Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai diadema savignyi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------o0o-------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
LỒI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
LỒI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI
Chun ngành

: Hóa hữu cơ

Mã số

: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoài Nam
PGS.TS. Phan Minh Giang

HÀ NỘI – 2014

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ Đề tài nghiên
cứu cơ bản định hướng ứng dụng: “Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có
tác dụng diệt tế bào ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp
Sao biển (Asteroidea), Hải sâm (Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành
Da gai (Echinodermata) ở biển Việt Nam”.
Trước tiên, với tấm lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Nguyễn Hoài Nam, Viện Hóa Sinh Biển và PGS. TS. Phan Minh Giang,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình hướng
dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đặc biệt là tập
thể cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cơ trong khoa Hóa hoc - Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại
trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong q trình học

tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận
được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên
Đặng Ngọc Bách

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CAM ĐOAN
Luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học
lồi cầu gai Diadema savignyi”. là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Hoài Nam và PGS. TS. Phan Minh Giang.
Tôi xin cam đoan Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực, không
trùng lặp và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên
Đặng Ngọc Bách

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai ............................................................ 3
1.1.1. Động vật học ................................................................................................. 3
1.1.2. Phân bố sinh thái ........................................................................................... 3
1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm ............................................................ 4
1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai .................................. 5
1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam ..................................................... 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 12
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................... 13
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 13
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế ............................................................................ 13
2.2.3. Sắc kí cột (CC)............................................................................................ 13
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất .............................. 13
2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ........................................................ 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 16
3.1. Kết quả .......................................................................................................... 16
3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng .................................................................. 16
3.1.2. Phân lập các hợp chất ................................................................................. 17
3.2. Thảo luận ........................................................................................................ 20
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất....................................................... 20
3.2.1.1. Hợp chất DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol ..................................... 20

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


3.2.1.2. Hợp chất DS2: Cholest-5-en-3β,7α-điol .................................................... 25
3.2.1.3. Hợp chất DS3: Cholest-5-en-3β,7β-điol .................................................... 28
3.2.1.4. Hợp chất DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol ............................................. 32
3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol ............................................................. 36

3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat ............................................. 40
3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .................................... 45
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

1

CC

Column Chromatography

2

COSY

Correlation Spectroscopy

3

DEPT

Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer

4

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

5

TLC

Thin Layer Chromatography

6

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

7

13

Cacbon-13-Nuclear Magnetic Resonance

C-NMR

Spectroscopy
8

1

H-NMR

9

1

H-1H COSY

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H-1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy
10

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum
Coherence

11

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis

4

Hình 1.2. Cầu gai D. setosum

5

Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi

12

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lồi Cầu gai Diadema savignyi 19
Hình 3.1.a. Phổ 1H-NMR của DS1

20

Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của DS1

20

13

Hình 3.1.c. Phổ C-NMR của DS1

21

Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1

21

Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1

22

Hình 3.1.e. Phổ HMBC của DS1

23

Hình 3.1.f. Phổ COSY của DS1

24

Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của DS1

24

Hình 3.2.a. Phổ 1H-NMR của DS2

25

Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của DS2

25

Hình 3.2.c. Phổ 13C-NMR của DS2

26

Hình 3.2.d. Phổ HMQC của DS2

26

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của DS2

27

Hình 3.2.e. Phổ HMBC của DS2

28

Hình 3.2.f. Các tương tác HMBC chính của DS2

28

Hình 3.3.a. Phổ 1H-NMR của DS3

29

Hình 3.3.b. Cấu trúc hóa học của DS3

29

13

Hình 3.3.c. Phổ C-NMR của DS3

30

Hình 3.3.d. Phổ HMQC của DS3

30

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của DS3

31

Hình 3.3.e. Phổ HMBC của DS3

32

Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của DS3

32

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Hình 3.4.a. Phổ 1H-NMR của DS4

