Luận văn thạc sĩ HUS phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym

Luận văn Thạc sĩ Khoa học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thị Xoè

PHÂN LẬP VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KITINAZA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT
SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

1

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thị Xoè

PHÂN LẬP VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KITINAZA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT
SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN

Hà Nội - 2012

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

2

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 5
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 7
1.1 SƠ LƯỢC VỀ KITIN ........................................................................................... 7
1.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên ........................................... 7
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin. ...................................................................... 8
1.1.3 Ơ nhiễm mơi trường có nguồn gốc kitin ..................................................... 11
1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin ..................................................................... 12
1.1.4. 1 Quy trình sản xuất kitin của Hackman [17]............................................ 12
1.1.4.2 Phương pháp điều chế kitin của Capozza [34] ....................................... 12
1.1.4. 3 Quy trình sản xuất kitin của tác giả Trần Thị Luyến [1,2] ....................... 13

1.1.5

Một số ứng dụng của kitin. ..................................................................... 13

1.2 SƠ LƯỢC VỀ KITINAZA .................................................................................. 16
1.2.1 Phân loại kitinaza. ..................................................................................... 16
1.2.2 Cơ chế tác động của kitinaza. ..................................................................... 19
1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của kitinaza. ........................... 20
1.2.4 Các nguồn thu nhận kitinaza ....................................................................... 21
1.2.5 Ứng dụng của kitinaza.[9, 24].................................................................... 24
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 26
2.1 VẬT LIỆU ..................................................................................................... 26
2.1.2 Hố chất, dụng cụ ....................................................................................... 26
2.1.3 Mơi trường .................................................................................................. 27

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

3

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 30
2.2.1 Phân lập vi khuẩn ....................................................................................... 30
2.2.2 Xác định khả năng sinh kitinaza. ................................................................. 31
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào ....................................................... 32
2.2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh kitinaza của các
chủng lựa chọn. ................................................................................................... 33
2.2.5Xác định khả năng kháng nấm. .................................................................... 34

2.2.6 Một số đặc tính sinh học của các chủng lựa chọn ....................................... 34
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 36
3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA ................................................ 36
3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KITINAZA
CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN ....................................................................... 39
3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy .................................................................... 39
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ .............................................................................. 40
3.2.3 Ảnh hưởng của pH ...................................................................................... 43
3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .................................................................. 46
3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản ............................................................. 49
3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU ....................... 50
3.4 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU ................................ 51
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 55
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 60

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

4

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
MỞ ĐẦU
Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lƣợng nhiều nhất và có khả năng chuyển
hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay ngƣời ta khai thác nhiều enzym
từ vi sinh vật và đƣợc ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn
khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ƣu
điểm nhƣ hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn

(chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền và có thể sản xuất hồn tồn theo qui
mơ cơng nghiệp. Nhiều enzym đƣợc khai thác từ vi sinh vật đƣợc tập trung nghiên
cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua nhƣ proteaza, amylaza, cellulaza,….
Những năm sau này ngƣời ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzym khác đó là
kitinaza, đây là enzym thủy phân kitin.
Kitinaza rất phổ biến trong cuộc sống và đƣợc tìm thấy ở các lồi bao gồm vi
khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Kitinaza phân huỷ kitin, đó là
polysaccarit dồi dào thứ hai trong tự nhiên sau khi xenlulơzơ. Do đó, kitinaza rất
quan trọng để duy trì một sự cân bằng giữa cacbon và nitơ bị mắc kẹt trong kitin,
dạng khơng hịa tan.
Vì vậy, kitinaza là cơng nghệ sinh học lớn đang rất đƣợc giới khoa học quan
tâm bởi các lý do: thứ nhất, các enzym này có thể đƣợc sử dụng để chuyển đổi phế
liệu giàu kitin thành các sản phẩm hữu ích; thứ hai, có thể khai thác kitinaza dùng
cho sự kiểm sốt của mầm bệnh nấm và cơn trùng; thứ ba, kitinaza chất ức chế
khả năng tăng trƣởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh và côn trùng bệnh dịch
hạch cần kitinaza cho sự phát triển bình thƣờng. [12, 19]
Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những nƣớc có điều kiện thiên nhiên ƣu
đãi đặc biệt cho ngành ni trồng thuỷ sản. Trong những năm qua đã có những

