(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn kappaphycus alvarezii ở vùng biển nha trang, khánh hòa, định hướng sử dụng trong y dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…………………………………

NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG
SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG,
KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…………………………………

NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG
SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG,
KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Lê Mai Hương
2. PGS. TS. Phan Văn Kiệm

Hà Nội - 2022


i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của
GS.TS. Lê Mai Hương và PGS.TS. Phan Văn Kiệm. Các số liệu và kết quả thu
được trong luận án là hồn tồn trung thực và chưa được cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.

Tác giả luận án


ii
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên Em xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất của
mình đến GS.TS. Lê Mai Hương Viện hóa học các hợp chất Thiên nhiên và PGS.TS.
Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển- những người Thầy đã ln tận tình giúp đỡ,
hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu trong suốt q trình tơi thực hiện và
hồn thành luận án.
Luận án này được hồn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài
NĐT11.GER/16.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện hóa học các Hợp chất Thiên
nhiên, cùng các đồng nghiệp và các anh chị phòng sinh học thực nghiệm đã luôn ủng
hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học và
Công nghệ cùng các Thầy, Cô và các anh, chị chuyên viên ở Học Viện đã tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian học tập và
nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô ở Viện Công nghệ sinh
học đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để em hoàn thành các học phần và các
chuyên đề trong chương trình đào tạo.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm,
hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian qua để em có thể hồn thành tốt nhiệm vụ
học tập và cơng tác chuyên môn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Nghiên cứu sinh


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

1.1. Tổng quan về rong biển trên thế giới................................................................ 4
1.2. Tình hình rong biển ở Việt nam ....................................................................... 5
1.3 Giới thiệu về Rong Sụn ....................................................................................... 6
2.1. Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học ......................... 8
2.2. Vi sinh vật cộng sinh với rong ............................................................................. 10
2.3. Khoa học metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV liên kết ................... 13
2.4. Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển ...............................................18
2.5. Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển ........................... 22
2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh trên rong .................................22
2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh trên rong ....................27
2.6. Tiềm năng và triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong .............................. 32
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................35
2. 1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu ................................................................ 35
2.1.1 Thu thập mẫu, các chủng vi sinh vật kiểm định và các dịng tế bào ............35
2.1.2. Mơi trường nghiên cứu. .................................................................................35
2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .....................................................................36
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 37
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ...........................................................................37
2.2.2. Phân lập vi khuẩn và nấm liên kết với rong biển .........................................37
2.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn và vi nấm tiêu biểu ......................................38
2.2.3.1 Định danh các chủng vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S rARN ................. 38
2.2.3.2 Định danh các chủng nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS/28S rDNA ... 39
2.2.4. Phân tích sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm ..............................................40
2.2.4.1. Tách chiết DNA tổng số ......................................................................... 40
2.2.4.2. Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể vi khuẩn ...................... 40
2.2.4.3. Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể Nấm ............................ 41
2.2.5. Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi khuẩn và nấm phân lập ....42
2.2.6. Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ các chủng lựa chọn ...........43

iv
2.2.6.1 Thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng .... 43
2.2.6.2. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 45
2.2.6.3. Hoạt tính chống oxy hố........................................................................ 47
2.2.7. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh của chủng Aspergillus micronesiensis .....................................................48
2.2.7.1. Khảo sát động học của thời gian lên men ............................................. 48
2.2.7.2 Khảo sát động học của nồng độ muối .................................................... 49
2.2.7.3 Khảo sát động học của pH môi trường .................................................. 49
2.2.8. Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình lên men................................50
2.2.9. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ......................51
2.2.9.1 Phương pháp phân lập các hợp chất. ..................................................... 51
2.2.9.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .......................... 52
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................54
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm ......................................................... 54
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn .........................................................................54
3.1.2 Phân lập các chủng vi nấm.............................................................................55
3.2. Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV của các chủng phân lập .................... 56
3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các chủng vi khuẩn .......................................56
3.2.2. Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi nấm ....................................58
3.2.3. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn và vi nấm tuyển chọn .................61
3.2.3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn .......................................... 61
3.2.3.2. Hình thái của chủng vi nấm lựa chọn. .................................................. 64
3.2.4. Phân loại các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn dựa trên kỹ thuật sinh
học phân tử ........................................................................................................65
3.2.5. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc của quần thể vi sinh vật trên rong sụn
Kappaphycus alvarezii .......................................................................................68
3.2.5.1. Quần thể vi khuẩn .................................................................................. 68
3.2.5.2. Quần thể nấm......................................................................................... 72
3.2.6. Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thơ của các chủng ......................................75

3.2.6.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các cặn chiết ethylacetate ....................... 75
3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa của của các cặn chiết ethylacetate ................ 80
3.2.6.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết ethylaxetat........... 81
3.2.7. Nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ của chủng
vi nấm Aspergillus micronesiensis....................................................................84
3.2.7.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men........................................................... 85
3.2.7.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối................................................................. 86


v
3.2.7.3. Ảnh hưởng của pH môi trường .............................................................. 87
3.2.8. Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa q trình lên men................................88
3.2.8.1 Phần thực nghiệm: .................................................................................. 88
3.2.8.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm.................................................. 88
3.2.8.3 Xây dựng mơ hình kế hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình .............. 89
3.2.8.4 Tối ưu hóa các thơng số cơng nghệ q trình ........................................ 92
3.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng nấm
Aspergillus micronesiensis .................................................................................. 94
3.3.1 Phân tách các hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis .....................94
3.3.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân tách được từ chủng
Aspergillus micronesiensis VPN1.11 ................................................................96
3.3.2.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) ................................. 96
3.3.2.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) ................................. 96
3.3.2.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) ................................. 96
Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone).................. 97
epicoccolides B ................................................................................................... 97
epicoccolide A..................................................................................................... 97
3.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ chủng Aspergillus
micronesiensis ...................................................................................................... 98
3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) ........................................98

3.4.2. Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) .....................................104
3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới). .....................................110
3.4.4. Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde ................................................117
3.4.5. Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien3β-ol) ................................................................................................................118
3.4.6. Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II ..........................................122
3.4.7. Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran .......124
3.4.9.

