đậm màu tím, tiến hành SKC
với hệ dung mơi H:Ea (10:1), dựa vào SKLM tách thành 4 phân đoạn từ SFHIII.3.1 (0.6 g), SFH-III.3.2 (1.5 g), SFH-III.3.3 (2.8 g), và SFH-III.3.4 (0.4 g).
Phân đoạn SFH-III .3.2 (2.8 g) có 3 vết to đậm màu tím, tách xa nhau nên
tiến hành chạy SKC silica gel nhiều lần ở phân đoạn SFH-III.3.2 với dung môi
H:Ea(10:1). Kết quả thu được 02 chất rắn màu trắng, hòa tan mẫu bằng metanol
chấm SKLM trên dung môi H:Ea (7:1), cho 1 vết với Rf = 0,45, khơng hấp thu
UV. Chất đó là LT02 (15 mg) và chấm SKLM trên dung môi H:Ea (5:1), cho 1
vết với Rf = 0,4, có hấp thu UV. Chất đó là LT03 (18 mg). Tiến hành chạy SKC
silica gel 3 lần ở phân đoạn SFH-III.3.2 với dung môi H:Ea (5:1). Kết quả thu
được 01 chất rắn màu trắng, hòa tan mẫu bằng metanol chấm SKLM trên dung
môi H:Ea(3:1), cho 1 vết với Rf = 0,48, không hấp thu UV. Chất đó là LT06 (12
mg).
Kết quả khảo sát thành phần hóa học trên phân đoạn SFH-III.3 đã cô lập
được 03 hợp chất kí hiệu LT02, LT03 và LT06. Ba hợp chất này được gửi đi đo
phổ. Phần biện luận công thức của hai hợp chất được trình bày cụ thể ở phần
tiếp theo.
III. KẾT QUẢ
1. Xác định cấu trúc LT03

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) kết hợp với DEPT cho thấy LT03
có 30 carbon, trong đó có sự hiện diện của 8 carbon methyl bậc ba cùng với 2
carbon olefin ở δC 144,5 và 121,9 đặc trưng cho 2 carbon olefin C-13, C-12 của
khung olean-12-en[26]. Ngồi ra, LT03 cịn có 1 carbon ceton ở δC 212,4 (C-1); 2
carbon oxymethin ở δC 74,0 (C-2) và 85,2 (C-3), cho thấy LT03 là một
triterpenoid khung olean-12-en mang 2 nhóm hydroxyl và 1 nhóm oxo.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm) của LT03 cho tín hiệu: 1 proton
olefin ở δH 5,21 (1H, t-like, J = 3,5 Hz, H-12); 2 proton oxymethin ở δH 4,55
(1H, dd, J = 6,0 và 10,0 Hz, H-2) và 2,97 (1H, dd, J = 2,0 và 10,0 Hz, H-3);

proton của 8 nhóm methyl bậc ba δH 0,83-1,36, khẳng định lại LT03 có khung
olean-12-en mang 2 nhóm hydroxyl[1].
Phổ HMBC của LT03 cho thấy sự tương tác giữa proton methin ở δH 2,35
(1H, dd, J = 6,0 và 11,0 Hz, H-9) và 3 proton methyl ở δH 1,36 (3H, s, H-25) với
carbon ceton ở δC 212,4 (C-1); giúp xác định nhóm oxo gắn vào khung sườn ở vị
trí C-1. Ngồi ra, oxymethin ở δH 2,97 (1H, dd, J = 2,0 và 10,0 Hz, H-3) với 2
carbon methyl ở δC 17,1 (C-24), 28,7 (C-23) và carbon oxymethin ở δC 74,0 (C2); giúp xác định 2 nhóm hydroxyl lần lượt gắn vào khung sườn ở vị trí C-2 và
C-3. Hơn nữa, phổ COSY của LT03 giúp khẳng định lại 2 vị trí nối nhóm
hydroxyl thơng qua tương quan giữa 2 proton oxymethin ở δH 4,55 (1H, dd, J =
6,0 và 10,0 Hz, H-2) và 2,97 (1H, dd, J = 2,0,5 và 10,0 Hz, H-3).
Mặt khác, phổ NOESY của LT03 cho thấy sự tương quan giữa các proton
methyl ở δH 1,36 (3H, s, H-25) và 1,10 (3H, s, H-24) có định hướng β với proton
oxymethin ở δH 4,55 (1H, dd, J = 6,0 và 10,0 Hz, H-2); trong khi, proton methyl
ở δH 1,09 (3H, s, H-23) và proton methin ở δH 0,94 (1H, dd, J = 2,5 và 11,5 Hz,
H-5) có định hướng α lại tương quan với proton oxymethin ở δH 2,97 (1H, dd, J
= 2,0 và 10,0 Hz, H-3); giúp xác nhận proton H-2, H-3 có định hướng lần lượt là
β và α, suy ra nhóm hydroxyl ở C-2 và C-3 này có định hướng α và β.
Từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC,
HMBC và NOESY; chúng tôi khẳng định LT03 là 2α,3β-dihydroxyolean-12ene-1-on, đây là hợp chất mới được đặt tên là Stercufoetin A (tra cứu cơ sở dữ
liệu bằng phần mềm Scifinder tại Australia).