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

5

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
phát triển vƣợt bậc và song song với sự phát triển đó, hàng năm các nhà máy chế
biến thuỷ sản của nƣớc ta thải ra một lƣợng phế liệu giàu kitin khá lớn. Nguồn phế
liệu thuỷ sản này một phần đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc số còn lại chỉ một

phần nhỏ sử dụng để sản xuất kitin còn chủ yếu thải ra gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Vì
vậy nghiên cứu cơng nghệ tạo ra các sản phẩm hữu ích từ nguồn phế liệu này là
một vấn đề khơng chỉ có ý nghĩa lí luận mà cịn có ý nghĩa thực tiễn rất thiết thực.
Tuy nhiên việc ứng dụng kitin và kitinaza cho sản xuất các sản phẩm có ý nghĩa là
một việc không mấy dễ dàng. Dù kitin đƣợc sản xuất hàng năm với con số lớn
nhƣng khó tinh chế bởi sự có mặt của prơtêin và CaCO3. Thêm vào đó trong q
trình xử lý cần trung hồ bằng bazơ hoặc axit, q trình tẩy rửa gây ơ nhiễm mơi
trƣờng nƣớc. Vì vậy sử dụng quá trình sinh học để tách chiết kitin là điều hết sức
cần thiết [40]. Thêm vào đó vi sinh vật phân giải kitin thì có nhiều nhƣng việc phân
lập và xác định hoạt tính kitinaza của chúng cịn nhiều khó khăn đặc biệt là việc
xác định các điều kiện tối ƣu. Trong quá trình xác định hoạt tính có rất nhiều yếu
tố ảnh hƣởng, đồng thời khoảng giới hạn hoạt động của các yếu tố ảnh hƣởng đó
thƣờng lớn và thay đổi ở mỗi lồi vi sinh vật.
Với ý nghĩa thực tiễn đó tơi thực hiện đề tài “ Phân lập một số vi khuẩn có
hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym” nhằm góp phần cung
cấp thêm vào bảo tàng giống một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao,
nghiên cứu một số đặc tính của chúng để có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất
tạo ra các chế phẩm vi sinh có hiệu quả cao mang lại lợi ích cho con ngƣời.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

6

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƢỢC VỀ KITIN
1.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên

Kitin là một polysaccarit tồn tại trong tự nhiên với sản lƣợng rất lớn (đứng
thứ 2 sau xenlulôzơ). Kitin rất phổ biến trong tự nhiên và nó đƣợc tìm thấy nhƣ
một vật liệu cấu trúc của các loài sinh vật sống hiện nay [41].
Ở một số động vật nguyên sinh có tiêm mao, roi và amip kitin cấu tạo nên vỏ bào
xác. Một số tảo (nhƣ tảo silic, tảo cát) và nấm (nhƣ Candida albicans, Neurospora
crassa,…) kitin là thành phần chính của thành tế bào. Động vật khơng xƣơng
sống nhƣ giun trịn, chân đốt, thân mềm và côn trùng,…kitin là thành phần chủ yếu
của bộ xƣơng ngoài. Trong động vật bậc cao monome của kitin là một thành phần
chủ yếu trong mơ da nó giúp cho sự tái tạo và găn liền các vết thƣơng ở da. [29,
44]
Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tơm, cua, ghẹ hàm lƣợng kitin khá
cao. Vì vậy, vỏ tơm, cua, ghẹ thƣờng là ngun liệu chính để sản xuất kitin.
Kitin có khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp, là tập hợp các
monosaccarit ( N-acetyl- β-D-glucơzamine) liên kết với nhau bởi cầu nối glucơzit
và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa, rất hiếm khi kitin tồn tại ở
trạng thái tự do và hầu nhƣ luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị với các prôtêin,
CaCO3 và các hợp chất phản ứng khác.[29, 44]
Về mặt lịch sử, kitin dƣợc Henry Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811
trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Năm 1823 Galier phân lập đƣợc một chất từ
bọ cánh cứng mà ông gọi là kitin.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

7

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.

1.1.2.1. Cấu trúc của kitin.
Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc ngƣời ta
thấy kitin là một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin đƣợc tạo lên bởi
mối liên kết β (1-4) glicozit với cơng thức tổng qt (C8H15O5N)n. Các chuỗi kitin
riêng rẽ có thể dạng xoắn vì mỗi phân tử đƣờng bị đảo ngƣợc so với những phân
tử đƣờng cạnh, dẫn đến sự ổn định về cấu trúc của chúng. [15]
Hơn nữa, cấu trúc của kitin gần giống với xenlulozơ, chỉ khác tại vị trí C2
nhóm (- OH) trên mỗi monome đƣợc thay bằng nhóm acetyl amin (- NHCOCH3).
Chính sự khác biệt này đã tăng cƣờng liên kết hiđrô giữa polyme liền kề, do đó
tăng độ bền trong ma trận kitin. Cấu trúc hố học kitin đƣợc thể hiện qua hình 1.