Hợp chất AM7H: epicoccolides B ............................................................127

3.4.10. Hợp chất AM8D: epicoccolide A ...............................................................129
3.5.1. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các hợp chất. .............132
3.5.2. Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất ............................136
3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập ...................................138
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................141
KẾT LUẬN ............................................................................................................141
KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................143
CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. .............144


vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng anh

VSVKĐ
RYE

Diễn giải

Vi sinh vật kiểm định

Rice yeast extract medium

Môi trường gạo và dịch
chiết nấm men

ADN

Acid deoxyribonucleic

Axit deoxyribonucleic

ITS

Internal transcribed spacer

Vùng được phiên mã nội bộ

ATCC

American Type Culture

Bảo tàng giống chuẩn Hoa

Collection

Kỳ

CFU

MIC

Colony forming units
Minimum inhibitory
concentration

Đơn vị hình thành khuẩn
lạc
Nồng độ ức chế tối thiểu

rDNA

Ribosomal DNA

AND ribosom

CC

Chromatography column

Sắc ký cột thường

COSY

Correlation spectroscopy

Phổ tương tác hai chiều
đồng hạt nhân

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

13

13C-Nuclear magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

resonance spectroscopy

carbon 13

C-NRM

Hep-G2

Human hepatocellular
carcinoma

Ung thư gan

LU-1

Human lung adenocarcinoma

Ung thư biểu mô phổi

Vero

Vero cell

Tế bào biểu mô thận khỉ

MEME

Minineal essential medium with
Eagle’s salts

Môi trường nuôi cấy tế bào

MCF-7

Human breast carcinoma cell

Tế bào ung thư vú ở người

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bò

DMEM

Dullbecco’s modified
Minimum Essential Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

vii
1

H-NRM

HPLC

1H- Nuclear magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

resonance spectroscopy

proton

High performance liquid
chromatography

HSQC

Sắc ký lỏng cao áp

Heteronuclear single quantum

Phổ tương tác hai chiều dị

coherence

hạt nhân

MeOH

Methanol

DMSO

Dimethylsulfoxide

EtOAc

Ethylacetate

CS%

Cell survival

Phần trăm sống sót

IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50%

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

DEPT

Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer

Phổ DEPT

Spectroscopy
HMBC
ESI-MS
OTU

Heteronuclear multiple bond

Phổ tương tác đa liên kết

correlation

hai chiều dị nhân

Electron spray ionzation mass

Phổ khối lượng phun mù

spectroscopy

điện tử

Operational taxonomic units

Đơn vị phân loại loài

Shannon_H’ Diversity index

Chỉ số đa dạng loài

Chao-1

Độ phong phú của loài

Species richness


MỤC LỤC BẢNG
Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11]........................................................8
Bảng 3. 1. Đường kính vịng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa
chọn ...........................................................................................................................61
Bảng 3. 2.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn
lựa chọn .....................................................................................................................62
Bảng 3. 3. Đặc điểm hình thái hai chủng nấm lựa chọn ...........................................64
Bảng 3. 4. Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thơng qua phân tích
metagenomic. ............................................................................................................69
Bảng 3. 5. Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thơng qua phân tích
metagenomic. ............................................................................................................72
Bảng 3. 6. Hoạt tính đối kháng VSV của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi
khuẩn và vi nấm ........................................................................................................79
Bảng 3. 7. Hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi
khuẩn và vi nấm lựa chọn .........................................................................................80
Bảng 3. 8. Hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn

và vi nấm lựa chọn ....................................................................................................82
Bảng 3. 9. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm........................................................90
Bảng 3. 10. Ma trận kế hoạch thực nghiệm ..............................................................90
Bảng 3. 11. Bảng kết quả phân tích phương sai của mơ hình ...................................91
Bảng 3. 12. Phương trình hàm hồi quy .....................................................................92
Bảng 3. 13. Giá trị tối ưu của các yếu tố cơng nghệ .................................................93
Bảng 3. 14. Giá trị dự đốn và giá trị thực nghiệm của hàm mục tiêu tại điều kiện
tối ưu .........................................................................................................................93
Bảng 3. 15. Kết quả tối ưu hóa q trình sử dụng phần mềm design expert 7.0 ......93
Bảng 3. 16. Thông số vật lý và dữ liệu của 7 hợp chất từ chủng nấm Aspergillus
micronesiensis ...........................................................................................................97
Bảng 3. 17. Số liệu phổ NMR của AM8A1 và hợp chất tham khảo ......................100
Bảng 3. 18. Số liệu phổ NMR của AM8B1 và hợp chất tham khảo .......................105
Bảng 3. 19. Số liệu phổ NMR của AM8B2 và hợp chất tham khảo.......................111
Bảng 3. 20. Số liệu phổ NMR của AM3A1 ............................................................118
Bảng 3. 21. Số liệu phổ NMR của AM3D và hợp chất tham khảo ........................121
Bảng 3. 22. Số liệu phổ NMR của AM4F1 và hợp chất tham khảo .......................123
Bảng 3. 23. Số liệu phổ NMR của AM6E1 và hợp chất tham khảo.......................125
Bảng 3. 24. Số liệu phổ NMR của AM6E2 và hợp chất tham khảo.......................126
Bảng 3. 25. Số liệu phổ NMR của AM7H và hợp chất tham khảo ........................129
Bảng 3. 26. Số liệu phổ NMR của AM8D và hợp chất tham khảo ........................131
Bảng 3. 27. Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ
chủng Aspergillus micronesiensis ...........................................................................135
Bảng 3. 28. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ
chủng Aspergillus micronesiensis.............................................................................137
Bảng 3. 29. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập chủng Aspergillus
micronesiensis .........................................................................................................138
Bảng 3. 30. Kết quả giá trị IC50 của một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào .139