33

Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của DS4

33

13

Hình 3.4.c. Phổ C-NMR của DS4

34

Hình 3.4.d. Phổ HMQC của DS4

34

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4

35

Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4

36

Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4

36

Hình 3.5.a. Phổ 1H-NMR của DS5

37

Hình 3.5.b. Cấu trúc hóa học của DS5

37

Hình 3.5.c. Phổ 13C-NMR của DS5

38

Hình 3.5.d. Phổ HMQC của DS5

38

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5

39

Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5

40

Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5

40

Hình 3.6.a. Phổ 1H-NMR của DS6

41

Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của DS6

41

Hình 3.6.c. Phổ 13C-NMR của DS6

42

Hình 3.6.d. Phổ HMQC của DS6

42

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6

43

Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6

44

Hình 3.6.f. Các tương tác HMBC chính của DS6

44

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

46

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

LỜI MỞ ĐẦU
Diện tích bề mặt trái đất vào khoảng 510.072.000 km2 trong đó đại dương
bao phủ hơn 3/4 tổng diện tích bề mặt. Đại dương không chỉ là nơi sinh sống của
hàng ngàn lồi động vật biển khác nhau mà cịn ẩn chứa trong đó vơ vàn điều bí ẩn
chờ đợi con người tìm hiểu và khám phá.
Việc nghiên cứu khai thác và sử dụng các nguồn lợi từ biển luôn là chủ đề
nóng bỏng đối với các nhà khoa học trên khắp thế giới. Trong những năm gần đầy
Việt Nam đã và đang có các cơng trình khoa học nghiên cứu về sinh vật biển, một
trong các xu hướng mới mở ra là tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học cao từ sinh vật biển. Từ đó nghiên cứu thành phần, cấu trúc và tổng hợp
nên các hợp chất có giá trị y học cao. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới,
có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều
loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Hơn thế với bờ biển kéo dài và
thềm lục địa rộng lớn đó là nơi cất giấu kho nguyên liệu khoáng vật khổng lồ dưới
dạng hòa tan, nắng đọng dưới đáy và vùi kín dưới đại dương. Trong sự đa dạng của
sinh vật biển thì lồi cầu gai là một trong những lồi nhận được sự quan tâm đặc
biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Ở Việt Nam cầu gai khơng những
có giá trị ẩm thực mà con mang giá trị y học. Các cơng trình khoa học nghiên cứu
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới cho thấy các hợp chất tách ra
từ cầu gai có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn kháng nấm, kháng viêm đặc
biệt là khả năng ức chế các tế bào gây ung thư. Tuy nhiên ở nước ta những thơng tin
khoa học về lồi này vẫn cịn nhiều hạn chế, chưa có các nghiên cứu cụ thể làm
sáng tỏ giá trị dược dụng của dược liệu quý này. Do đó, nội dung nghiên cứu của đề
tài nhằm phát hiện các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học quý báu góp phần
minh chứng giá trị dược dụng của loài. Kết quả nghiên cứu sẽ làm tăng giá trị khoa
học và thực tiễn góp phần khai thác và bảo tồn một cách có hợp lý nguồn tài nguyên

cầu gai phong phú của đất nước.

Đặng Ngọc Bách

1

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

Trên cơ sở đó, luận văn tốt nghiệp này tập trung vào: “Nghiên cứu thành
phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm
sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử
dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn nguồn nguyên liệu biển quý giá của đất nước.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số hợp chất từ lồi cầu gai Diadema savignyi
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được.

Đặng Ngọc Bách

2

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai
1.1.1. Động vật học
Cầu gai hay cịn gọi là nhím biển (hay nhum biển, chôm chôm biển) thuộc
lớp cầu gai (Echinoidea) ngành động vật da gai (Echinodermata), có hai phân lớp;
cầu gai đều xuất hiện vào kỉ Silua và cầu gai khơng đều xuất hiện vào kỉ Jura. Cầu
gai có khoảng 800 loài hiện sống và 2.500 loài đã tuyệt chủng [3].
Cầu gai cịn được gọi là nhím biển hay cà ghim bởi xung quanh loài hải sản
này là hàng trăm que nhọn như lơng nhím, có đối xứng tỏa trịn bậc 5 [2]. Nhím
biển sống gần các rạn san hơ, rạn đá ven biển. Khi nhìn thống qua, thì Cầu Gai có
vẻ như một vật bất động, hay đúng hơn là khơng có khả năng di chuyển. Dấu hiệu
rõ ràng nhất để chứng minh chúng thật sự là động vật là ở những cây gai, tua tủa
dính vào vỏ bằng các nối kiểu một quả bóng gắn vào một hốc tế bào (ball-andsocket), các gai này có thể chia về mọi phía. Có 2 loại gai là gai thường làm nhiệm
vụ vận chuyển và gai kìm làm chức năng tự vệ [2]. Khi chỉ bị chạm nhẹ, Cầu Gai
phản ứng bằng cách hướng hết gai về phía bị chạm. Cầu gai khơng có mắt, khơng
có chân, khơng có cơ quan để di chuyển nhưng chúng lại di chuyển rất dễ dàng
bằng cách dùng các ống dính, nối kết với xương sống của chúng.
Cầu gai sống ở nhiều độ sâu khác nhau từ đới gian triều tới biển sâu. Hiện
biết khoảng hơn 70 loài thuộc các chi Salmacis; Temnopleurus; Diadema;
Clypeaster [3].
1.1.2. Phân bố sinh thái [3,5,7]