Hình 1. Cấu trúc hoá học của kitin
Bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X ngƣời ta đã chứng minh đƣợc kitin có ba dạng
cấu trúc dị hình là α, β và γ- kitin trong đó dạng phổ biến nhất là α - kitin. Các
dạng này của kitin do sự sắp xếp khác nhau về hƣớng của mỗi mắt xích (N- acetyl-

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

8

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
D glucozamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích bằng mũi tên sao cho
phần đầu của mũi tên chỉ nhóm (- CH2OH), phần đi mũi tên chỉ nhóm ( NHCOCH3), thì các cấu trúc α, β và γ kitin đƣợc mô tả nhƣ sau.[13, 28, 36, 45]
Dạng α- kitin

Dạng β- kitin

Dạng γ- kitin

Dạng α- kitin đƣợc tìm thấy trong khoang của thuỷ tức,bộ xƣơng ngồi của động
vật chân đốt, vỏ giun trịn, răng bào của động vật thân mềm. Do cách sắp xếp nhƣ
vậy, ngồi có liên kết hiđrơ trong mỗi lớp cịn có liên kết hiđrơ giữa các lớp, sự sắp
xếp theo nguyên tắc đối song song đó đã tạo ra tấm kitin rất bền vững. Dạng βkitin tìm thấy trong tảo silic, bộ xƣơng ngồi cơn trùng, kén và là thành phần chính
của thành tế bào nấm, vỏ động vật thân mềm và một số động vật chân đốt . Dạng γkitin là hỗn hợp của hai dạng α và β- kitin có trong dạ dày của mực ống, hai dạng β
và γ- kitin sắp xếp chiều các monome khác biệt so với dạng α- kitin nhƣ miêu tả
trên dẫn đến là dạng kém bền và dễ thối hố.
1.1.2.2 Đặc tính của kitin.[29]
Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, khơng mùi, không vị, không tan
trong nƣớc, trong môi trƣờng kiềm, axít lỗng và các dung mơi hữu cơ nhƣ rƣợu,
ete,…nhƣng tan trong một số dung dịch kiềm đặc nóng.
Kitin ổn định với chất ơxi hố mạnh nhƣ thuốc tím( KMnO4) ôxi già (H2O2), nƣớc
ja ven,…lợi dụng tính chất này ngƣời ta sử dụng các chất oxi hoá trên để khử màu
cho kitin.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

9

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40-50%) ở nhiệt độ cao kitin bị
mất gốc acetyl và trở thành kitosan hoặc trong dung dịch HCl đậm đặc kitin bị cắt
mạch thu đƣợc glucozamin.
Kitin dễ dàng bị phân huỷ bằng việc phân cắt liên kết glicôzit dƣới tác dụng
của kitinaza đƣợc tiết ra bởi một số vi sinh vật, thực vật và động vật. [7, 16, 2014]

Kitin
Kitin Deacetylaza

Kitinaza

(GlcNAc)2

Kitosan

N- Acetyl Glucozamindaza

kitosanaza

GlcNAc

(GlcN)2

Deacetylaza

Glucozamindaza

GlcN
Hình 2: Con đƣờng phân giải kitin

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

10

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

1.1.3 Ơ nhiễm mơi trường có nguồn gốc kitin
Xuất khẩu thuỷ sản đã và đang là ngành kinh tế thu đƣợc lợi nhuận cao
không chỉ cho nền kinh tế nƣớc ta mà còn cho nền kinh tế thế giới. Tuy nhiên,
một thực trạng đáng báo động hiện nay là song song với sự gia tăng kinh tế
thì vấn đề ơ nhiễm mơi trƣờng do chất thải rắn (vỏ tôm, cua, ghẹ…) của các
nhà máy chế biến thuỷ sản xuất khẩu thải ra môi trƣờng cũng tăng lên đáng
kể.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam,
chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lƣợng tôm năm
2003 là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng,
phế liệu tơm có thể lên tới 40 – 70% khối lƣợng nguyên liệu. Tƣơng ứng với
sản lƣợng tôm hàng năm sẽ có khối lƣợng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ
tôm đƣợc tạo ra. Biết rằng các chất gây ô nhiễm mơi trƣờng ở đây có nguồn
gốc kitin vẫn lƣu trữ giá trị kinh tế lớn nên bất chấp hậu quả vì thu lợi trƣớc
mắt đã mọc lên nhiều cơ sở sơ chế vỏ đầu tôm địa phƣơng.
Qua thực tiễn cho thấy, những khu vực có cơ sở chế biến vỏ đầu tơm,
mọi ngƣời dân đều bất bình vì ơ nhiễm nguồn nƣớc và bầu khơng khí. Nguồn
nƣớc bị ơ nhiễm bởi các chất nhƣ protein, khoáng và cả hoá chất HCl hay
NaOH,.. đƣợc thải ra trong quá trình chế biến. Bầu khơng khí bị bao trùm bởi
mùi hơi tanh của nguyên vật liệu khiến cho ngƣời dân ở đây thƣờng xuyên
phải nín thở thậm chí phải di tản ngƣời già và trẻ nhỏ.
Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công
nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu quả lƣợng phế liệu
tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra
sản phẩm có giá trị cao nhƣ kitin.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