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1. 1: Hình ảnh hai lồi rong sụn chính ở nước ta .......................................................... 7
Hình 1. 2: Mối tương tác giữa vi khuẩn và rong biển nói riêng và vi sinh vật cộng sinh với
rong biển nói chung [35]. ..................................................................................................... 11
Hình 1. 3: Sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [41] .............................................. 20
Hình 1. 4: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn trên bề mặt rong [65]..... 23
Hình 1. 5: Tỷ lệ các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm liên kết với các loại rong
khác nhau [89] ..................................................................................................................... 28
Hình 1. 6: Một vài hợp chất tiêu biểu có hoạt tính sinh học phân lập từ chủng nấm
Aspergillus cộng sinh với rong[96, 97]................................................................................ 30
Hình 3. 1: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập được từ rong Kappaphycus alvarezii ... 54
Hình 3. 2: Các nhóm màu sắc khuẩn ty của chủng vi nấm phân lập từ 3 mẫu rong. ........... 55
Hình 3. 3: Tỷ lệ phần trăm các chủng sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ......... 57
Hình 3. 4. Số lượng vi khuẩn phân lập được có khả năng đối kháng với từng chủng
VSVKĐ. ............................................................................................................................... 57
Hình 3. 5. Số lượng các chủng vi nấm sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ ....... 59
Hình 3. 6. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự 16S rRNA của các chủng VP02.3, VP02.11
thuộc chi Bacillus (a ) và chủng VP03.12 thuộc chi Brevibacillus và chủng VP03.6 thuộc
chi Pseudomonas (b), dựa trên ITS neighbor-Joining tree.................................................. 67
Hình 3. 7. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự ITS của chủng VPN1.11 và VPN1.5 dựa
trên cây phân loại ITS Neighbor – Joining tree. .................................................................. 68
Hình 3. 8. Phân tích thành phần chính (PCA) thực hiện trên tỉ lệ tương đối các chủng vi
khuẩn. ................................................................................................................................... 70
Hình 3. 9. Cấu trúc quần thể vi khuẩn ở mức độ ngành ...................................................... 70
Hình 3. 10. Tỉ lệ tương đối của một số chi vi khuẩn tiêu biểu ở các mẫu rong ................... 71
Hình 3. 11. Phân tích thành phần chính (PCA). .................................................................. 73
Hình 3. 12. Cấu trúc quần thể nấm ở mức độ ngành ........................................................... 74
Hình 3. 13. Tỉ lệ tương đối của một số chi tiêu biểu ở các mẫu rong Vân phong, Việt Nam
qua phân tích metabarcoding ............................................................................................... 75

Hình 3. 14. Ảnh hưởng của thời gian lên men chủng Aspergillus micronesiensis đến hàm
lượng cao chiết ethylacetate thu được ................................................................................. 86
Hình 3. 15. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường đến hàm lượng cao chiết
ethylacetate thu được ........................................................................................................... 87
Hình 3. 16. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được
từ chủng Aspergillus micronesiensis ................................................................................... 88
Hình 3. 17. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương tác đôi của các yếu tố công nghệ lên hàm mục
tiêu Y.................................................................................................................................... 92
Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AM8A1 và hợp chất tham khảo Eleganketal A 98
Hình 4. 2. Các tương tác HMBC chính của hợp chất Aspersiensis A ................................ 99
Hình 4. 3. Phổ CD và ECD của Aspersiensis A với các cấu hình tuyệt đối Aspersiensis
Aa, Aspersiensis Ab, Aspersiensis Ac, Aspersiensis Ad. ................................................. 101
Hình 4. 4. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis A ............................... 102
Hình 4. 5. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis A .................................................... 103
Hình 4. 6. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis A ........................................................ 103


Hình 4. 7. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8B1
........................................................................................................................................... 104
Hình 4. 8. Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis B và TD-DFT của Aspersiensis B ........ 106
Hình 4. 9. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis B. .............................. 107
Hình 4. 10. Phổ 1H-NMR của hợp chất Aspersiensis B ................................................... 108
Hình 4. 11. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis B .................................................. 108
Hình 4. 12. Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis B ....................................................... 109
Hình 4. 13. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis B ...................................................... 109
Hình 4. 14. Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis B ..................................................... 110
Hình 4. 15. Các tương tác HMBC chính của hợp chất AM8B2 ........................................ 110
Hình 4. 16. Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis C và TD-DFT của Aspersiensis B với các
cấu hình tuyệt đối Aspersiensis Ba, Aspersiensis Bb, Aspersiensis Bc, Aspersiensis Bd
........................................................................................................................................... 113

Hình 4. 17. Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis C. ............................ 114
Hình 4. 18. Phổ 1H-NMR của hợp chất Aspersiensis C ................................................... 115
Hình 4. 19. Phổ 13C-NMR của hợp chất Aspersiensis C .................................................. 115
Hình 4. 20. Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis C ....................................................... 116
Hình 4. 21. Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis C ...................................................... 116
Hình 4. 22. Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis C..................................................... 117
Hình 4. 23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3A1
........................................................................................................................................... 117
Hình 4. 24. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3D.
........................................................................................................................................... 118
Hình 4. 25. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM4F1
........................................................................................................................................... 122
Hình 4. 26. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E1.
........................................................................................................................................... 124
Hình 4. 27. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E2
........................................................................................................................................... 126
Hình 4. 28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM7H
........................................................................................................................................... 127
Hình 4. 29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8D
........................................................................................................................................... 130


1
MỞ ĐẦU
Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, ấu
trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 102-107 CFU/cm2
mẫu, với vi nấm khoảng 104 CFU/cm2. Vi sinh vật có thể sống trên bề mặt rong (vsv
bám), hoặc sống trong các mô rong (VSV nội sinh). Các vi sinh vật đó có vai trị khác
nhau và có liên quan đến sức khỏe cây rong. Chúng có thể hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh
hoặc ơn hịa. Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian, thức ăn), khắc nghiệt

(do vsv tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuất chất tiêu diệt vsv có hại)
nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơ chế đặc biệt mới tồn tại được.
Sự đa dạng vsv trên một loài rong nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố (mùa trong năm,
nhiệt độ, môi trường biển ...). Như vậy có thể thấy rong là nguồn để phân lập nhiều vi
sinh vật mới.
Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định. Một loạt các
đặc điểm vật lý, hóa học, sinh học trên bề mặt rong được cho là có vai trị quan trọng
đến số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trên rong. Các tác nhân như dịch tiết
của rong, oxi từ rong, CO2, dịch tiết vi sinh vật, có tính chất quyết định đến số lượng
quần thể sống trên rong. Rong cung cấp oxi và các chất hữu cơ, cho vi sinh vật sinh
sống. Trong khi đó, vi sinh vật cung cấp trở lại CO2, chất khoáng và các chất trao đổi
thứ cấp có khả năng bảo vệ rong khỏi các sinh vật gây thối, gây bệnh cho rong, các
chất kích thích sinh trưởng (auxin...). Như một số vi sinh vật cố định đạm
(Agrobacterium và Rhizobium) cung cấp nguồn nitơ cho rong chủ. Vi sinh vật sản xuất
chất xua đuổi các động vật ăn rong và các enzyme (peroxidase, catalase) làm trung hòa
các gốc tự do (ROS) do rong tạo ra, làm giảm thiệt hại cho rong. Các chất hữu cơ, chất
trao đổi thứ cấp ở rong cũng có tác dụng lựa chọn các loài vsv nhất định sống trên chúng,
đảm bảo lợi ích cho rong. Một số vi khuẩn oxi hóa amonium được phát hiện trên rong
với số lượng tương đối nhiều, có vai trị giải độc nitrat cho rong. Như vậy có thể thấy
mối quan hệ hỗ sinh giữa rong và vi sinh vật thể hiện ở chỗ rong cung cấp các chất
dinh dưỡng hữu cơ cho vi khuẩn có lợi, mặt khác, vi khuẩn sản xuất chất kháng sinh
tiêu diệt hoặc làm giảm sự cố định của các vi khuẩn có hại, gây bệnh cho rong chủ.
Theo nhiều cơng bố, có từ 30-50% vi khuẩn trên rong có khả năng sản xuất chất đối
kháng vi sinh vật, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với tỉ lệ vi sinh vật sống tự do trong
nước biển hoặc bùn đáy (<10%).