Có mặt ở hầu hết các vùng biển trên thế giới; Sống trong rạn san hô, từ vùng
triều đến độ sâu khoảng 70 mét, sống trên thềm biển, đáy đá và vùi trong cát biển.
-

Trong nước: Ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa; Ở vùng biển
Cơn Đảo, phát hiện được 13 lồi thuộc 9 họ; Ở Vịnh Nha Trang phát hiện 7

Đặng Ngọc Bách

3

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

loài; Tại vùng biển Vịnh Phong Vân – Bến Gỏi, Vĩnh Thái Lan, Phú Yên,
Khánh Hòa, Phan Thiết, thường xuất hiện nhiều lồi có giá trị kinh tế cao.
-

Thế giới: Lồi phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vùng
biển Bắc Đại Tây Dương từ eo biển Anh Quốc sang New Jersey (Hoa Kỳ).

1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm [7]
+ Vùng biển Ðịa Trung Hải: Tại Ðịa Trung Hải, cầu gai ăn được nổi tiếng nhất là
Paracentrotus lividus. Lồi này được xem là một món ăn ngon đặc biệt, bán tại các

nhà hàng ở các thành phố ven biển nơi chúng bị đánh bắt; Chúng có thể đến tận
vùng biển phía Nam Ái Nhĩ Lan, đường kính có thể đến 8 cm. Vỏ ngồi thường
được bán để làm quà lưu niệm.
+ Vùng Bắc Ðại Tây Dương: Tại vùng biển Bắc Ðại Tây Dương, từ eo biển Anh
quốc (English Channel) sang đến New Jersey (Mỹ), loài thường gặp nhất là
Strongylocentrus droebachiensis. Tuy nhiên chúng không được nhiều nơi ưa thích.
Lồi này xuất hiện rất nhiều tại vùng biển Maine (Mỹ). Thị trường tiêu thụ của loài
động vật da gai này tương đối giới hạn chỉ tại một vài chợ buôn bán hải sản quanh
New York như Fulton Fish Market. Việc chuyên chở cũng khiến cho thị trường
khơng phát triển.

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis (nguồn www.wallawalla.edu)
Xa hơn về phía Nam Ðại Tây Dương, có nhiều loại cầu gai nhỏ hơn, ít ăn
được trừ lồi Cidaris tribuloides trong vùng West Indies.

Đặng Ngọc Bách

4

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

+ Vùng Á Châu, Ðông Nam Á: Tại Ðông Nam Á, đa số cầu gai chỉ to bằng cỡ quả
táo tây, loài Diadema setosum tuy rất dồi dào nhưng cũng chỉ được tiêu thụ tại một

số địa phương (ngay tại Thái Lan loài này chỉ được dân tại đảo Kor Samuy ăn), có
lẽ do ở con vật có nhiều gai dài (có thể đến 20 cm) và nhọn đâm thấu qua da. Gai rất
dễ gãy. Mỗi gai được bao bọc bởi những lớp tế bào hạch tiết ra một dịch có chất
độc. Ðây là loài cầu gai đen tại Việt Nam. Vùng ven biển Phan Thiết (Bình Thuận)
được xem là xứ của Cầu Gai (Nhum), do đó có một số địa danh liên hệ đến Nhum
như sông Nhum, cầu Nhum, bến Nhum… Lồi Diadema palmeri (Palmer's needlespined urchin), vỏ có đường kính khoảng 10 cm, gai dài đến 10 cm. Vỏ và gai đều
màu đỏ. Lồi Diadema savignyi, có vỏ đường kính 10 cm, gai dài đến 13 cm, vỏ
màu lam-đen, có khi có đốm trắng trên gai. Tại Việt Nam, Cầu Gai là một ăn thuộc
loại “đặc sản” tại các vùng ven biển Phan Thiết.