Hình 1: Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của hợp chất LT03
-

Stercufoetin A (1): Phổ ACPI – MS của LT03 cho đỉnh ion phân
tử giả ở m/z: 457.42[M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức
C30H48O3: 456,29), giúp xác định CTPT của TL03 là C30H48O3.

1

H-NMR (CDCl3, 500 MHz, J in Hz): 4.55 (1H, dd, J = 6.0 and 10.0 Hz,

H-2), 3.55 (1H, d, J = 6.0 Hz, OH-2), 2.97 (1H, dd, J = 2.0 and 10.0 Hz, H-3),
2.60 (1H, d, J = 2.5 Hz, OH-3), 0.94 (1H, dd, J = 2.5 and 11.5, H-5), 1.65 (1H,
m, H-6a), 1.62 (1H, m, H-6b), 1.47 (1H, m, H-7a), 1.40 (1H, td-like, J = 4.0 and
6.0, H-7b), 2.36 (1H, dd, J = 6.0 and 11.0, H-9), 2.31 (1H, ddd, J = 5.0, 5.5 and
18.0, H-11a), 1.85 (1H, ddd, J = 2.5, 11.0 and 17.5, H-11b), 5.21 (1H, t-like, J =
3.5, H-12), 1.78 (1H, td-like, J = 9.0 and 13.5, H-15a), 0.97 (1H, m, H-15b),
2.00 (1H, td-like, J = 4.0 and 13.5, H-16a), 0.80 (1H, m, H-16b), 1.96 (1H, dd, J
= 4.0 and 12.5, H-18), 1.31 (1H, dd, J = 4.0 and 12.5, H-19a), 1.12 (1H, dd, J =
3.0 and 4.0, H-19b), 1.68 (1H, m, H-21a), 1.07 (1H, m, H-21b), 1.44 (1H, m, H22a), 1.21 (1H, td-like, J = 3.0 and 13.5, H-22b), 1.09 (3H, s, H-23), 1.10 (3H, s,
H-24), 1.36 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-26), 1.17 (3H, s, H-27), 0.83 (3H, s, H28), 0.89 (3H, s, H-29), 0.88 (3H, s, H-30).
13

C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 212.4 (C-1), 74.0 (C-2), 85.2 (C-3), 38.7

(C-4), 54.8 (C-5), 17.6 (C-6), 32.5 (C-7), 42.0 (C-8), 39.4 (C-9), 51.8 (C-10),
25.2 (C-11), 121.9 (C-12), 144.5 (C-13), 39.7 (C-14), 26.1 (C-15), 26.9 (C-16),
32.6 (C-17), 47.4 (C-18), 34.8 (C-19), 31.1 (C-20), 46.5 (C-21), 37.1 (C-22),
28.7 (C-23), 17.1 (C-24), 15.3 (C-25), 17.6 (C-26), 25.9 (C-27), 28.4 (C-28),
33.4 (C-29), 23.7 (C-30).
2. Xác định cấu trúc LT06

Hợp chất LT 06 (15 mg) thu được từ phân đoạn SFH-III.3, chất bột vơ
định hình màu trắng. Sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi giải ly H: Ea (5:1),
hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bản mỏng ở nhiệt độ cao cho
một vết màu tím có Rf = 0.45.