2
Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường được phân
lập và nghiên cứu. Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn, nhưng

chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về lồi.
Việt Nam là nước nhiệt đới, có nguồn tài ngun sinh vật, đặc biệt vi sinh vật
rất phong phú và đa dạng. Để sinh tồn, vi sinh vật có nhiều cơ chế sinh lý, sinh hóa
khác nhau nhằm thích nghi với môi trường sống đặc biệt và khắc nghiệt. Sự cạnh
tranh bằng việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt hợp chất đối kháng lại
hoặc xua đuổi các vi sinh vật khác được coi là phổ biến và hiệu quả. Ở nước ta, chưa
có nhiều các báo cáo, công bố nghiên cứu về hệ sinh thái vi sinh vật vùng trồng rong,
trên cây rong. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá các chủng vi sinh vật sống
bám trên rong, từ đó đưa ra các biện pháp cần thiết và hữu ích nhằm bảo tồn phát
triển hệ sinh thái rong biển bền vững, hiệu quả… Xuất phát từ thực tiễn trên, nhằm
khảo sát đặc điểm, sự đa dạng các vi sinh vật và hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật
sống bám trên rong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm và
hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus
alvarezii ở vùng biển Nha trang, Khánh hòa, định hướng sử dụng trong y dược
học”.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài:
Mục tiêu nghiên cứu:
Đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus alvarezii
theo phương pháp nuôi cấy được và không thông qua nuôi cấy metagennomic (nấm
và vi khuẩn), phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất có hoạt tính
sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa) từ chủng có hoạt tính sinh học
cao.
Nội dung nghiên cứu.
1. Phân lập, sàng lọc một số chủng vi khuẩn và vi nấm có hoạt tính kháng sinh
liên kết với rong Kappaphycus alvarezii ở vịnh Vân Phong Khánh Hòa.
2. Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm trên rong biển bằng phương
pháp sinh học phân tử (16S với vi khuẩn 18S với vi nấm) trên các mẫu thu thập.
3. Lên men, đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn và vi nấm sống
liên kết với rong có hoạt tính sinh học tiêu biểu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa.
4. Nghiên cứu điều kiện lên men rắn thích hợp cho chủng vi nấm tiêu biểu tạo

ra các chất có hoạt tính sinh học cao, tối ưu hóa quá trình lên men.
5. Phân lập, tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học


3
của các hợp chất phân lập.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Đây là cơng trình đầu tiên kết hợp sinh học phân tử hiện đại metagenomic
với phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân tích, so sánh và đánh giá sự đa dạng
cũng như chức năng của VSV lên cây rong chủ (Kappaphycus alvarezii) ở Việt Nam.
2. Đã đánh giá được sự đa dạng của quần thể vi khuẩn và vi nấm trên loài rong
Kappaphycus alvarezii dựa vào phương pháp giải trình tự gen và phân tích
metagenomics.
3. Đã tách chiết và xác định được cơng thức hóa học của 10 hợp chất từ chủng vi
nấm Aspergillus micronesiensis, có hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào, chống
oxy hóa. Trong 10 hợp chất phân lập được có 3 hợp chất mới là; Aspersiensis A
(AM8A1): Aspersiensis B (AM8B1): Aspersiensis C (AM8B2) và 07 hợp chất AM3A1
(4-hydroxybenzaldehyde), AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22dien-3β-ol), AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II, AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6trihydroxy-7-methylisobenzofuran, AM6E2: Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl1(3H)-isobenzofuranone), AM7H: epicoccolides B, AM8D: epicoccolide A. Các hợp
chất này là lần đầu tiên được phân lập từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis liên
kết với rong Kapapphycus alvarezii.


4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về rong biển trên thế giới.
Rong biển là đối tượng nuôi trồng thủy sản quan trọng được trồng rộng rãi trên
thế giới. Theo tài liệu của FAO (2014), rong biển được trồng ở 33 quốc gia và lục địa
trên thế giới. Các quốc gia trồng rong biển trọng điểm của thế giới chủ yếu tập trung ở
châu Á bao gồm Trung Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, Hàn Quốc, Nhật Bản,
Tanzania và Solomon. Đặc biệt làTrung Quốc và Indonesia là hai quốc gia trồng rong

