Nghiên cứu khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn nhằm ứng dụng loại CADIMI từ đất ô nhiễm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

---

---

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
l)ề tài:
NGHIÊN cứu KHẢ NẶNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT

J11ĩ[V1 ệnVienĐai 11 ọc,MỠTĨa Nộ 1

SINH HỌC CỦA VI KHN NHẢM ỦNG DỤNG LOẠI CADIMI

TỪ ĐẤT Ơ NHIỄM

Ngưịi hướng dẫn: TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa
Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Hiền

Lớp: 11.04

Hà Nội- 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ

Sinh học, Viện Đại học Mớ Hà Nội đã tận tình giáng dạy và truyền đạt cho em

những kiến thức cơ bán trong 4 năm học tại trường.

Em xin bày tó lịng cám ơn sâu sắc tới TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa, Trướng

phòng Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lăm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệp

quý báu giúpem thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin cảm ơn tập thể cán bộ
Phòng Vi sinh vật dầu mó, Viện Cơng nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em thực tập tại phịng.

Cuối cùng, em xin bày tó lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè những người đã
ln bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hồn thành

khóa luận toi nghiệp.
Hà Nội, ngày....tháng

Sinh viên

Ngơ Thị Hiền

....năm 2015


Ngơ Thị Hiền

Khỏa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC

KÍ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH, ĐỊ THỊ
MỞ ĐÀU............................................................................................................................ 1
PHÀN 1: TƠNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 3
1.1

0 nhiễm cadimi....................................................................................................... 3

7.7.7

Tính độc hại của cadimi..................................................................................... 3

7.7.2

Nguồn thái cùa cadimi........................................................................................4
Tác động cùa cadimi đen môi trường và con người......................................... 5

7.1.3

1.2

Một số phương pháp xử lý cadimi......................................................................... 6

7.2.7

Phương pháp hóa học.........................................................................................6

7.2.2

Xử lý bang phương pháp hóa lý.......................................................................... 6

1.2.3

Phương pháp sinh học......................................................................................... 7

1.3

Chất hoạt hóa bề mặt sinh học........................................................................... 8

1.3.1

Khái niệiỉi L%Ổ/Víltóifl/í)íâl|jáìwfâ'JsỉrtA1Ạí?cMơ..l.ỉÀ.NỘl................................. 8

1.3.2

Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học.......................................................... 8

1.3.3

Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học................................................... 12

1.3.4

ứng dụng cùa chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong đời sống......................... 12

1.3.5

ửng dụng cùa chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lýơ nhiễm Cd............... 13

1.4

Phương pháp xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học........ 14

1.4.1

Vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học...............................14

1.4.2

Các yếu tố ánh hướng đến tống hợp chất hoạt hóa bề mặt sinh học............. 14

1.4.2.1

Anh hướng cùa nguồn carbon..................................................................... 14

1.4.2.2

Ảnh hướng cùa nitơ........................................................................................ 14

1.4.2.3

Anh hướng cùa các yếuto pH......................................................................... 15

1.4.2.3

Anh hưởng cùa các yếutố nhiệt độ................................................................ 15

PHÀN 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúc.................................... 16

2.1

Vật liệu............................................................................................................... 16

2.1.1

Chùng vi khuân.................................................................................................16

2.1.2

Hóa chất và môi trường nuôi cay................................................................ 16


Khóa luận tốt nghiệp
2.2

Ngơ Thị Hiền

. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 17

2.2.1.

Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc và tế hào vi khuẩn................. 17

2.2.2.

Phân loại vi khuân nghiên cứu băng kít chn sinh hố API 50 CHB..... 19

2.2.3.

Phương pháp đánh giá khá năng tạo CHHBMSH cùa các chúng vi khuân

phân lập dựa trên chi so E24....................................................................................... 19
Phương pháp nghiên cứu ánh hướng cùa các điểu kiện môi trường nuôi

2.2.4.

cấy lên khá năng sinh trướng và tạo CHHBMSH...................................................... 19

2.2.5.

Phương pháp loại Cd từ đất ô nhiễm bang CHHBMSH............................. 20

PHẢN 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 20
3.1

.Đặc điểm hình thái của chúng ĐM 26............................................................... 20

3.2.