-

Phổ 1H-NMR (CDCl3 - d1, 500 MHz) (phụ lục 3.6).
Phổ 13C-NMR (CDCl3 - d1, 125 MHz) (phụ lục 3.7).
Phổ DEPT (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.8).


-

Phổ HSQC (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.9).
Phổ HMBC (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.10).
BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 - d1, δ ppm) của hợp chất LT06 cho các tín
hiệu cộng hưởng ứng của 1 proton carbinol >CH-OH [δH 3,23 (1H, dd, J = 4,0
và 11,0 Hz, H-3) ], 1 proton nối đôi ba lần thế =CH- [δH 5,28 (1H, t, J = 3,5 Hz,
H-12)], ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm methyl -CH 3 [δH 1,16
(3H, s, H-27); 0,98 (3H, s, H-23); 0,91 (3H, s, H-29); 0,94 (3H, s, H-30); 0,93
(3H, s, H-25); 0,76 (3H, s, H-26) và 0,77 (3H, s, H-24)], 3 nhóm methine và 10
nhóm methylene -CH2- trong vùng δH 0,70 - 3,00.
Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT của hợp chất LT06 cho các tín
hiệu cộng hưởng ứng với 30 carbon bao gồm 1 carbon carbonyl [δC 181.7 (C28) ], 1 carbon carbinol >CH-OH ở vùng trường thấp [δC 79,0 (C-3)], 1 carbon
olefin bậc ba =CH- [δC 122,6 (C-12)], 1 carbon olefin bậc bốn =C< [δC 143,5
(C-13)], 7 carbon methyl -CH3 [δC 33,0 (C-29); 28,1 (C-23); 25,9 (C-27); 23,5
(C-30); 17,1 (C-26); 15,4 (C-24) và 15,3 (C-25) ], 10 carbon methylene -CH2[δC 45,9 (C-19); 38,7 (C-1); 32,6 (C-21); 33,8 (C-7); 32,4 (C-22); 27,7 (C-15);
27,2 (C-2); 23,4 (C-11); 23,0 (C-16) và 18,3 (C-6)], 3 carbon methine >CH- [δC
55,2 (C-5); 47,6 (C-9) và 41,6 (C-18)], và 6 carbon bậc bốn [δC 46,5 (C-17);
41,1 (C-14); 39,3 (C-8); 38,7 (C-4); 37,1 (C-10) và 30,6 (C-20)].
Từ các dữ liệu phổ nghiệm, dự đoán hợp chất LT06 là một triterpen 5 vịng,
có khung căn bản là oleanane-12-en-28-oic acid mang 1 liên kết đơi, 1 nhóm –
OH và 1 nhóm -COOH.

Để biết thêm thơng tin chính xác từng liên kết trong phân tử phổ HSQC và
HMBC được ghi nhận.
Phổ HMBC cho thấy hai nhóm methyl ở H-29 và H-30 cho tương quan với
nhau [H-29 ở δH 0,91 với C-30 và H-30 ở δH 0,94 với C-29], đồng thời cùng
tương quan với 1 carbon bậc bốn ở δC 30,6 (C-20) và 2 carbon methylene ở δC


45,9 (C-19) và 32,6 (C-21). Như vậy 2 nhóm methyl này cùng nối vào carbon
bậc 4 là C-20
Hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methyl H-26 ở [δH 0,76 và H-27 ở
δH 1,16] cùng cho tương quan với 2 carbon bậc bốn ở δC 41,1 (C-14) và 39,3 (C8). Ngồi ra, proton H-26 có thêm tương quan với 1 carbon methine ở δC 47,6
(C-9) và 1 carbon methylene ở δC 33,8 (C-7); proton H-27 cho tương quan với 1
carbon olefin bậc bốn ở δC 143,5 và 1 carbon methylene ở δC 27,7 (C-15). Đồng
thời proton olefin ở δH 5,28 cũng cho tương quan với carbon bậc bốn C-14,
carbon methine C-9 và 1 carbon methine khác ở δC 41,6 (C-18) cho thấy nối đơi
phải ở vị trí C-12 và C-13 của hợp chất oleanane-12-en.
Proton methyl H-25 ở δH 0,93 cho tương quan với 1 carbon bậc bốn ở δC 37,1
(C-10), 2 carbon methine ở δC 47,6 (C-9) và 55,2 (C-5) và 1 carbon methylene
ở δC 38,7 (C-1) xác nhận nhóm methyl này nối vào carbon bậc 4 là C-10.
Hai nhóm methyl H-23 và H-24 cho tương quan với nhau [H-23 ở δH 0,98
với C-24 ở δC 15,4 và H-24 ở δH 0,77 với C-23 ở δC 28,1 ], đồng thời cho tương
quan với ba tín hiệu carbon gồm carbon bậc bốn ở δC 38,7 (C-4), carbon methine
ở δC 55,2 (C-5) và carbon carbinol ở δC 79,0 khẳng định nhóm -OH gắn vào
carbon C-3 của khung. Chi tiết tương tác xa HMBC trình bày cụ thể trong hình
3.2 và bảng 3.2
Từ các biện luận trên kết hợp tài liệu tham khảo [25] cho thấy có sự tương
đồng với hợp chất acid oleanolic. Vậy cấu trúc của hợp chất LT06 xác định là
acid oleanolic.