11

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin
Các nguồn thƣơng mại chính cho sản xuất kitin là phế liệu giáp xác.
Tuy là nguồn phong phú nhƣng trong q trình sản xuất có những hạn chế
nhƣ nhanh hỏng, sản xuất theo mùa và quá trình phân hủy thƣờng xảy ra
trƣớc khi có thể sử dụng. Hơn nữa bằng phƣơng pháp hố học để điều chế
kitin có hiệu suất cao nhƣng trong q trình xử lí cần sử dụng các axit mạnh
nên đã gây ô nhiễm môi trƣờng. Do vậy sử dụng enzym điều chế tuy hiệu suất
có thấp hơn nhƣng rất thân thiện với môi trƣờng nên đƣợc nghiên cứu để áp
dụng [37]. Hiện nay thế giới và Việt Nam vẫn sản xuất kitin theo phƣơng
pháp hoá học và dƣới đây là một trong những phƣơng pháp tiêu biểu và phổ
biến.
1.1.4. 1 Quy trình sản xuất kitin của Hackman [17]
Vỏ tôm hùm đƣợc rửa sạch và sấy khơ ở 1000C; tiếp theo đƣợc khử
khống bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5giờ
đem rửa trung tính và sấy khơ ở 1000C, và đem xay nhỏ. Ngâm tiếp trong
dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng.Sau 48 giờ đem ly tâm
thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch
NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã. Sau
đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem
ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly
tâm với các chất theo thứ tự : nƣớc, etanol và ete. Sau đó làmkhơ ta đƣợc sản
phẩm dạng bột màu kem. Quy trình dừng lại đến sản phẩm là chitin.

1.1.4.2 Phương pháp điều chế kitin của Capozza [34]

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

12

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Cân 149g nguyên liệu vỏ tơm sạch cho vào bình khuấy với một máy
khuấy, thêm từ từ 825ml HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 400C trong
thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau q trình khử khống
đƣợc rửa sạch bằng nƣớc đến pH = 7. Xác định hàm lƣợng tro 0,4 - 0,5%. Sau
đó sản phẩm đƣợc khuấy ở nhiệt độ phịng với 1500ml axit fomic HCOOH
90%, để qua đêm. Hỗn hợp đƣợc lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nƣớc
nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản phẩm sạch sau đó đƣợc ngâm ngập trong 2
lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 900C - 1000C trong 2,5 giờ. Dung dịch
đƣợc lọc và rửa sạch với nƣớc đến pH = 7, sau đó sản phẩm đƣợc tráng
rửa lại trong êtanol 960 và ête, sấy khô ở 400 C. Khối lƣợng kitin khô sạch thu
đƣợc là 66g hiệu suất 44,3%.
1.1.4. 3 Quy trình sản xuất kitin của tác giả Trần Thị Luyến [1,2]
Vỏ tôm khô hoặc tƣơi đƣợc loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1
trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa trung
tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách prôtêin lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở 900950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ
w/v=1/2, ở nhiệt độ phịng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách prôtêin lần
2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở 900- 950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến
hành khử khoáng lần 3 cũng giống nhƣ lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem

làm khô thu đƣợc chitin.
1.1.5 Một số ứng dụng của kitin.
Kitin có mặt ở khắp mọi nơi, tham gia vào nhiều quá trình sinh học khác nhau
trong tự nhiên. Dựa vào đặc tính của nó, đặc biệt tạo các dẫn xuất nhƣ kitosan,
glucozamin con ngƣời đã có rất nhiều ứng dụng trong hầu hết mọi lĩnh vực.
1.1.5.1 Trong công nghiệp.[23]