biển nhiều nhất, chiếm 81,4% tổng sản lượng rong biển thế giới [2].
Sản lượng rong biển nuôi trồng thế giới trên liên tục tăng, đặc biệt là những
thập kỷ gần đây. Năm 1990, sản lượng rong biển nuôi trồng cả thế giới khoảng 3,76
triệu tấn tươi. Đến năm 2000, sản lượng này là 9,3 triệu tấn tươi và tăng lên 19 triệu
tấn vào năm 2010. Như vậy, chỉ trong vòng 2 thập kỷ (1990-2010), sản lượng rong
biển nuôi trồng trên thế giới đã tăng khoảng 5 lần. Gần đây, năm 2012, sản lượng
rong biển trồng trên thế giới là 23,8 triệu tấn tươi. Rong biển khai thác tự nhiên có
sản lượng là 1,1 triệu tấn tươi tương đương 4,6% sản lượng rong trồng thương phẩm
(FAO, 2014). Trong những năm tới, sản lượng rong biển nuôi trồng dự báo sẽ tiếp
tục tăng lên để đáp ứng nhu cầu nguyên liệu cho phát triển cơng nghiệp sản xuất hàng
hóa và cả thiện chất lượng mơi trường [3, 4].
Bên cạnh các nước có nghề trồng rong phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản,
Philippin, Hàn quốc, Triều Tiên, Chile, Malaysia, Tanzania, Indonesia, Kiribati, hiện
nay nghề trồng rong đã phát triển tại hơn 20 nước khác. Sản lượng rong hàng năm
trên thế giới là hơn 140.000 tấn khơ (trong đó rong sụn Kappaphycus và rong câu
Gracilaria là chủ yếu) [5].
Mặc dù rong biển thế giới rất đa dạng (có tới 10.000 lồi đã được phân loại
(www.algaebase.org), nhưng số rong biển có thể ni trồng khá khiêm tốn. Theo
Titlyanov và Titlyanova (2010), có 17 chi rong biển đang được nuôi trồng trên thế giới
bao gồm: Agardhiella, Eucheuma, Gelidium, Gigartina, Gracilaria, Hydropuntia,
Hypnea, Kappaphycus, Meristotheca, Porphyra (ngành rong đỏ- Rhodophyta);
Saccharina, Laminaria, Undaria, Cladosiphon (ngành rong nâu- Phaeophyta),
Monostroma, Ulva, và Caulerpa (ngành rong lục- Chlorophyta). Trong đó, các chi
Agardhiella, Gelidium, Gigartina, Porphyra, Saccharina, Laminaria, Undaria,
Monostroma, và Ulva được trồng chủ yếu ở vùng ôn đới, Eucheuma, Gracilaria,


5
Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Cladosiphon, và Caulerpa được trồng chủ yếu ở
vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.

Theo thống kê của FAO (2014), năm nhóm rong biển trồng phổ biến nhất hiện
nay là rong sụn Kappaphycus alvarezii và Eucheuma spp., rong bẹ Nhật Bản
(Laminaria japonica), rong câu (Gracillaria spp.), rong bẹ Udaria pinatifida và rong
mứt (Porphyra spp.). Trong các nhóm này, nhóm rong sụn có sản lượng trồng nhiều
nhất (khoảng 8,2 triệu tấn tươi chiếm 34,5% tổng sản lượng rong biển tồn cầu) sau
đó là rong bẹ Nhật Bản và rong câu với sản lượng lần lượt là 5,8 và 2,85 triệu tấn
tương đương 24,4% và 12% tổng sản lượng rong biển tồn cầu
1.2. Tình hình rong biển ở Việt nam
Với chiều dài hơn 3.260 km, diện tích hơn một triệu km2, vùng biển nước ta
được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới. Vì vậy,
cơng tác điều tra, nghiên cứu mơi trường và tài nguyên sinh vật biển là vấn đề cần
được quan tâm nhiều.
Việt Nam có lợi thế và tiềm năng to lớn (gần 100 loài rong kinh tế phân bố và
diện tích trồng rong tiềm năng khoảng 900.000 ha) để phát triển rong biển thành
ngành sản xuất chủ lực trong tương lai. Hiện nay, 07 loài rong kinh tế (Rong nho
- Caulerpa lentillifera, Rong câu chỉ vàng - Gracilaria tenuistipitata, Rong câu thắt Gracilaria firma, Rong câu cước - Gracilariopsis bailinae, Rong sụn - Kappaphycus
alvarezii, Rong bắp sú - Kappaphycus striatus, Rong sụn gai - Eucheuma
denticulatum) đang được trồng phổ biến ở Việt Nam. [6, 7, 8].
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản năm 2022, hiện diện tích tiềm năng trồng
rong sụn cả nước khoảng 900 nghìn ha (tương đương 600 - 700 nghìn tấn rong
khơ/năm). Trong số hơn 800 lồi rong biển, 90 lồi có giá trị kinh tế. Năm 2020, diện
tích trồng rong biển đạt khoảng 15.000 ha, sản lượng 135.000 tấn. Trong đó, lợi nhuận
rong nho khoảng 150 triệu/ha và rong sụn khoảng 60 triệu/ha.
Rong biển được nuôi trồng tập trung ở các vùng ven biển gồm Bắc Bộ gần
6.600 ha, Bắc Trung Bộ hơn 2.000, Nam Trung Bộ 1.400ha, Đồng bằng sông Cửu
Long 100ha. Tại Việt Nam đã xác định được 833 loài rong biển với trữ lượng tự nhiên
80 - 100 tỷ tấn, thuộc 4 ngành, gồm ngành rong Đỏ (415 loài và biến loài), ngành
rong Nâu (147 loài và biến loài), ngành rong Lục (183 loài và biến loài) và ngành
rong Lam (88 loài và biến loài) [9].

6
1.3 Giới thiệu về Rong Sụn
Rong Sụn tên thương mại là Cottonii, bao gồm hai lồi chính là: Kappaphycus
alvarezii và Kappaphycus striatum, nguyên liệu chính cho chế biến kappacarrageenan được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kinh tế như chế biến thực
phẩm, y dược, mỹ phẩm, đệt may,...[10].
Đặc điểm sinh học của Rong Sụn
Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới có một số đặc điểm sinh học chính như
Sau: Hình thái cấu tạo Rong Sụn có thân dạng trụ trịn đường kính có thể đạt 20 mm,
nhiều trục chính, mọc lên từ bàn bám dạng đĩa. Những trục chính mới có thể mọc từ
cùng gốc với trục chính ban đầu hay ngay từ trên trục chính, ở dưới phần gốc của trục
chính ban đầu. Nhánh dạng trụ trịn hình thành ngay gần gốc thân, lúc đầu chia khơng
quy luật hoặc một bên, sau đó mọc và uốn cong theo hướng ánh sáng và thân chia
nhánh phát triển thành bụi rậm, thể chất trơn nhớt keo sụn, có màu nâu xanh [11].
Lồi Kappaphycus alvarezii.
Rong thơ, địn như sụn. Thân rong hình trụ, có màu xanh đến màu nâu đỏ, mọc
đứng, cao 20-60cm, với đường kính của thân chính và nhánh 1-2cm. Phân nhánh
thưa. Khoảng cách giữa hai lần phân nhánh từ 4-10cm. Nhánh chót hơi cong, dài 515cm, thon dần về ngọn. Khi mọc ở vùng nước có địng chảy tốt cây rong phát triển
dài có thể tới 2m/cá thê, trọng lượng cá thẻ từ 20-56 kg/cá thể. Nhánh thường có
đường kính lớn (trung bình 2,5mm), thon dần về phía đỉnh nhánh. Thường khơng có
hoặc ít nhánh thú cấp. Nhánh cong, phình rộng, thon dần và kéo dài (hình 1A) [11].
Lồi Kappaphycus striatum.
Rong thơ, sằn sùi, cao 20-25cm, màu nâu đen đến nâu đỏ. Phân nhánh dày,the
kiêu đối nhau, mọc vịng, chạc hai khơng đều. Khoảng cách giữa hai lần phân nhắn
ngắn từ 1-3cm, nhánh chót ngắn, đầu cùn hoặc trịn (hình 1B). Nhìn trên bề mặt cắt
ngang thân: Kích thước tế bào từ lớp vỏ vào lớp lõi tăng. Lớp vỏ bao gồm 2-3 lớp tế
bào chứa sắc tố, hình bầu dục, đường kính 7-10um. Lớp nhu mơ ngồi gồm 7-10 lớp
tế bào hình bầu dục hoặc hình cầu đường kính 124 250um, vách dày 10-15úm. Lớp
nhụ mô lõi bao gồm những tế bào lớn xen kế với những sợi trục, đường kính 2530um, với vách dày 10-15pnm [11].