Hình 4: Các tương tác HMBC chính và cấu trúc của TL06.
Bảng 2: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của TL06 và so sánh với tài liệu
Acid oleanolic [2]

LT06 (chloroform-d1)
TT

δH ppm (J, Hz)

δC ppm

HMBC

500 MHz

125 MHz
38,7
27,2

(1H →13C)

100 MHz
38,6
26,7

79,0

23, 24

78,5

1
2
3

3,23 (1H, dd, J = 4,0
và 11,0 Hz,

4
5
6
7
8
9
10
11
12

38,7
55,2
18,3
33,8
39,3
47,6
37,1
23,4
5,28 (1H, t, J = 3,5
Hz)

13

14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

(chloroform-d1)
δC ppm

2,84 (1H, dd, J = 4,0
và 13,0 Hz,

0,98 (s)
0,77 (s)
0,93 (s)
0,76 (s)
1,16 (s)

122,6

39,2

55,5
18,3
32,6
39,6
48,1
37,0
22,8
9, 11, 14, 18

122,4

143,5
41,1
27,7
23,0
46,5

144,1
42,0
27,7
22,7
46,1

41,6

41,5

45,9
30,6
32,6

32,4
28,1
15.4
15,3
17,1
25.9

46,7
30,4
33,7
32,3
28,8
15,1
14,7
16,5
25,2

3, 4, 5, 24
3, 4, 5, 23
1, 5, 9, 10
7, 8, 9, 14
8, 13, 14, 15


28
29
30

0,91 (s)
0,94 (s)

181,7
33,0
23,5

19, 20, 21, 30
19, 20, 21, 29

180,4
32,8
23,3


3. Xác định cấu trúc LT02


Hợp chất LT02 thu được dưới dạng tinh thể dạng vơ định hình màu
trắng. Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi giải ly H:Ea(7:1), hiện màu bằng
dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bản mỏng ở nhiệt độ cao cho một vết màu
tím có Rf = 0.42
Phổ 1H-NMR (CDCl3 - d1, 500 MHz) (phụ lục 3.1).
Phổ 13C-NMR (CDCl3 - d1, 125 MHz) (phụ lục 3.2).
Phổ DEPT (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.3).
Phổ HSQC (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.4).
Phổ HMBC (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.5).
BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 - d1, δ ppm) của hợp chất LT06 cho các
tín hiệu cộng hưởng ứng của 1 proton carbinol >CH-OH [δH 3,23 (1H, dd, J =
4,0 và 11,0 Hz, H-3) ], 1 proton nối đôi ba lần thế =CH- [δH 5,28 (1H, t, J =
3,5 Hz, H-12)], ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm methyl -CH 3