Kct quả sốc nhiệt............................................................................................... 21

3.3.

Phân loại chúng ĐM 26 bằng kít chuấn sinh hóa API 50 CHB..................... 22

3.4.

Ành hướng của nguồn carbon đến quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH.. 24

3.7.

Đánh giá hiệu quả xử lý đất nhiễm cadimi bng CHHBMSH to ra t chỳng

M 26

33

KẫT LUN....... ãTltttA4tiƠtộirl^i--hôe-MtH---Ni....................... 35

TÀI LIỆU THAM KHÃO..............................

36


KÍ HIỆU VIẾT TẤT

Cd

Cadimi

CHHBMSH

Chất hoạt hóa bề mặt sinh học

EPS

Extracellular polymeric substance (polyme ngoại bào)

HKTS

Hiếu khí tống số

KLN

Kim loại nặng

OD

Optimal Density (mật độ quang)

CMC

Critical micellar concentration (hàm lượng mixen tới hạn)

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


DANH MỤC BẢNG

Bàng 1: Máy móc và thiết bị
Bâng 2: Ket quá thử Kít
Bàng 3 Ket quá phân tích đất

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


DANH MỤC HÌNH, ĐƠ THỊ
Hình 1: Kim loại Cadimi
Hình 2: Chứng teo thận của bệnh itai itai gây ra do sống trong vùng ơ nhiễm Cadimi
Hình 3: Cơng thức cấu tạo cùa trelaloselipid

Hình 4: Cơng thức cấu tạo cùa Sophorolipìd
Hình 5: Cơng thức cúa rhamnolupid
Hình 6: Hình thái khn lạc chùng vi khn 26 trên mơi trường
HKTS 0% NaCI

Hình 7: Hình ánh sốc nhiệt cùa chúng ĐM26
Hình 8: Kết quá thư Kít
Hình 9:Ảnh hưởng của nguồn carbon lên q trình sinh trưởng

và tạo CHHBMSH cùa chung ĐM 26
Hình 10: Kha năng nhũ hóa xylen của chùng DM 26 ở các nguồn Carbon khác nhau
Hình 11: Ảnh hường của các nồng.độ glucose khác nhạụ tới khậ năng sinh trưởng

'L

I Dại học Mơ I la NỘI

và tạo CHHBMSH của chùng ĐM 26.
Hình 12: Khâ năng nhũ hóa với xylcn cùa chung ĐM 26 ở các nồng độ glucose

khác nhau

Hình 13. Ảnh hướng của các nguồn nitơ khác nhau đến khá năng sinh trưởng và tạo
CHHBMSH cúa chủng ĐM 26
Hình 14. Khá năng nhũ hóa xylen cúa chung ĐM 26 trên các nguồn nitơ khác nhau
Hình 15. Ánh hưởng cùa nồng độ NH4NO3 tới khả năng sinh trưởng và tạo

CHHBMSH cúa chùng DM 26.
Hình 16. Khả năng nhũ hóa xylen của chúng ĐM 26 với nồng độ NH4NO3 khác
nhau

Hình 17. Ánh hướng của ycu tố pH tới khã năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH cùa

chủng ĐM 26.
Hình 18. Khá năng nhũ hóa xylen của chung ĐM 26 ờ các pH khác nhau


Hinh 19. Ánh hường của nhiệt độ tới khả năng sinh trướng và tạo CHHBMSH

cùa chung ĐM 26
Hình 20. Khà năng nhũ hóa xylen cùa chủng ĐM 26 ớ các nhiệt độ khác nhau

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


MỞ ĐÀU
Kim loại nặng (Cd. Pb. Cr, Zn. Cu, Hg,...) từ q trình sán xuất cơng

nghiệp, nơng nghiệp, khai khống, luyện kim. sàn xuất tái chế đo dùng bàng kim
loại gây tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và mơi trường sống. Những kim
loại này tích tụ trong môi trường và xâm nhiễm vào cơ thế con người thơng qua hơ

hấp, tiêu hóa, da gây nên một số bệnh về đường hô hấp, ung thư da, ung thư phổi,
nhuyễn xương, rối loạn đường tiết niệu, viêm cầu thận.... Một số kim loại (Ca, Mg.