Hình 1.2. Cầu gai D. setosum (nguồn en.wikipedia.org)
1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã được
cơng bố trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chủ yếu của các loài da gai là
các hợp chất steroit, saponin và cerebrosit. Trong số năm lớp sinh vật thuộc ngành
da gai, hai lớp sao biển (Asteroitea) và hải sâm (Holothuroidea) đã được tiến hành
nghiên cứu khá chi tiết. Rất nhiều công trình khoa học đã được cơng bố về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp sinh vật biển này, đặc biệt là các

Đặng Ngọc Bách

5

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

công bố về thành phần asterosaponin và cerebrosit từ các loài sao biển và các hợp
chất saponin dạng khung holostan từ các lồi hải sâm [6].
Tuy nhiên, hiện cịn rất ít các cơng trình nghiên cứu được cơng bố về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của các lồi sinh vật biển thuộc lớp cầu gai. Từ
những năm 1980, các hợp chất sắc tố dạng quinoit đã được công bố từ các loài cầu
gai Diadema setosum và D. savignije [8].
Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã công bố sự phân
lập và xác định cấu trúc của hai hợp chất steroit là 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1)
và cholesterol cùng với glycerol 1-palmitat và glyxerol 1,3-đioleat-2-stearat từ cặn
chiết metanol của loài cầu gai D. setosum thu thập tại Hạ Long, Việt Nam. Kết quả
đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào mạnh trên 3 dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm là KB (human
epidermoid carcinoma - biểu mô), FL (fibrillary sarcoma of the uterus - màng tử
cung) và Hep-2 (Hepatocellular carcinoma - gan) với giá trị IC50 lần lượt là 2,0,
3,93 và 2,4 g/ml [9].

5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1)
Đến năm 2008, nhóm nghiên cứu của các tác giả Nhật Bản tiếp tục công bố
một dẫn xuất gangliosit mới là 1-O-[9-O-metyl-(N-axetyl-α-D-neuraminozyl)(2→6)-β-D-glucopiranozyl]-ceramit (DSG-A, 2), cùng với bốn gangliosit đã biết.
Các hợp chất này thể hiện hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenic
activity) trên dịng tế bào thần kinh nội tiết ở tủy tuyến thượng thận của chuột PC12 (rat pheochromocytoma cell line) với sự có mặt của nhân tố phát triển dây thần
kinh (nerve growth factor). Một điều đáng quan tâm là hợp chất 2 có nhóm metoxi ở
đơn vị đường NeuAc thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Điều này cho thấy, nhánh axit

Đặng Ngọc Bách

6

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

sialic bị O-metyl hóa đóng vai trị quan trọng tạo nên hoạt tính tạo tế bào thần kinh
hình sợi của các hợp chất gangliosit phân lập được từ các loài da gai [10].

DSG-A (2)
Gần đây nhất, sự có mặt của các hợp chất sắc tố dạng napthoquinon trong các
loài cầu gai Tripneustes gratilla, Diadema setosum và Paracentrous lividus cũng
được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA
(photodiode array detector) ghép nối khối phổ ESI (electrospray ionization). Kết
quả phân tích cho thấy, lồi D. setosum có sự xuất hiện của các sắc tố spinochrom E
(3), một sản phẩm oxi hóa của echinochrom A, echinochrom A và 6-etyl-2,7đihiđroxi-3-metoxinaphthazanrin ; lồi T. gratilla có sự xuất hiện của 3, spinochrom
D (4), 2,3-đihiđro-2,3,7-trihiđroxi-2,3-epoxi-6-etylnapthazarin, echinochrom A,
anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7-trihiđroxinaphtazarin) (5), etyliđen-6,6’-bis-(2,3,7trihiđroxi-naphtazarin); loài P. lividus có sự xuất hiện của 3 và echinochrom A [11].

spinochrom E (3)

Đặng Ngọc Bách

spinochrom D (4)

7

anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7trihiđroxinaphtazarin) (5)