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

13

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Kitin đƣợc sử dụng trong nhiều quá trình nhƣ sử dụng để tinh chế nƣớc, là
một chất phụ gia làm bền thực phẩm và thuốc. Sử dụng nhƣ một chất gắn trong
thuốc nhuộm và chất kết dính. Các màn phân tách và nhựa trao đổi ion trong cơng
nghiệp có thể đƣợc làm từ kitin. Nhiều loại mỹ phẩm, kitin đƣợc dùng nhƣ chất
phụ gia.
Tƣơng lai, kitin có tiềm năng ứng dụng trong những tế bào thu năng lƣợng mặt
trời và màn hình điện thoại di động. [30]
1.1.5.2 Trong nông nghiệp.
Hầu hết các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng kitin là một chất cảm ứng tốt
cho cơ chế bảo vệ trong cơ thể thực vật, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch. Nó cũng đã
đƣợc đánh giá nhƣ là một phân bón có thể cải thiện năng suất cây trồng tổng
thể. [19, 26, 27]
…
1 .1.5.3 Trong y học.
Do đặc tính của kitin đƣợc dùng làm chỉ phẫu thuật, chữa lành vết thƣơng.

Đặc biệt, vì một số tính chất khác thƣờng, kitin giúp đẩy nhanh tốc độ hàn gắn vết
thƣơng ở ngƣời.
Ngoài ra kitin đƣợc dùng trong sản xuất gạc chống khuẩn, y phục bệnh viện,
túi đựng máu nhân tạo, chất ức chế khối u, điều chỉnh lƣợng cholesteron trong
máu.
…

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

14

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
* Một số ví dụ cụ thể ứng dụng kitin hay dẫn xuất kitin trên trế giới và Việt
Nam.
- Sử dụng kitin “kẹp” ion kim loại tại Nhật.
Tại Nhật kitin đƣợc sử dụng trong công nghiệp xử lí nƣớc thải để loại bỏ ion
kim loại nhờ kitin có thể tạo phức với ion.

Hình 3: Phân tử kitin kẹp ion Niken
-

Băng cứu thương tại Châu Âu có nguồn gốc kitin.
Kitosan dẫn xuất của kitin có đặc tính giúp máu đơng nhanh chóng, gần đây đã

đƣợc phê duyệt tại Hoa Kỳ và Châu Âu để sử dụng trong băng và các phƣơng tiện
cầm máu khác. Cả Mỹ và Anh đã sử dụng các băng kitosan cầm máu trên chiến
trƣờng Iraq và Afghanistan.

-

Nước Nga sản xuất thuốc trị bỏng ngồi da có nguồn gốc kitin.

-

Việt Nam sản xuất màng bọc bảo quản rau, quả,…có nguồn gốc kitin.

-

Viện KH-CN Việt Nam đã chế tạo thành công vật liệu “nano Chitosan” kích
thích tăng năng suất cây trồng.

-

Glusivac và Chitoszan tại Việt Nam.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

15

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Việt Nam nào có chịu thua, thế giới có Glucozamin thì Việt Nam có Glusivac
chun đặc trị thối hố khớp, bên cạnh đó cịn có thuốc giảm béo cho "chị em" là
Chitozan.
…
1.2 SƠ LƢỢC VỀ KITINAZA

1.2.1 Phân loại kitinaza.
Kitinaza, enzym ngoại bào, nằm trong hệ thống các enzym thủy phân
(glycosyhydrolaza) có khả năng thuỷ phân liên kết β- 1,4- acetyl -glucozamin
thành các đơn phân là glucozamin và các tiểu phần tử là các oligosaccarit.
Kitinaza thƣơng phẩm có giá rất đắt, đặc biệt là kitinaza đã tinh sạch.Vì thế việc
sử dụng enzym thơ trở thành thay thế thú vị trong việc tạo ra glucozamin
và các oligosaccarit cónguồn gốc kitin.
* Dựa vào cấu trúc phân tử Henrissat và Bairochđã phân loại kitinaza vào 2 họ
glycohydrolaza thứ 18 và 19 [ 18]
Họ glycohydrolaza 18 là họ kitinaza lớn nhất với khoảng 180 chi, có hoạt tính
mạnh và có cấu trúc xác định gồm 8 xoắnα/β cuộn tròn, gặp ở nhiều loại sinh vật
từ nhân sơ đến nhân thật. Enzym thuộc họ này hoạt động thông qua một cơ chế
kiểm sốt trong đó các đoạn β polyme bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anome.
Kitinaza thuộc họ này thuỷ phân mối liên kết GlcNAc-GlcNAc và mối liên kết
giữa GlcNAc-GlcN
Họ glycohydrolaza 19 có khoảng 130 chi,

gặp ở thực vật bậc cao và

Streptomyces gricues.Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn, kitinaza