Fe, Zn) là yếu tố vi lượng cần thiết cho sự sống, tuy nhiên cũng có những kim loại
(Cd. Hg, Pb...) khơng cần thiết cho sự sống mà gây hại đến sức khóc con người

cũng như các sinh vật khác.
Hiện nay, có nhiều phương pháp xừ lý Cd như phương pháp kết túa hóa

học, phương pháp hấp phụ, phương pháp trao đôi ion,...Tuy nhiên, các phương

pháp này thường gây ra ô nhiễm thứ cấp và chi phí hoạt động lớn. Gần đây. phương
pháp xứ lý ô nhiễm kim loại nặngnói chung và Cd nói riêng bang chất hoạt hóa bề
mặt sinh học (CHHBMSH) do vi sinh vật tạo rathu hút được sự quan tâm nghiên
cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. CHHBMSH là hợp chất

sinh học chứa hai nhóm chức ưa nước và kị nước trong cùng một phân tử. Do đó,

CHHBMSH có thế làm giâm sức căng bề mặt và lực hút tĩnh diện ở bề mặt tiếp xúc

giữa hai pha (lịng-lóng; lỏng-rẳn); giúp chúng dề dàng tiếp xúc và tạo phức với kim
loại nặng.

Phương pháp này được đánh giá cao bời ưu điếm: giá thành phù hợp. xử lý

triệt đê, an tồn với mơi trường dokhà năng phân hùy sinh học nên không gây ô

nhiễm thứ cấp, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH và chịu lực ion tốt.
Cùng với chì và thúy ngân, cadimi (Cd) là kim loại nặng độc hại đối với

con người và môi trường sống. Vì vậy,chúng tồi tiến hành nghiên cứu đề tài
“ Nghiên cứu khã năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học cùa vi khuân

nhằm ứng dụng loại cadimi từ đất ô nhiễm”


❖ Mục tiêu nghiên cứu:

- Nghiên cứu các yếu tố ánh hường đến quá trình sinh trường và tạo

CHHBMSH cùa chung vi khuẩn.

- Đánh giá khả năng loại cadimi (Cd) trong đất ô nhiễm bàng
CHHBMSH tạo ra bời chung vi khuấn nghiên cứu.

2


PHẦN 1: TĨNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Ơ nhiễm cadinii
1.1.1

Tính dộc hại của cadimi

Cadimi (ten Latin là Cadimium, viết tắt là Cd) là nguyên tố hóa học thuộc

nhóm IIB trong báng hệ thống tuần hoàn Mendeleev; số thứ tự nguyên tư là 48;
khối lượng nguyên tứ là 112,41; khối lượng riêng là 8,65 g/cm3; có màu trắng xanh,

mềm dẻo, dề uốn, khơng hịa tan trong nước và khơng dễcháy. Tuj' nhiên, ờ dạng
bột nó có thể đốt cháy và tạo ra khói độc[33].

Cadimi đã được phát hiện ra năm 1817 bời Friedrich Stromeyer và Karl
Samuel Leberecht Hermann[19].Cadimi phân bố rộng rãi trên bề mặt trái Đất, nồng
độ trung bình của Cd trong lớp vó Trái Dất là khống 0.1-0,5 ppm.

Hình 1. Cadimi
Cadimi là một tạp chất phổ biến trong quặng kẽm. một số quặng suníuakẽm
chứa tới 1,4% Cd.Vì vậy, Cd được xem như một sản phẩm phụ từ việc khai thác,
tinh luyệnquặng sunfua kẽm[39].

Nhiều nghiên cứu gan đây cho thấy, Cd là một trong những kim loại nặng
nguy hiềm nhất đối với cơ thế con người. Nguyên to này cùng với các hợp chất của

3


nó là những chất cực độc,với nộng độ rất thấp chúng sẽ tích lũy trong cơ thế và gây
độc cho tế bào. Cadimi tích lũy sinh học trong cơ thề ánh hường đến quá trình cố

định Ca, gây nên chứng bệnh lỗng xương, mục xương và phá húy túy xương.
Cadimicó khá năng thay thế Zn ờ một so enzyme, làm thay đối cấu trúc và chức

năng cùa enzyme gây rối loạn tiêu hóa.