[δH 1,16 (3H, s, H-27); 0,98 (3H, s, H-23); 0,91 (3H, s, H-29); 0,94 (3H, s, H30); 0,93 (3H, s, H-25); 0,76 (3H, s, H-26) và 0,77 (3H, s, H-24)], 3 nhóm
methine và 10 nhóm methylene -CH2- trong vùng δH 0,70 - 3,00.
Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT của hợp chất LT06 cho các
tín hiệu cộng hưởng ứng với 30 carbon bao gồm 1 carbon carbonyl [δC 181.7
(C-28) ], 1 carbon carbinol >CH-OH ở vùng trường thấp [δC 79,0 (C-3)], 1
carbon olefin bậc ba =CH- [δC 122,6 (C-12)], 1 carbon olefin bậc bốn =C< [δC
143,5 (C-13)], 7 carbon methyl -CH3 [δC 33,0 (C-29); 28,1 (C-23); 25,9 (C27); 23,5 (C-30); 17,1 (C-26); 15,4 (C-24) và 15,3 (C-25) ], 10 carbon
methylene -CH2- [δC 45,9 (C-19); 38,7 (C-1); 32,6 (C-21); 33,8 (C-7); 32,4
(C-22); 27,7 (C-15); 27,2 (C-2); 23,4 (C-11); 23,0 (C-16) và 18,3 (C-6)], 3
carbon methine >CH- [δC 55,2 (C-5); 47,6 (C-9) và 41,6 (C-18)], và 6 carbon
bậc bốn [δC 46,5 (C-17); 41,1 (C-14); 39,3 (C-8); 38,7 (C-4); 37,1 (C-10) và
30,6 (C-20)].
Từ các dữ liệu phổ nghiệm, dự đoán hợp chất LT06 là một triterpen 5
vịng, có khung căn bản là oleanane-12-en-28-oic acid mang 1 liên kết đơi, 1
nhóm –OH và 1 nhóm -COOH.
Để biết thêm thơng tin chính xác từng liên kết trong phân tử phổ HSQC
và HMBC được ghi nhận.
Phổ HMBC cho thấy hai nhóm methyl ở H-29 và H-30 cho tương quan
với nhau [H-29 ở δH 0,91 với C-30 và H-30 ở δH 0,94 với C-29], đồng thời
cùng tương quan với 1 carbon bậc bốn ở δC 30,6 (C-20) và 2 carbon
methylene ở δC 45,9 (C-19) và 32,6 (C-21). Như vậy 2 nhóm methyl này cùng
nối vào carbon bậc 4 là C-20
Hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methyl H-26 ở [δH 0,76 và H27 ở δH 1,16] cùng cho tương quan với 2 carbon bậc bốn ở δC 41,1 (C-14) và
39,3 (C-8). Ngoài ra, proton H-26 có thêm tương quan với 1 carbon methine ở
δC 47,6 (C-9) và 1 carbon methylene ở δC 33,8 (C-7); proton H-27 cho tương
quan với 1 carbon olefin bậc bốn ở δC 143,5 và 1 carbon methylene ở δC 27,7
(C-15). Đồng thời proton olefin ở δH 5,28 cũng cho tương quan với carbon bậc
bốn C-14, carbon methine C-9 và 1 carbon methine khác ở δC 41,6 (C-18) cho
thấy nối đơi phải ở vị trí C-12 và C-13 của hợp chất oleanane-12-en.
Proton methyl H-25 ở δH 0,93 cho tương quan với 1 carbon bậc bốn ở δC

37,1 (C-10), 2 carbon methine ở δC 47,6 (C-9) và 55,2 (C-5) và 1 carbon
methylene ở δC 38,7 (C-1) xác nhận nhóm methyl này nối vào carbon bậc 4 là


Bảng 3: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của TL02 và so sánh với tài liệu
Vị
trí

DEFT

1

-CH2-

2

-CH2-

3

-CH<

4

>C<

5

-CH<

6

LT02
(chloroform-d1)
δ C ppm
δH ppm (J, Hz)
125
500 MHz
MHz
37,7

HMBC
(H → C)

Taraxerol [3]
(chloroform-d1)
δH ppm (J,
δ C ppm
Hz)
100 MHz
400 MHz
37,8

27,1
3,20 (d, 10,5 Hz)

27,2
3,19 (dd, 4,4
và 11,2 Hz)

79,0

79,1

38,7

39,0

55,5

55,6

-CH2-

18,8

18,8

7

-CH2-

41,3

41,4

8

>C<

38.9

38,8

9

-CH<

49,3

48,8

10

>C<

37,5

37,6

11

-CH2-

17,5

17,5

12

-CH2-

37,7

37,8

13

>C<

35,7

35,8

14

=C<

158,1

158,1

15

=CH-

16

-CH2-

36,6

36,7

17

>C<

38,0

38,0

Hz)

5,53 (dd, 3,0 và
8,0 Hz)