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

16

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
thuộc họ này đƣợc ví nhƣ lyzôzym và kitosanaza. Chúng hoạt động thông qua cơ

chế nghịch chuyển và thủy phânmối lien kết GlcNAc-GlcNAc và GlcN-GlcNAc
* Dựa vào trình tự axit amin kitinaza chia thành 5 lớp. [31]
Lớp I: là những đồng phân enzym trong phân tử có đầu nitơ giàu cystein nối với
tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl. Vùng
giàu cystein có vai trị quan t r ọ n g đ ố i v ớ i s ự g ắ n k ế t e n z y m v à c ơ c h ấ t
k i t i n n hƣng không cần cho hoạt động xúc tác.
Lớp II:là những đồng phân enzym trong phântử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cystein ở đầu nitơ và có trình tự axit amin tƣơng tự kitinaza ở
nhóm I.
Lớp III: Trình tự axit amin hồn tồn khác với kitinaza lớp I và II.
Lớp IV: là những đồng phân enzym có 4 1 – 4 7 % t r ì n h t ự a x i t a mi n ở t â m
xúc tác của chúng tƣơng tự kitinaza lớp I, phân tử cũng có đoạn
g i à u c ys t e i n n h ƣ n g k í c h t h ƣ ớ c p h â n t ử n h ỏ h ơ n đáng kể so với
kitinaza lớp I.
Lớp V:Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
kitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều.
Họ enzyme 18 xuất hiện ở vi khuẩn, nấm và động vật đƣợc phân loại thuộc lớp III
và lớp V. Hoạt động thuỷ phân liên kết glicozit cùng việc duy trì cấu trúc tại vị trí
cacbon số 1.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

17

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Họ glycohydrolaza 19 bao gồm những kitinaza thuộclớp I, II và IV. Hoạt động
thuỷ phân liên kết glycozit, họ này chỉ thuỷ phân liên kết giữa (GlcNAc– GlcNAc)

hoặc GlcNAc – GlcN).
* Dựa theo cơ chế tác động kitinaza được phân loại thành endo-kitinaza (EC
3.2.1.1.4), exo-kitinaza (EC 3.2.1.14), chitobiaza (EC 3.2.1.30) và β-N-acetyl
hexosaminidaza (EC 3.2.1.52).
Endokitinaza là enzym phân cắt nội mạch kitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn
oligosaccarit. Exokitinaza chia thành N-acetyl-β-D-glucozamindaza và
kitobiosidaza là enzym phân cắt kitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các
monome

N-acetyl-D-glucozamin.

β-N-acetyl

hexosaminidaza



chia

diacetylchitobiose cũng nhƣ chitotriose và chitotetraose tạo các monom N-acetyl
glucosamine. Do vậy β-N-acetyl hexosaminidaza đƣợc gọi là kitobiaza (38).
Một số kitinaza cũng cho thấy hoạt động giống nhƣ lysozym (EC 3.2.1.17 phân cắt
mối lien kết đảo glycozit giữa C1 của axit N-acetylmuramic và C4 của Nacetylhexosamin ở peptidoglycan vi khuẩn [14, 39].
Hoạt tính phân cắt kitin của kitinaza đƣợc thể hiện dƣới hình 2.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

18

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Hình 4. Hoạt tính phân cắt của kitinaza
1.2.2 Cơ chế tác động của kitinaza.
Kitinaza xúc tác phản ứng thủy phân kitin, phân cắt dọc theo
mạ c h c a c b o n v à s ả n p h ẩ m t ạ o t h à n h c h ủ yế u l à kitobiose và kiotriose.
Những chất này sau đó tiếp tục bị phân cắt thành các monome là các N-acetyl- Dglucozamin.
Q trình phân giải kitin đƣợc tóm tắt nhƣ sau :
Kitin → kitobiose, kitotriose → N-acetyl- D-glucozamin.
Sự thủy phân kitin có thể xảy ra theo 2 cơ chế : cơ chế giữ lại các cấu tử βanome trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α đƣợc thể
hiện ở hình 3.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