1.1.2

Nguồn thủi của cadiini
Trong tự nhiên: Cd có sẵn trong đất,đất bat nguồn từ đá núi lứa có chứa

lượng Cd 0,1-0,3 mg/kg, đá ngầm chứa 0,3-11 mg/kg. Nhìnchung, Cd trong đất có
nong độ dưới lmg/kg, ngoại trừ đất ở những nơi bị ơ nhiêm hoặc đất hình thành

trên những đá mẹ với lượng Cd cao bất thường; qua q trình rứa trơi, xói mịn và
tích tụ nên hàm lượng Cdtrong dất cao.

Trong công nghiêp: Ngành công nghiệp khai thác khống sản-quặng, luyện

kim, hàn hoặc từ các ngành cơng nghiệp khác như pin NiCd. xi mạ. bột màu và chất
dẻo,...là nguồn thãi chính gây ơ nhiễm cadỉmi. Một số nguồn khác hình thành Cd

trong khơng khí như việc dốt nhiên liệu hóa thạch (than đá. dầu mở), đốt rác thái
cùa thành phố (nhựa .pin nickel-cadmium,...) cũng thải ra ngoài khơng khí một

lượng lớn cadimi.
Trong nơng nghiệp: Sử dụng phân phosphate hóa học chứa hàm lượng Cđ

caođã và đang trở thành nguồn gây ô nhiễm Cd cho đất và nước nông nghiệp. Hàm
lượng Cd trong đất sử dụng phân phosphate tăng từ 0,07 đến lOmg Cd /kg đất

trồng.
Một số nguồn khác:Từ bùn thài sinh hoạt, Cd tích lũy trong nước cống, bùn

dược thài ra trong quá trình sinh hoạt hàng ngày.
Khi đã có mặt trong mơi trường đất, Cd dễ dàng xâm nhập vào chuỗi thức

ăn và các loại cây ngũ cốc và rau. Tại Nhật Băn, nhiều báo cáo cho thấy các bệnh
nhân hấp thu khoáng 600pg Cd mồi ngày do ăn gạo bị nhiễm Cd bởi nông dân sử

dụng nước sông Jintsude tưới tiêu, con sông này bị ô nhiễm bới quặng và xi từ một
nhà máy chế biến Cd|22 ].

4


1.1.3

Tác động của cadimi đến môi trường và con người
❖

Tác động đên môi trường

Nồng độ Cd trong đất vượt ngưỡng cho phépsẽ gây ảnh hưởng đến quá
trình sống cùa các vi sinh vật sống trong đất và đc dọa hệ sinh thái. Trong các hệ

sinh thái thủy sinh Cd có thể tích tụ trong trai, sị, tơm, tơm hùm, cá,... Sinh vật

nước mặncó khă năng chống chịu với hàm lượng Cd trong môi trường cao hơn các
sinh vật nước ngọt.
❖

Tác động đến con người

Cadimi ánh hướng tiêu cực tới CO' thế con người, nó gây ra ung thư và tác
động tới hầu hết các hệ cơ quan trong cơ thế: tim mạch, thận, mắt, cơ quan sinh

sản,hệ miền dịch, hệ thần kinh,...Khi di vào cơ thê, Cd sẽ tác dộng tới thận đầu

tiên; nguyên tố này tích tụ chú yếu ờ thận; sự tích tụ này có thề dẫn đến rối loạn
chức năng ống thận.Với hàm lượng cao dẫn dến rối loạn trong chuyến hóa Ca hình

thành sỏi thận, thiếu máu và phá húy tủy xương[3] [38] [39].