7

A

B
Hình 1. 1: Hình ảnh hai lồi rong sụn chính ở nước ta

Phân bố, sinh học
Trong tự nhiên Rong sụn mọc bám trên các vật bám cứng có chất vơi (trên rạn
san hô chết hoặc trên đá), phân bố chủ yếu ở phần trên của vùng dưới triều (ngay bên
dưới của mực chiều thấp), nơi nước chảy nhẹ đến vừa phải.
Phân bố: Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới, trong tự nhiên nó phân bố chủ
yếu ở vùng biển nhiệt đới trong khu vực Châu Á và Tây Thái Bình Dương, đặc biệt
phơ biến ở vùng biên một số nước Đông Nam Á (Philippines, Indonesia, Maylaysia...)
Là loại rong hẹp muối, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở độ mặn 28-34 oC.
Độ mặn dưới 20 ‰ kéo dài nhiều ngày, rong ngừng phát triển và chết. Độ mặn cao
35-40 ‰ sinh trưởng của rong bị ức chế.
Nhiệt độ nước thích hợp nhất cho rong sinh trưởng và phát triển là 25-30 °C.
Khi nhiệt độ nước cao hơn 31 oC, rong sẽ tăng trưởng chậm, ở nhiệt độ thấp hơn 15
°C rong sẽ bị chết [11].
Kể từ khi du nhập vào Việt Nam năm 1993, rong sụn Kappaphycus alvarezii
thích hợp với khí hậu nhiệt đới Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền Trung và hiện
nay được nuôi trồng tại Đà Nẵng, Quang Nam, Ninh Binh, Phú Yên, Khanh Hịa Kiên
Giang …Rong có thể được trồng quanh năm.
Thành phần hóa học cúa Rong Sụn
Thành phần hố học của Rong Sụn luôn thay đôi phụ thuộc trạng thái sinh lý,
thị gian sinh trưởng, điều kiện sống (cường độ bức xạ, thành phần hố học của mơi

8
trường). Trong Rong Sụn hàm lượng nước chiếm 77-91% còn lại vài phần trăm chất
khô. Trong chất khô chứa chủ yếu là gluxit, protein, chất khoáng, lipit, sắc tố, các
enzyme ...[12, 13].
Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11]

Thành phần hóa học

Tỉ trọng khối lượng (% chất khơ)

Gluxit

40 – 45%

Chất khống

20%

Protein

2 – 22%

Thành phần hóa học khác

5 – 13%

Ứng dụng của Rong Sụn.
Rong Sụn được ứng dụng để sản xuất một số sản phẩm trong lĩnh vực thực
phẩm. Carrageenan tự nhiên được tách chiết từ Rong Sụn có bốn đặc điểm chính như:
là một chất đơng đặc; là một chất nhũ tương để giúp cho các dung địch ở trạng thái

hỗn hợp đồng nhất với nhau mà không bị tách riêng rẽ; một chất làm thay đôi kết cầu
của sản phẩm bởi việc tạo ra các chất đông đặc hoặc dai; một chất giúp làm ồn định
các tinh thể để ngăn chặn đường hoặc nước đá khỏi kết tỉnh lại. Do vậy mà
carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, dược
phẩm, công nghệ sữa, y dược học, trong xử lý môi trường nuôi tôm cá và trong một
số ngành công nghiệp thực phẩm khác [15, 16, 17, 18, 19, 20].
2.1. Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học
Nghiên cứu về các vi sinh vật cộng sinh là một lĩnh vực phát triển nhanh chóng
như theo một số báo cáo gần đây cho thấy rằng, một số chất chuyển hóa thu được từ
rong, san hơ, bọt biển và động vật khơng xương sống có thể được sản xuất bởi các vi
sinh vật cộng sinh với chúng [21, 22, 23]. Các vi khuẩn cộng sinh được biết đến với
rất nhiều các hoạt tính sinh học đa dạng bao gồm cả những yếu tố chức năng [23].
Gần đây, Baker và cộng sự. (2009) đã thực hiện một nghiên cứu nhằm phân lập và
xác định sự đa dạng của chủng nấm từ loài bọt biển H. simulans. Họ đã sử dụng kết
hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật hiện đại để định danh và xác định
các hoạt tính kháng sinh, kết quả họ đã được phân lập được 19 kiểu gen khác nhau
thuộc về các chi Agaricomycotina, Mucoromycotina, Saccharomycotina, và
Pezizomycotina; một số chủng này cho thấy sự ức chế một số vi khuẩn là Escherichia
coli, Bacillus sp, Staphylococcus aureus, và Candida glabrata [24]. Vi khuẩn liên kết