19

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Hình 5: cơ chế phân giải tại trung tâm hoạt động của kitinaza
1. Cơ chế giữ lại các cấu tử β- monome của kitinaza họ 18
2. Cơ chế chuyển nghịch từ dạng β sang dạng α
1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của kitinaza.
1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ [5]
Hầu hết kitinaza hoạt động ở giới hạn nhiệt độ 200C – 500C. Nhìn chung nhiệt
độ tối ƣu cho kitinaza ở vi sinh vật hoạt động là 300C- 400C, ngoại trừ kitinaza

của Aspergillusnigercó nhiệt độ tối thích là 500C. Các kitinaza thực vật thuộc
nhóm III và kitinaza từ Bacillus licheniformisphân lập ở suối nƣớc nóng cho thấy
khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C. Nhƣ vậy, tùy theo nguồn gốc thu nhận
mà các kitinaza có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau.
1.3.3.2 Ảnh hưởng của pH [5]

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

20

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
PH tối thích của kitinaza từ 4-9 đối với các kitinaza ở thực vật bậc cao và tảo.
Kitinaza ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0.
PH tối thích của kitinaza có thể phụ thuộc vào cơ chất đƣợc sử dụng. Đa số
kitinaza đƣợc nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là glycol kitin
nằm trong khoảng pH kiềm yếu.
1.3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Nếu tăng nồng độ cơ chất đến một giới hạn nhất định hoạt tính của enzym
tăng mạnh, sau đó tiếp tục tăng hoạt tính enzym khơng tăng nữa. Bản chất của
enzym là protein, có cấu hình khơng gian ở trung tâm hoạt động tƣơng thích với
mỗi loại cơ chất nhất định và khi cấu trúc không gian đã bị lấp đầy, hoạt động của
enzym không tăng. Kitinaza cũng không ngoại trừ trong số đó.
1.2.4 Các nguồn thu nhận kitinaza
Kitin bị phân giải bởi kitinaza. Enzym này gặp ở hầu hết các nhóm sinh vật
từ nhân sơ đến nhân thực thậm chí cả virút.
1.2.4.1 Kitinaza từ động vật [10 ]
Kitinaza gặp ở một số động vật nguyên sinh, mô và các tuyến khác nhau

trong hệ tiêu hố của nhiều lồi động vật khơng xƣơng nhƣ ruột khoang, giun trịn,
thân mềm và chân đốt.
Ở động vật có xƣơng sống, kitinaza đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày
của các loài nhƣ: cá, lƣỡng cƣ, chim và thú ăn sâu bọ để tiêu hoá nguồn thức ăn
chứa kitin và chúng chủ yếu đƣợc xếp vào loại endo- kitinaza.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

21

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Kitinaza của côn trùng đƣợc quy định bởi các kích thích tố trong q trình
hình thành ấu trùng. Ở cơn trùng kitinaza có vai trị hết sức quan trọng trong việc
bảo vệ để chống lại các kí sinh nhƣ nấm gây bệnh.
Kitinaza trong động vật giáp xác nhƣ tôm, cua,…chúng đã hoạt động trƣớc
khi quá trình lột xác của nhóm động vật này xảy ra.
1.2.4.2 Kitinaza từ thực vật
Kitinaza đƣợc tìm thấy trong cây ở các bộ phận nhƣ hạt, thân cây, củ, hoa, mô và
liên quan phát triển của cây. Trong cây kitinaza đƣợc sản xuất bởi sự tiếp xúc mầm
bệnh.
Các thực vật bậc cao có kitinaza nhƣ: trong khoai tây, thuốc lá, trái cây, đậu,
cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan,…Chúng đã đƣợc biết đến với vai trò
phòng bảo vệ tránh khỏi các tác nhân gây hại cho cơ thể thực vật. [22].
1.2.4.3 Kitinaza từ vi sinh vật [6, 8, 35]
Trong các nguồn thu nhận kitinaza thì kitinaza từ vi sinh vật là nguồn quan trọng
nhất và cónhiều bằng chứng chỉ ra rằng, kitin là nguồn dinh dƣỡng của hầu hết vi
sinh vật.Phần lớn các sinh vật nhân sơ, trong đó thuộc vi khuẩn phải kể đến nhƣ

Bacilli,

Serratia,Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium,

Vibrio, Arthrobacter,Beneckea, Aeromonas và Streptomyces. Trong
Trichoderma,

Penicillium,

Lecanicillium,

Neurospora,

nấm nhƣ
Mucor,

Beauveria,Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium,
Stachybotrys và Agaricus.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

22

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Trong các vi sinh vật có khả năng phân giải kitin xét về khả năng ứng dụng thực
tiễn phải kể đến Bacillus.
Bacillus thuộc họ Bacillaceae, thuộc bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes.