Ngoài ra, Cd cũng liên quan đến ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú. những
người tiếp xúc thường xuyênvới nơi bị phơi nhiễm Cd có thế bị mềm xương và

lỗng xương.Tại Nhật Bàn. nhiễm độc Cddẫn đến bệnh về xương; biểu hiện cũa

bênh này là xương trờ nên giòn, dề gẫy, hội chứng này đã khiến hàng trăm người từ
vong. Khi hít phải khói hoặc bụi chứa Cd có thể dẫn đến một loạt các triệutrửng như

dau đầu. khó thờ. đau ngực, ho có đờm lần máu hoặc có bọt và yếu cơ, nếu nghiêm

trọng sẽ bị phù phổi và có thế dẫn tới tử vong (thường là do hòng thận)[3].
Trong một diếu thuốc lá có chứa khoảng 1,5- 2.0 mg Cd và người hút thuốc

hít vào 10% lượng Cd này, hút một gói thuốc lá một ngày làm tăng gấp đơi lượng
Cd đi vào cơ thể. Nuốt phải một lượng nhó Cd có thể gây ngộ dộc và tổn
thương gan và thận. Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về ung thư (IARC) cũng cho biết

Cdlà một trong những chất gây ung thư ờ người; Cd và hợp chất cùa nó được được

xếp vào nhóm 2A (nhóm tác nhân hoặc hổn hợp có thế gây ung thư cho người).

5


Hình 2. Thận của bệnh nhânnhiễm cadimi.

1.2 Một số phương pháp xử lý cadimi
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xử lý ơ nhiễm kim loại nặng nói chung
vàCd nói riêngnhư hóa học, hóa lý và sinh học
1.2.1

Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phương pháp dùng các tác nhân hóa học để loại bó

hoặc chuyển hóa (làm thay đồi bàn chất) kim loại nặng trong nước thái.

1.2.2

Xử lý bằng phương pháp hóa lý
Các phương pháp hóa lý được sứ dụng pho biến hiện nay như phương pháp

kết túa hóa học, trao đồi ion, oxy hóa-khử, hấp phụ.
❖

Phương pháp kết túa hóa học

Phương pháp này dựa trên phàn ứng hóa học giữa chất đưa vào đất với kim

loại cần tách, ớ pH thích hợp tạo thành hợp chất kết túa, đây là phương pháp nhằm
hạn chế sự linh động của kim loại nặng trong đất.Dối với mỗi loại kim loại khác
nhau thìpH thích họp để kết túa là khơng giống nhau. Khi pH cùa đất lớn hơn 6.5,

dất trung tính hoặc kiềm do bón vơi, Cd bị kết tủa dưới dạng CdCOj. khi bón vơi
vào đất sẽ có tác dụng làm giảm tính linh động của Cd, từ đây chúng có thế bị cố

dịnh nên cây trổng khó hấp thu hơn và khà năng gây độc cùa Cd sê giảm di.

6


❖

Phương pháp trao đồi ion.

Phương pháp trao đổi iondựa trên sự tương tác hóa học giữa ion trong pha
lõng và ion trong pha ran. Sử dụng ion là nhựa hữu cơ tổng hợp. các chất cao phân

tử có gốc là hydrocarbon và các nhóm chức trao đối ion. Các vật liệu nhựa này có

thể thay thế được mà khơng làm thay dổi tính chất vật lý của các chất trong dung
dịch.
❖

Phương pháp oxy hóa-khứ.

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự chuyến từ dạng này sang
dạng khác bằng cách thêm electron khứ hoặc bớt đi electron một cặp bởi sự cho
nhận electron. Dựa trên các tính chat vật lý và hóa học cùa đất đe tiến hành phán

ứng oxy hóa- khứ tạo kết tủa làm giâm tính linh động và cố định Cd.
❖

Phương pháp hấp phụ.

Phương pháp hấp phụ là q trình hấp phụ chất ơ nhiễmhịa tan ớ bề mặt

ranh giới giữa pha lòng và pha rắn. Thơng thường q trình hấp phụ là q trình tỏa

nhiệt, tùy theo lực tương tác giữa chat hap phụ và chat bị hấp phụ mà người ta phân
biệt hấp phụ vật lý và hấp phụ hóa học.

1.2.3

Phương pháp sinh học
Hiện nay, người ta đã tìm ra nhiều loại vi sinh vật, thực vật và các chất có

hoạt tính sinh học nham loại bó Cd trong đất.