9
với bọt biển là một hình thức tương tác hóa học và là nguồn tài nguyên sinh thái tiềm
năng cung cấp các hợp chất tự nhiên một cách bền vững để phát triển nguồn dược
phẩm mới [25, 26].
Theo đánh giá Rateb và cộng sự (2011), các chất thứ cấp từ nấm biển có nguồn
gốc rong/tảo biển là chiếm đa số (21%), tiếp sau là bọt biển (19%), cây đước biển
(16%) v.v… Chính vì vậy, nguồn chất có hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật có liên
quan tới rong/tảo biển được cho là rất có tiềm năng. Trong đầm nuôi rong sụn
Kappaphylus alvarezii bị nhiễm bệnh. Theo như Masuda (1997a; 1998) thấy rằng loài

tảo đỏ sống cộng sinh Laurencia majuscule vẫn phát triển tốt bởi chúng sản sinh 4
chất kháng sinh chống lại vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn ở rong. Các kháng sinh là
elatol (1), iso-obtusol (2), 10,15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene
(3) và (E)-10-15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene (4) [27].
Một chủng nấm có nguồn gốc từ biển M-3, phân lập từ rong đỏ Porphyra yezoensis
được sàng lọc hoạt tính kháng nấm (MIC-0.36 µM) với chủng Pyricularia oryzae theo
Byun et al. (2003). Kết quả là, đã phân lập được một Diketopiperazine mới từ chiết xuất
môi trường lên men của chúng nấm [28]. Một nghiên cứu năm 2004, báo cáo chỉ ra bằng
cách chiết xuất butanolic từ dịch nuôi cấy chủng Pseudoalteromonas issachenkonii liên
kết trên một số lồi rong biển cho hoạt tính tan huyết và ức chế sự phát triển của nấm
Candida albicans. Phân tích hóa học sâu hơn với chiết xuất etyl axetat cho thấy cấu trúc
hóa học cho hoạt tính kháng nấm là Isatin (indole-2,3-dione) [28].

Ngồi giá trị sinh thái lớn từ mơi trường sống, các rạn san hô là môi trường cư
trú cho nhiều loài nhất trong các đại dương, chứa một lượng lớn các loài vi sinh vật
và là một nguồn giàu hợp chất sinh học mới chưa được khám phá [28]. Vi khuẩn liên
kết với các lồi san hơ biển cũng được biết đến với rất nhiều hoạt tính sinh học tiềm
năng [30]. Hơn 20 năm trước, Tapiolas và đồng nghiệp (1991) đã phân lập và phân
tích đặc tính hai hợp chất mới đó là Octalactin A và B từ Streptomyces sp ở biển,


10
được phân lập từ bề mặt của một loài san hô sừng không xác định thuộc chi
Pacifigorgia. Báo cáo của họ cho thấy hợp chất Octalactin – cho kết quả gây độc tế
bào mạnh đối với u ác tính B-16-FlO và các dịng tế bào khối u HCT-116 có giá trị
IC50 là 0,0072 và 0,5 µg / mL tương ứng [31].

Theo một số nghiên cứu gần đây đã báo cáo từ canh trường nuôi cấy của chủng
Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856 cộng sinh với lồi san hơ sừng từ miền
Nam Trung Quốc có biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Escherichia coli,

Bacillus subtilis, và Staphyloccocus aureus và hoạt tính kháng ấu trùng bryozoan
Bugula neritina. Họ đã xác định được cấu trúc của hợp chất mới 24 vòng lacton là
Macrolactin V từ mơi trường ni cấy [32].
Một số lồi vi khuẩn biển được biết đến như là loài di cư của các sinh vật biển cũng
đã được báo cáo có tiềm năng kháng khuẩn. Trong một báo cáo, 42 chủng vi khuẩn biển
phân lập cho thấy hoạt tính kháng khuẩn ở các chi Alteromonas, Pseudomonas, Bacillus và
Flavobacterium [33]. Một nghiên cứu tiến hành tại Hoa Kỳ vào năm 2002 đã công bố 5 hợp
chất tự nhiên mới, Phomadecalins A, B, C và D, và Phomapentenone A, được phân lập từ
dịch chiết môi trường của chủng Phoma sp. (NRRL 25697) là một loại nấm dạng bào tử
được phân lập từ Hypoxylon sp. Các hợp chất này có cấu trúc đặc trưng và bốn hợp chất
(phomadecalins A – D) được tìm thấy có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương, Bacillus
subtilis (ATCC 6051) và Staphylococcus aureus (ATCC 29213) [34].
2.2. Vi sinh vật cộng sinh với rong
Mối quan hệ mật thiết giữa vi khuẩn và rong biển trong đó rong biển cung cấp
chất dinh dưỡng, trong khi cộng đồng vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển của rong và bảo
vệ vật chủ chống lại mầm bệnh, mối quan hệ này đã được xây dựng và chứng minh
hơn 20 năm qua. Hình 2.1 mơ tả sự tương tác và chuyển hóa các chất hóa học, trong
đó bao gồm mối quan hệ có lợi, bất lợi tồn tại giữa rong và vi sinh vật sống cộng sinh.
Sự đa dạng và bản chất hóa học của sự tương tác đã được Goecke và đồng nghiệp


11
chứng minh [35].

Hình 1. 2: Mối tương tác giữa vi khuẩn và rong biển nói riêng và vi sinh vật cộng sinh với rong biển nói
chung [35].

Từ vật chủ là rong các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự tương tác giữa vi khuẩn và
rong biển có mối quan hệ mật thiết. Bề mặt Rong biển cung cấp rất nhiều chất dinh
dưỡng hữu cơ cho các loài vi khuẩn cơ hội và nó là điểm nóng của sự canh tranh vi sinh

vật cộng sinh trên rong. Trong hầu hết các nghiên cứu ở mức độ phân tử đã chứng minh
bề mặt rong thu hút rất nhiều vi khuẩn có tính đặc hiệu rất cao. Trong khi thành phần của
khu hệ vi sinh vật này có thể thay đổi theo mùa, theo tuổi của các bộ phận khác nhau trên
cây chủ, nguyên nhân có thể do yếu tố sinh học và phi sinh học [36]. Rong biển thường
liên kết với một cộng đồng vi sinh vật mang tính đặc hiệu với từng loại rong khác nhau
và khác biệt so với hệ vi sinh vật trong nước biển.
Gần đây, dựa vào kỹ thuật phân tử sàng lọc 16S rRNA, Burke và cộng sự
(2011b), đã phát hiện được trên cùng một loài rong Ulva australis tại một vùng, có
những thành phần lồi vi khuẩn rất khác nhau. Bên cạnh đó bằng cách sử dụng kỹ
thuật metagenomic các nhà khoa học đã chỉ ra rằng thành phần quần xã vi sinh vật
trên loài rong Ulva australis được điều khiển bởi các gen chức năng hơn là chỉ dựa
vào thành phần phân loại hoặc phát sinh lồi [36]. Điều đó cho thấy rằng nhóm chức
năng của vi sinh vật cộng sinh với rong biển không nhất thiết liên quan đến phát sinh
loài. Thành phần trên cá thể rong biển có ảnh hưởng đến những gen chức năng của
hệ vi sinh vật cộng sinh với rong đó và cũng cho chúng ta biết dựa vào đặc tính sinh
lý sinh hóa của vật chủ rong họ cũng xác định được phần nào đó thành phần của các
quần xã vi sinh vật cộng sinh với nó [36].