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam [1]
Steroit là lớp hợp chất thiên nhiên phổ biến nhất và lý thú nhất về phương
diện hóa học, là nhóm chất phân bố rộng khắp trong cơ thể động vật. Chúng gồm
các hợp chất thiên nhiên có nhiều tính chất quan trọng được dùng trong điều trị
bệnh điều hòa hệ thống nội tiết, chữa viêm khớp. Hiện nay, steroit còn dùng điều
chế thuốc tránh thai. Nhiều ứng dụng của steroit trong chăn nuôi và nông nghiệp
ngày càng được công nhận. Do tác dụng sinh lý của steroit nó khơng những là mối
quan tâm khoa học quan trọng mà cịn có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng
dược học.
Nhóm chất steroit được tìm thấy ở hầu hết các mẫu nghiên cứu thuộc ba
nhóm hải miên, san hơ mềm và da gai ở Việt Nam. Hợp chất có hàm lượng cao và
xuất hiện trong hầu hết các loài sinh vật biển thu thập được là cholesterol. Hợp chất
này được phân lập từ lồi san hơ mềm Cladiella sp. sao biển Archaster tyicus, hải
miên Xestospongia testudinaria và Gellius varius.

cholesterol
Ngoài ra, các dẫn xuất của cholesterol như 7α-hiđroxi-cholesterol, 7βhiđroxi-cholesterol và dẫn xuất mới 7α-metoxi-cholesterol được phân lập từ loài
rong sụn Kappaphycus alvarezii. Nghiên cứu thành phần hóa học lồi hải miên
Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm chất steroit như các hợp chất

ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol. Hợp chất này cũng
được phân lập từ loài hải miên Varius, X. testudinaria và cầu gai Diadema setosum.
Nghiên cứu thành phần hóa học của lồi hải miên Haliclona clathrata đã
phân lập được hợp chất mới là 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol cùng với (24R)24-etylcholest-4-en-3,6-đion, (24R)-24-etylcholest-3,6-đion. Ngoài ra, các hợp chất

Đặng Ngọc Bách

8

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

cholest-7-en-3β,5α,6β-triol và 6β-metoxicholest-7-en-3β,5α-điol cũng được phân
lập từ loài hải miên G. varius. Saringosterol, cholest-7-en-3-on cũng được xác định
từ loài hải miên X. testudinaria. Một điều đáng quan tâm là hợp chất saringosterol
được các nhà khoa học trên thế giới cơng bố có hoạt tính kháng vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis rất mạnh với giá trị nộng độ tối thiểu (MIC-Minimum
inhibitory concentration) là 0,25µg/ml và đây là giá trị MIC nhỏ nhất trong các hợp
chất thiên nhiên được chiết tách tính đến năm 2001. Giá trị này tương đương với giá
trị MIC của thuốc chữa lao rifampin. Ngồi ra, hợp chất này có độ độc thấp và tính
đặc hiệu cao.

saringosterol

24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol

Gần đây, ba hợp chất steroit mới có cấu trúc vịng propan ở mạch nhánh là
petrosterol-3,6-đion, 5α,6α-epoxipetroterol, iantheketal A cùng với petrosterol và
aragusterol B được phân lập từ loài hải miên Ianthella sp.

5α,6α-epoxipetroterol

petrosterol-3,6-đion

Từ loài san hô mềm Cladiella sp đã phân lập được hợp chất 9,11secosteroitglycozit mới là cladiasterol cùng với 3β,6α,11-trihiđroxi-24-metyl-9,11secocholest-7-en-9-on. Tại thời điểm đó, hợp chất trên là hợp chất đầu tiên được
phân lập từ thiên nhiên. Tiếp theo, hợp chất 9,11-secosteroit là sarcomilasterol cùng
với sarcoaldesterol B và ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol từ lồi san hơ mềm

Đặng Ngọc Bách

9

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Sarcophyton

mililatensis;

Luận văn thạc sĩ

Các

hợp

chất

3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11-

secocholestan-5-en-9-on, (24S)-ergostan-3β,5α,6β,25-tetraol được phân lập từ san
hô mềm Lobophytum compactum.

sarcomilasterol

cladiasterol

3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11-

(24S)-ergostan-

-secocholestan-5-en-9-on

-3β,5α,6β,25-tetraol

Gần đây, một số steroit mới là lobophytosterol cùng với (22S,24S)-24-metyl22,25-epoxifurost-5-en-3β,20β-điol,

(24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol,

pregnenolon

cũng đã được phân lập từ san hô mềm Lobophytum laevigatum. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng hợp chất lobophytosterol thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dịng tế bào
ung thư được thử nghiệm là phổi, ruột và máu.