❖

Sử dụng vi sinh vật:Một số nhóm vi sinh vật có khà năng hấp thu

kim loại nặng.Trong môi trường tự nhiên vi khuẩn Citrobacter sp có khá năng hấp

thu Cd lên tới 170 % so với trọng lượng khô.
❖

Sừ dụng thực vật: Trong những năm gần đây, người ta đã quan tâm

đến công nghệ sứ dụng thực vật xứ lý môi trường ô nhiễm do diện tích ơ nhiễm
ngày càng tăng. Một so loại thực vật đặc biệt có the hấp thu hay tồn tại được với

nơng độ kim loại cao. Dựa vào đặc tính đó, người ta phát triên phương pháp mới đê
giải quyết ô nhiễm đất gọi là “Phetoremediation”, dùng thực vật để giám (hiếu ô

nhiễm kim loại nặng[43]. cỏ Vetiver được biết đến là loại thực vật có sức chong
chịu với Cd trong môi trường đất là rất lớn, cỏ vetiver không chi có khà năng sinh

trướng, phát triền tốt trong đất có hàm lượng Cd từ 10-40ppm, mà cịn có khá năng
hấp thụ và tích lũy Cd trong cây cao[4].

7


❖

Sừ dụngvật liệu sinh học: phụ phẩm nông nghiệp, nhựa sinh học,

sản phẩm do vi sinh vật tạo ra

1.3 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học
ỉ.3.1

Khái niệm chất hoạt hóa hề mặt sinh học
Chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) là những hợp chất có cấu trúc

đa dạng về hoạt tính bề mặt dược tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cá CHHBMSH là

hợp chất lưỡng cực, có cấutạo gom một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường

hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo) có khă năng làm giám

sức căng bề mặt giữa các phân từ[l].Phần ưa nước thường là các nhóm acid amin,
peptide, sacarit đơn. đơi. polysaccarit hay một nhóm phosphat. Phần kị nước thường
là acid béo có mạch carbon dài, no hoặc khơng no]25].

Các CHHBMSH có cấu trúc hóa học và kích thước phân từ khác nhau từ

đơn gián như các acid béo đen phức tạp như hợp chat polymer [33]. Các

CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào phố biến nhất là glycolipid trong đó

carbohydrates được gan liền với một chuồi dài axit béo, trong khi những chất khác
như lipopeptides, lipoprotein,

và heteropolysaccharides phức tạp hơn'25].

CHHBMSH được tạo ra cá ờ trên các cơ chất không tan trong nước lần cà tan trong

nước, nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với mơi trường khơng thuận lợi, độc

hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không hịa tan trong nước[12].
1.3.2

Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học

CHHBMSH là một nhóm rất đa dạng và có cấu trúc hóa học khác nhau, chủ
yếu được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra.
Phân loại dựa vào thành phần hóa học:
❖

Glucolipid: là loại phổ biến nhất của CHHBMSH, nó được nghiên cứu.

ứng dụng nhiều nhất và có hoạt tính mạnh. Glucolipid gồm các loại sau:

•

Trehaloselipid: là một phân từ đường đơi trehalose liên kết ờ vị trí C6

và C6' cúa mỗi glucose với các phân tứ acid mycolic[7],ở các sinh vật khác nhau thì

8


kích thước và cấu trúc cùa acid mycolic, số carbon ngun tử, và mức độ khơng bão

hịa cũng khác nhau.

Hìnhĩ. Công thức cấu tạo cúa trelaloselipid

Nhiều vi sinh vật thuộc thành viên cùa chi Mycobacterium tạo ra các este
trehalose trên bề mặt tế bào[12].MỘt số loại khác của trehalose chứa glycolipids
được sán xuất bởi một số vi sinh vật thuộc nhóm mycolates như Mycobacterium,

Rhodococcus, Arthrobacter, Nocardia và Gordonia\1].
•

Sophorolipid: do một phân từ đường sophorose được liên kết đến một

chuỗi dài axit béo hydroxy, có ự nhặt sáu đến chin sophorosides liên kết kỵ nước

khác nhau được tìm thay trong hỗn hợp CHHBMSH[2()|.Phân tử đường do 2 phân
tử glucose liên kết với nhau, nhóm OH ớ vị trí C6 và C6’ bị acetyl hóa.