Theo khoá phân loại của Bergey ( Bergey‟s manual of Sytermatic Bacteriaology,
2nd Edition, 2004), chi Bacillus gồm những vi khuẩn hình que, gram dƣơng, hầu
hết có khả năng chuyển động, hiếu khí hoặc kị khí tuỳ tiện, tất cả đều có khả năng
hình thành nội bào tử. [47]
Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, phần lớn thƣờng cƣ trú trong đất,
thông thƣờng đất trồng trọt. Ngồi ra cịn bắt gặp nhóm này trong nƣớc (ngọt,
mặn) và cả những vùng có điều kiện sống bất lợi (nghèo dinh dƣỡng, sa mạc). Khi
điều kiện sống bất lợi Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử để tồn tại ở dạng
nghỉ và đa số chúng là vô hại. Hầu hết Bacillus là vi khuẩn ƣa ấm, nhiệt độ tối ƣu
cho sinh trƣởng là 300C-450C, PH từ 2-9. Những điều này rất thuận lợi cho việc
phân lập và ni cấy chúng [5].
Khả năng hình thành nội bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng của
Bacillus. Nội bào tử khơng hình thành trong suốt q trình sinh trƣởng, phân chia
tế bào. Chỉ khi mơi trƣờng thiếu dinh dƣỡng hoặc trong điều kiện quần thể tế bào
đã vƣợt qua pha log trong điều kiện nuôi cấy trong hệ thống kín. Sự hình thành bào
tử giúp chúng chống chọi với các điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng nhƣ nhiệt
độ cao, phóng xạ hay các hố chất bất lợi. Gặp điều kiện thuận lợi, các nội bào tử
lại nảy mầm hình thành các tế bào sinh dƣỡng mới.[11]
Trong q trình sống Bacillus có khả năng tiết enzym ngoại bào. Enzym
ngoại bào của chúng rất phong phú bao gồm: Cacbohydrat, proteaza,

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

23

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
penicilinaza,…. Trong đó thƣờng gặp trong

nhóm Cacbohydrat là

amilaza,

cenlulaza và kitinaza [21].
1.2.5 Ứng dụng của kitinaza.[9, 24]
Kitinaza phổ biến ở hầu hết các sinh vật từ nhân sơ đến nhân thật và có mặt ở cả
virus nhóm sinh vật chƣa có cấu tạo tế bào. Dựa vào tính chất

kitinaza đƣợc sử

dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: công nghiệp, nông nghiệp và
thuỷ sản.
Kitinaza phân giải kitin từ các sản phẩm thải vỏ tôm, cua,…thành nguồn nitơ và
cacbon đơn giản đƣợc sử dụng nhiều trong quá trình lên men dùng để sản xuất
protein đơn bào: thức ăn ni cá, gà, lợn, trâu, bị.
Trong nơng nghiệp các chủng vi sinh vật chứa enzyme này đƣợc dùng trong biện
pháp đấu tranh sinh học chống lại nhiều côn trùng và nấm gây hại.
Trong thuỷ sản, các vi sinh vật tiết kitinaza đƣợc sử dụng để sản xuất các chế
phẩm làm sạch các ao nuôi tôm.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam đã và đang nghiên cứu chế phẩm sinh học
chứa kitinaza có tác dụng phân giải sản phẩm thải kitin tăng hiệu quả kinh tế trong
nông nghiệp và chăn nuôi thuỷ sản nhƣ: chế phẩm sinh học BIMA chứa hệ enzym
trong đó có kitinaza của Viện KH-CN thành phố Hồ Chí Minh có tác dụng kháng
nấm và côn trùng gây hại cây trồng, đồng thời tăng khả năng phân giải chất hữu
cơ, tăng năng suất cây trồng.
Mỹ và Anh đã đang sản xuất chế phẩm sinh học diệt trừ mối và đang đƣợc
ứng dụng rộng rãi.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

24

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Trong lĩnh vực nông nghiệp, ngồi tạo các chế phẩm vi sinh kitinaza phịng trừ
các yếu tố gây hại, con ngƣời đã nhân bản gen có hoạt tính kitinaza và với kỹ thuật
chuyển gen để chuyển nó vào cơ thể thực vật để tăng khả năng kháng các tác nhân
gây hại có thành phần kitin. [4, 33]

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học

25

LUAN VAN CHAT LUONG download : add