0,96 (m)

116,8

48,7

C-8; C-13; C16; C-17

5,53 (dd, 3,6
và 7,6 Hz)

C-12; C-13;
C-16; C-17;

C-19; C-20;
C-22; C-27;
C-28

116,9

18

-CH<

19

-CH2-

35,1

35,2

20

>C<

28,8

28,8

21

-CH2-

33,7

33,7

22

-CH2-

33,1

33,1

23

-CH3

0,97 (s)

28,0

24

-CH3

0,80 (s)

15,4

25

-CH3

0,93 (s)

15,4

26

-CH3

0,82 (s)

29,8

27

-CH3

1,09 (s)

25,9

C-3; C-4; C-5;
C-24
C-3; C-4; C-5;
C-23
C-1; C-5; C-9;
C-10
C-7; C-8; C-9;
C-14

C-12; C-13;
C-14; C-18

49,3

0,98 (s)

28,0

0,80 (s)

15,5

0,93 (s)

15,4

0,82 (s)

29,9

1,09 (s)

25,9


28

-CH3

0,91 (s)

29,9

29

-CH3

0,95 (s)

33,3

30

-CH3

0,91 (s)

21,3

C-16; C-17;
C-18; C-22
C-19; C-20;
C-21; C-30
C-19; C-20;
C-21; C-29

0,91 (s)

29,9

0,95 (s)

33,4

0,91 ( s)

21,3

IV. DƯỢC TÍNH CỦA LT06 VÀ LT02
Sau khi tiến hành cô lập, tinh chế các hợp chất tinh khiết được thử hoạt tính gây
độc trên các dịng tế bào ung thư tại Trường Đại học Khoa học – Tự nhiên TP
Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy: Hợp chất TL06 có hoạt tính gây độc rất tốt với
IC50 = 67,32 ± 1,69µg/mL và 53,86 ± 2,36µg/mL, lần lượt trên cả hai dòng tế
bào ung thư vú MCF-7 và ung thư gan Hep G2. Hợp chất TL02 có hoạt tính
gây độc rất tốt với IC50 = 59,32 ± 1,69µg/mL trên dịng kháng tế bào Hela.Giá
trị IC50 của mẫu SFH02 trên các dòng tế bào ung thư
Dòng tế
Lần 1
64,78

Giá trị IC50 (µg/mL)
Lần 2 Lần 3
TB ± ĐLC
69,13 68,05
67,32 ± 1,69

Hep G2

50,75

56,41

53,41

53,52 ± 2,36

Hela

58,78

54,85

56,48

56,70 ± 3,36

bào
MCF-7

V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận

Lá trôm được thu hái ở huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận do Viện Sinh
học Nhiệt đới định danh, mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phịng Cơng nghệ Các
chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng Nghệ Hóa Học đã phân lập được 03 hợp
chất là LT02, LT03 và TL06 từ phân đoạn có hoạt tính gây độc tế bào tốt nhất
của cao hexane bằng phương pháp sắc ký cột với các dung mơi có độ phân cực
khác nhau.
Dựa vào các phương pháp phổ nghiệm: HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR,

HSQC, HMBC và so sánh với các tài liệu tham khảo, các hợp chất được xác
định là:
-LT03 là 2α,3β-dihydroxyolean-12-ene-1-on (Stercufoetin A)


- Hợp chất LT06 là: 3-β-hydroxy-olean-12-en-28-oicaci (oleanolic acid).
29

19
12
25
1

10
3

24

26

H
5

4

H

8

20

21

18

14 H

9

2

HO

13

11

30

22
28

17
16

COOH

15

7 27

6

23

Hợp chất LT02 là: taraxerol.