12
Rong biển cũng có những hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật, giúp bảo vệ
bề mặt rong khỏi các vi khuẩn gây bệnh, và ngăn cản quá trình tích tụ của các vi sinh
vật trên bề mặt rong dưới dạng màng sinh học [37]. Ngoài ra các chất có hoạt tính từ
rong biển có thể kiểm sốt quần xã vi khuẩn bằng cách can thiệp vào hệ thống liên
lạc giữa các tế bào vi khuẩn Qs (Quorum sensing).
Vi khuẩn trên bề mặt rong
Nhiều vi khuẩn sinh trưởng phát triển trên bề mặt rong biển có thể sử dụng
enzyme để phân hủy thành tế bào của rong đó là một trong những yếu tố chính trong
q trình chuyển hóa dinh dưỡng trong đại dương. Vi khuẩn liên kết trên rong có thể
hoạt hóa các chất hữu cơ của rong và sau đó cung cấp cacbon dioxide, khống chất,

vitamin và các yếu tố tăng trưởng khác [35, 38]. Một số nghiên cứu cũng công bố
rằng vi khuẩn liên kết với rong biển là nguồn cung cấp nitơ cố định và một số hợp
chất có khả năng khử độc quan trọng [35].
Bên cạnh việc chuyển hóa cung cấp dinh dưỡng và tác dụng thúc đẩy tăng
trưởng, vi khuẩn có thể định hình hình thái và ảnh hưởng đến vịng đời của rong biển.
Matsuo 2005; Goecke 2010 và cộng sự đã báo rằng các chất chuyển hóa từ vi khuẩn
bao gồm cả phân tử (QS) cũng đóng một vai trị trong vịng đời của rong biển như là
q trình giải phóng và nảy mầm bào tử rong [35].
Hơn nữa các hợp chất ức chế (QS) và các hợp chất kháng khuẩn được tạo ra
bởi nhiều vi khuẩn kết hợp cùng với các chất chuyển hóa có hoạt tính từ rong biển,
giúp bảo vệ rong khỏi mầm bệnh, động vật ăn cỏ và các sinh vật bám khác.
Vi khuẩn gây bệnh có thể tác động vào màng tế bào của rong biển, làm cho
rong bị chết gây hậu quả rất lớn đối với ngành ni trồng rong và hệ sinh thái rong
[35]. Ngồi ra màng sinh học cũng là mối đe dọa thường trực đối với các loại rong
biển, tăng sự tác động của ái lực lên rong, tăng sự gắn kết của sinh vật bám và các
động vật ăn cỏ khác. Màng sinh học, cạnh tranh chất dinh dưỡng, ức chế trao đổi khí,
cản ánh sáng cho q trình quang hợp của rong.
Do đó các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi khuẩn và rong đều là những
hợp chất thiết yếu trong mối quan hệ vi khuẩn và rong, chúng giúp kiểm soát thành
phần và cấu trúc màng sinh học, do đó bảo vệ bề mặt rong chống lại quá trình tạo
màng sinh học [35]. Ngồi ra các hợp chất có hoạt tính từ vi khuẩn này có thể là
nguồn cung cấp các chất có hoạt tính hứa hẹn hơn, dễ xử lý và có những ứng dụng


13
rộng dãi hơn so với các hợp chất có nguồn gốc từ rong [39].
Vi khuẩn nội sinh liên kết với rong
Bên cạnh các vi khuẩn liên kết bên ngoài rong, một số vi khuẩn cũng sống bên
trong lớp tế bào của rong, nó có khả năng phân hủy thành tế bào, tạo ra các khoảng
trống cho vi khuẩn cơ hội và gây bệnh cho rong, những vi khuẩn này trở lên bất lợi

nếu xâm nhập được vào mô của rong, gây bệnh cho rong và làm chết rong.
Tuy nhiên những vi khuẩn nội sinh có những mối quan hệ tích cực với sự hình
thành và phát triển của một số loại rong. Như rong biển đỏ Prionitis, vi khuẩn nội
sinh đóng vai trị quan trọng trong q trình hình thành và sản sinh ra một số
phytohormone indole-3-acetic acid (IAA) [35]. Singh và cộng sự 2011b thì vi khuẩn
nội sinh trong lồi rong biển Gracilaria dura có khả năng tăng cường khả năng nảy
chồi, bằng cách sản xuất ra IAA và khả năng cố định nitơ, một vài công bố khác cũng
được báo cáo vi khuẩn nội sinh này liên quan đến chức năng giải độc, cố định nitơ và
quang hợp trên một số loại rong biển xanh [40]. Bên cạnh đó có rất nhiều những lợi
ích mà vi khuẩn nội sinh có tương tác đối với rong biển nhưng chưa được nghiên cứu
cụ thể và hiểu rõ hơn [41].
2.3. Khoa học metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV liên kết
Metagenomics là ngành khoa học nghiên cứu về đa hệ gen (metagenome) của
tất cả các mẫu vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ môi trường tự nhiên [42].
Metagenomics là thuật ngữ được sử dụng để mô tả một lĩnh vực nghiên cứu khoa học
và các kỹ thuật cho phép phân tích tồn thể vi sinh vật sống trong bất kỳ môi trường
tự nhiên nào. Metagenomics nổi lên như một vũ khí mạnh mẽ được sử dụng để nghiên
cứu cộng đồng vi sinh vật bất kể chúng có thể ni cấy được hay khơng trong điều
kiện phịng thí nghiệm và cũng cung cấp cơ hội để mô tả sự đa dạng vi sinh vật trong
mơi trường vì rất nhiều lồi hiện chưa nuôi cấy được. Metagenomics dựa vào việc
tách DNA từ một cộng đồng vi sinh vật và như vậy tất cả genome của vi sinh vật
trong cộng đồng đó đều được gộp lại. Chính vì thế mà chúng ta có thể thu nhận và
phân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật rất là phong phú và đa dạng, đặc biệt là
vi sinh vật không thông qua nuôi cấy chiếm 99% mà metagenomics đã trở thành công
cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen và phát hiện ra các gen mới trong
cộng đồng vi sinh vật đó.