Đặng Ngọc Bách

10

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

(24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol

lobophytosterol

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần steroit của các loài da gai cũng
thu được một số kết quả đáng quan tâm. Các hợp chất steroit mang nhiều nhóm
hiđroxi như 2α,3β,12α,21,24R,25-hexahiđroxilanost-8-en được tìm thấy từ lồi hải
sâm H. scabra. Từ loài sao biển A. typicus đã tiến hành phân lập được các hợp
chất

steroit

gồm;

27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol,

27-

norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol, ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,
14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol.

27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,

ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,

14α,15α,24R-octol

15α,22E,24R,25R,26-nonol

Đặng Ngọc Bách

11

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Tên Việt Nam: Cầu gai Sa-vít
-

Tên

khoa

học:

Diadema

savignyi

(Diadematidae).
- Thời gian thu mẫu: 12/2011.
- Địa điểm thu mẫu: Nha Trang.
- Người giám định loài: ThS. Nguyễn Thị
Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang.
Mơ tả, nhận dạng

Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi

Màu sắc của con trưởng thành thường đen, kể cả toàn bộ chóp nón hậu mơn.
Khi sống, trong ánh sáng ban ngày, các đốm mắt tạo thành một vòng xanh quanh hệ
thống đỉnh. Cũng có những đốm trắng xuất hiện trên mặt lưng trong mỗi đường xen
tia, mặc dù không rõ ràng. Những con non gai tay có băng ngang, ngay cả khi
đường kính ngang của vỏ đến 30 mm, điều này trái với màu đen của các gai ở D.
setosum.

Mỗi mảnh xương ở vùng chân ống mang 3 đôi lỗ, vùng lỗ ở gần miệng trụi
gai và rộng ra, có 2 hàng nấm gai nguyên thủy. Mỗi vùng trung gian có 2 hàng nấm
gai nguyên thủy, thường có 4-5 nấm gai trong mỗi hàng ngang. Vỏ trụi gai còn cho
thấy các đường sọc xanh ở giữa các mảnh gián tiếp.
Kích thước: đường kính ngang thường gặp của vỏ ở con trưởng thành từ 40-65 mm
(có khi đạt tới 100 mm), chiều cao từ 20-40 mm.
Loài này rất giống D. setosum, nhưng có thể phân biệt được nhờ màu sắc hậu
mơn. Trên hậu mơn D. setosum có 1 vịng màu cam, trong khi hậu mơn D. savignyi
hồn tồn đen.
Sinh học -Sinh thái học

Đặng Ngọc Bách

12

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

Diadema savignyi sống ở các vùng nước nông. Sống trong rạn san hô, từ
vùng triều đến độ sâu khoảng 70 mét.
Phân bố
Trong nước: ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa.
Thế giới: loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun
đếu trên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu.
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế
Sắc kí lớp mỏng điếu chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
60G F254 (Merck, kí hiệu là 105875), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254nm và 368nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch là
H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định
vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung mơi thích hợp.
2.2.3. Sắc kí cột (CC)
Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo.
Silica gel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica
gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50m, Fujisilisa Chemical Ltd.).
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (600 MHz),

13

C-NMR (150

MHz), HMQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer
của Viện Nghiên cứu khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại
và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp chất, kể cả
cấu trúc lập thể của phân tử.

Đặng Ngọc Bách

13

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và

13

C dưới tác dụng của từ

trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngồi ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa vào
tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
+ Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các
proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa
của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà
ta xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
+ Phổ

13

C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử

cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.
Thang đo phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230ppm.
+ Phổ 2D-NMR: đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu
thường được sử dụng trong luận văn gồm:
Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác
trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ một là
trục phổ 1H-NMR, còn trục còn lại là

13

C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên

đỉnh các ô vuông trên phổ.
Phổ

1

H-1H COSY (Homocosy), (1H-1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với
nhau.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này
mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định theo phương

pháp MTT (3-[4,5-đimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom) [12]. Ba dòng tế