Kết quả thử hoạt tính cho thấy TL06 có dược tính độc tế bào ung thư với
IC50 = 68,32 ± 1,69µg/mL và 54,68 ± 2,36µg/mL, lần lượt trên hai dòng tế bào
ung thư vú MCF-7 và ung thư gan HepG2. Cịn TL02 có dược tính kháng tế bào
ung thư IC50 = 59,32 ± 1,69µg/mL trên dịng tế bào Hela.
Đây là lần đầu tiên trên thế giới đã cơ lập được hai hợp chất mới
trong lồi là oleanolic acid, taraxerol và thử hoạt tính gây độc tế bào ung
thư vú MCF-7 và ung thư gan Hep G2 và kháng tế bào ung thư trên dòng tế
bào Hela từ lá trơm của cao hexane. Kết quả, thử hoạt tính gây độc tế bào
của hợp chất oleanoic acid rất tốt sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu hoạt
tính sinh học sâu hơn nhằm nâng cao giá trị của loài dược liệu này.
Đặc biệt hơn đề tài này cịn tìm ra một hợp chất mới trong lá trôm
được đặt tên là stercufoetin A (tra cứu cơ sở dữ liệu bằng phần mềm
Scifinder tại Australia). Vì vậy, nội hàm của đề tài rất có ý nghĩa về mặt
khoa học lẫn ý nghĩa thực tiễn.
2. Kiến nghị

Lá cây trơm nghiên cứu cịn ít nhưng tiềm năng chứa các hợp chất thứ cấp
có hoạt tính sinh học có thể ứng dụng vào điều trị bệnh là rất cao vì thế nên phát
triển thêm nhiều nghiên cứu nữa trên loài này.


Cần tiếp tục phân lập các phân đoạn khác của cao hexane và phần dịch
nước.

Thực hiệp tiếp việc nghiên cứu với các bộ phân khác của cây như: rễ,
thân, vỏ…

VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO
VI.1. Tài liệu trong nước
[1]. Võ Văn Chi, từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.
1083, 2002.
[2]. Võ Văn Chi, từ điển thực vật thông dụng, tập 2. Nhà xuất bản khoa học kĩ
thuật, tr. 2340, 2004.
[3]. Võ Văn Chi, sách tra cứu cây cỏ ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo Dục
TPHCM, tr.31-36, 2007.
[4]. Phạm Hoàng Hộ, cây cỏ Việt Nam, quyển 1, NXB Trẻ, mục 2022 - 2047,
tr.502-506, 2003.
VI.2 Tài liệu nước ngoài
[5]. Prajapati P.A, preliminary evaluation of sterculia foetida gum for
ophthalmic drug delivery system. Journal of Pharmaceutical Research, 3(6),
p.1254-1259, 2010.
[6]. Rajasekharreddy P, biofabrication of Ag nanoparticles using Sterculia
foetida Linn seed extract and their toxic potential against mosquito vectors and
HeLa cancer cells. Materials Science and Engineering Chemistry, (39), p.203212, 2014.


[7]. Vital P.G, antimcrobial activity, cytotoxicity and phytochemical screening of
Ficus septica Burm and Sterculia foetida Linn leaf extracts. Journal of Medical
Plants Research, 4(1), p.58-63, 2010.
[8]. Kale S.S, analysis of fixed oil from Sterculia foetida Linn. International
Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2(11), p.2908-2914,2009.
[9]. Xia P.F, two flavonoid glycosides and a phenylpropanoid glucose ester from
the leaves of Sterculia foetida Linn. Journal of Asian Natural Products
Research, 11(8), p.766-771, 2009.

[10]. Hussain S.S, preclinical evaluation of anti-diabetic and anti-hyperlipidemic
activity of methanoic extracts of Sterculia foetida Linn leaves by using Wistar
albino rats, Indian Journal of Research Pharmaceutical Biotechnol, 2(6),
p.1430-1438, 2014.
[11]. Anjaneyulu A.S.R, two rare tetramethyl ethers of quercetin from Sterculia
foetida Linn. Indian Journal of Chemiscal Section B, 20(1), p.87-88, 1981.
[12]. Dubey H, Tiwari JS, flavonoids and other constituents of Sterculia genus.
Journal of Indian Chemical Soc, (68), p.426-427, 1991.
[13]. Moshera M. E, phytochemistry, biological activities and economical uses
of the genus Sterculia and the related general: A review. Asian Pacific Journal
of Tropical Disease, (16), p.61075-61077, 2016.
[14]. Amani A, sterculia and brachychiton: a comprehensive overview on their
ethnopharmacology, biological activities, phytochemistry and the role of their
gummy exudates in drug delivery. Journal of Pharmacy and Pharmacology,
p.450-474, 2018.
[15]. Shamsundar S.G, preliminary pharmacognostical and phytochemical
investigation on Sterculia foetida Linn seeds. Africa Journal of Biotechnol,
9(13), p.1787-1789, 2010.
[16]. Ru-Feng Wang, alkaloids from the seeds of
phytochemistry, 63, p.475-478, 2003.

sterculia lychnophora.