Đặng Ngọc Bách

14

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

bào ung thư người dự kiến sẽ sử dụng là HL-60 (human acute promyeloid leukemia
- ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5
(human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi trường RPMI
1640

bổ

sung

10%

huyết

thanh

phổi

bò

(fetal

bovine

serum)

và

penicillin/streptomycin (tương ứng 100 U/mL và 100 mg/mL) ở 37 °C trong môi
trường 5 % CO2 được làm ẩm. Các tế bào phát triển theo cấp số nhân được sử dụng
trong các thí nghiệm.
Phương pháp MTT được tiến hành như sau: Các dịng tế bào ung thư người
(HL-60; 3 × 105 tế bào/mL, PC-3; 5 × 105 tế bào/mL, and SNU-C5; 1 × 105 tế
bào/mL) được xử lý trong 3 ngày với các hợp chất ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và
100 μM hoặc với các cặn chiết ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μg/mL. Sau
quá trình ủ, 0,1 mg (50 L của dung dịch 2 mg/mL) MTT (Sigma, Saint Louis, MO,
USA) được bổ sung vào mỗi giếng và các tế bào sau đo tiếp tục được ủ ở 37°C
trong 4h. Các phiến được tiến hành ly tâm ở 1000 vòng/phut trong 5 phút ở nhiệt độ
phịng và sau đó mơi trường được loại bỏ một cách cẩn thận. Sau đó,
đimetylsunfoxit (150 L) được cho vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan.
Các phiến được đọc ngay sau đó ở bước sóng 540 nm trên thiết bị đọc vi phiến
(Amersham Pharmacia Biotech., USA). Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành
lặp lại 3 lần và giá trị trung bình được tính toán. Kết quả được biểu thị là phần trăm
ức chế đã tạo ra sự giảm cường độ hấp phụ khi xử lý với các chất thử so sánh với
đối chứng âm. Đường cong phụ thuộc nồng độ được xây dựng và nồng độ ức chế 50
phần trăm (IC50) được xác định cho các mẫu thử cũng như cho từng dòng tế bào.

Giá trị IC50 < 100 M với chất sạch và IC50 < 100 g/ml với các cặn chiết được coi
là có hoạt tính.

Đặng Ngọc Bách

15

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng
a. Quy trình xử lý mẫu
Mẫu sinh vật biển sau khi thu về được tiến hành bảo quản theo quy trình
thống nhất sau:
- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại muối và tạp bẩn.
- Để ráo nước ở nhiệt độ phòng, ép nhẹ bằng giấy lọc bản để thấm hết nước.
- Cho từng mẫu vào các túi ni lông sạch, kèm theo ký hiệu mẫu được ghi
bằng bút chì trên giấy nến để tránh bị mờ hoặc rách nát khi tiếp xúc với nước và ở
điều kiện lạnh âm sâu.
- Lập danh sách mẫu sinh vật biển với ký hiệu mẫu.
Các túi mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh âm sâu (Frigor 3000 l, ở -20oC) để
đảm bảo mẫu không bị phân hủy bởi vi sinh vật.

b. Quy trình tạo dịch chiết
Các mẫu sinh vật biển được chiết theo quy trình sau:
Bước 1: Lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh: Trong quá trình lấy mẫu phải rất thận trọng
vì trong tủ lạnh âm sâu do có sự tạo tuyết nên các túi mẫu sẽ bị dính vào nhau do đó
rất dễ bị rách khi lấy mẫu ra. Nếu túi bị rách sẽ có thể làm mất kí hiệu mẫu gây ra
sự cố khơng xác định được mẫu hoặc nhầm lẫn giữa các mẫu với nhau.
Bước 2: Mẫu lấy ra được để giải đông ở nhiệt độ phịng sau đó rửa lại nhiều
lần bằng nước cất trước khi tiến hành cắt nhỏ và xay mẫu.
Bước 3: Mẫu sau khi rửa được cân, được cắt nhỏ và xay trên máy xay mẫu
(tuỳ theo loại mẫu sử dụng các thiết bị xay và nghiền mẫu phù hợp).
Bước 4: Mẫu đã xay được tiến hành chiết 3 lần bằng MeOH trên thiết bị
chiết siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) ở nhiệt độ 40-50oC, thời gian chiết mỗi lần
tối thiểu 60 phút.

Đặng Ngọc Bách

16

Hóa hữu cơ

LUAN VAN CHAT LUONG download : add