[17]. Costa D.A, chemical constituents, total phenolics and antioxidant activity
of Sterculia striata St. HiLinn et Naudin. Acta Amazonica, 40(1), p.207-212,
2010.
[18]. Hossain M.K, anti-inflammatory and antidiabetic activity of ethanolic
extracts of sterculia villosa barks on Albino Wistar rats. Journal of Applied
Pharmaceutical Science, 02 (08), p.96-100, 2012.

[19]. Ru-Feng Wang, two cerebrosides isolated from the seeds of Sterculia
lychnophora and their neuroprotective effect, Molecules, 18, p.1181-1187, 2013.
[20]. Akhtari Khatoon, studies on in vitro evalution of antibacterial and
antioxidant activities of Sterculia foetida Linn bark. International Journal of
Pharmaceutical Sciences and Research, 7(7), p.2990-2995, 2016.
[21]. Rodrigo M.F, chemical constituents of sterculia striata. Africa Journal of
Agricultural Research, 10(9), p.965-969, 2015.
[22]. Pathipati Usha Rani, Pala Rajasekharreddy, insecticidal activity of (2noctylcycloprop- 1-enyl)-octanoic (I) against three Coleopteran stored product
insects from Sterculia foetida Linn. Journal of Pest Science, 83, p.273-279,
2010.
[23] Ran Xu, Gia C. Fazio, Seiichi P.T. Matsuda (2004), “On the origins of
triterpenoid skeletal diversity”, Phytochemistry, 65, pp. 261–291.
[24] Jae Hyeok Lee, Ki Taek Lee, Jae Heon Yang, Nam In Baek, Dae Keun Kim
(2004), “Acetylcholinesterase inhibitors from the twigs of Vaccinium oldhami
Miquel”, Arch. Pharm. Res., 27 (1), pp. 53-56
[25] Zuhal Guvenalp, Hilal Ozbek, Ayse Kuruuzumuz, Cavit Kazaz, L. Omur
Demirezer (2009), “Secondary metabolites from Nepeta heliotropifolia”, Turk.
J. Chem., 33, pp. 667-675
[26] Werner Seebacher, Nebojsa Simic, Robert Weis, Robert Saf, Olaf Kunert
(2003), “Complete assignments of 1H and 13CNMR resonances of oleanolic acid,
18α-oleanolic acid, ursolic acid and their 11-oxo derivatives”, Magn. Reson.
Chem., 41, 636-638.


VII. PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ
Tên phụ lục

Trang

Phụ lục 1.1: Phổ ACPI-MS của LT03

24

Phụ lục 1.2: Phổ 1H-NMR của LT03
Phụ lục 1.3: Phổ 13C-NMR của LT03

25
26

Phụ lục 1.4: Phổ DEPT của LT03

27

Phụ lục 1.5: Phổ HSQC của LT03

28

Phụ lục 1.6: Phổ HMBC của LT03

29

Phụ lục 1.7: Phổ COSYGP của LT03
Phụ lục 1.8: phổ NOESY của LT03

30
31

Phụ lục 2.1: phổ HR-ESI-MS của LT06

32

Phụ lục 2.2: phổ 1H-NMR của LT06

33

Phụ lục 2.3: phổ 13C-NMR của LT06

34

Phụ lục 2.4: phổ DEPT của LT06

35

Phụ lục 2.5: Phổ HSQC của LT06

36

Phụ lục 2.6: phổ HMBC của LT06

37


Phụ lục 3.1: phổ HR-ESI-MS của LT02

38

Phụ lục 3.2: phổ 1H-NMR của LT02

39

Phụ lục 3.3: phổ 13C-NMR của LT02

40

Phụ lục 3.4: phổ DEPT của LT02

41

Phụ lục 3.5: Phổ HSQC của LT02

42

Phụ lục 3.6: Phổ HMBC của LT02

43

Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào của TL06 trên các dòng tế

44

Hình ảnh về nhóm thực hiện

46

Phụ lục 1.1: phổ ACPI-MS của LT03


Phụ lục 1.2: phổ 1H-NMR của LT03