Hình 4. Cơng thức cấu tạo cùaSophorolipid

Sophorolipid do nhiều chúng nấm men thuộc chi Torulopsis săn xuất như

T.bombìcola, T. petrophilum, T. apicola và các loài nấm men như Candida

9


Thodotorula bogoriensis, Wickerhantiella domercqiae, và Starmerella

apicola,

bombicola[\ 11.

Rhamnolipid: do phân tứ rhamnoza liên kết với một hoặc hai phân tứ p

•

acid-hydroxydecacnoic, gồm có 4 loại: 2 phân tử đường liên kết với 2 phân tứ
acid, 2 phân tử rhamnose liên kết với 1 phân tử acid, I phân tứ đường liên kết
với 2 phân từ acid, và một phân tử đường liên kết với một phân tử acid[ 15],

Hình 5. Cơng thức của rhamnolupid

❖

Acid béo: là sản phẩm cùa quá trình oxy hóa ankan bời vi khuấn, nấm

men bao gồm các acid béo mạch thắng, acid béo phức hợp chứa nhóm OH và
nhóm ankyl (corynomucolic)[26][29J.
❖

Phospholipid.ỉằ thành phan chính cúa màng te bào vi khuẩn, khi vi sinh

vật sinh trướngtrên các cơ chất là ankan thì hàm lượng phospholipid tăng

mạnh[30].MỘt số chủng có khả năng tạo phospholipid nhưAcnetobacter sp,

Thiobacillus Thioxydans, Athrobacter AK-Ì9, Pseudomonas, Aeruginose 44TI và
Aspergillus spp.
❖

Lipopeptid và lipoprotein.

Chúng Bacillus subtilis ATCC 21332 có khá năng tạo lipolipid có hoạt tính
cao, là một trong những CHHBMSH mạnh nhất. Nó làm giám sức căng bề mặt cùa

nước từ 72mN/m xuống còn 27,9 mN/ni ở nồng độ thấp 0.005%[32]. Hơn nữa, nó
cókhà năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nam. anti mycoplasma và các hoạt
động tán huyết.

10


Mồi phân tứ có chứa 7 acid amin và một phần lipd trong đó gồm có 8-9

nhóm methylene và một hồn hợp tuyến tính và đi phân nhánh [21 ].

❖

CHHBMSH trùng hap:

Hầu hết các CHHBMSH thuộc nhóm polyme là hồn hợp của polysacarid
với protein cao phân tử, chúng là những chất có hoạt tính bề mặt có khối lượng rất
lớn và cấu trúc phức tạp. Các chất nghiên cứu nhiều nhất được tổng họp từ một số
thành phần nồi trội như: emulsan. lyposan. manoprotein và một số phức hợp của

polysacarid và proten khác.
Emulsan do Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (ATCC 31012) tạo ra, đơn

phân của nó chứa một trisacarid liên kết với hai acid béo. Emulsan là một tác nhân

nhũ hóa rất hiệu quã đối với hydrocarbon trong nước thậm chí ở nồng độ thấp 0,001
đến 0.01 %[ 101.

Lyposan tạo ra từ Candida Lypolytica, là một chất nhũ hóa ngoại bào, hịa

tan trong nước, trong cấu trúc cùa nó chứa 17% protein và 83% hydrocarbon, các
hydrocarbon trong lyposan gồm glucose, glactose, galactosamin. acid galactorunic
[23],

Candida tropicals đã sán xuất ra một loại phức hợp manan-acid béo trên
môi trường ankan[10].
Manoprotein sp Sacharomyces cerevisiae taọ ra chứa 44% manose và 17%
protein.

Pseudomonas aeruginosa P-20 tạo ra một peptidoglycolipid chứa 52 acid

amin, 11 acid béo, 1 đường[12].
Cyanobacteria phormidium J-I tạo ra các CHHBM là bioflocculant và

emulcyan[12].
❖

CHHBMSH dạng đặc biệt: là CHHBMSH có cấu trúc dạng hạt, các

khoang ngoài màng tế bào phân chia các gốc HC thành các hạt nhũ tương và các hạt

nhũ này sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thu ankan bời tế bào vi sinh vật.
Một số loài tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocarbon thành từng

phần nhó, đóng vai trị quan trọng trong việc vận chuyến các hydrocarbon vào trong
tế bào. Túi của Acinetobacter sp HO 1 -N có đường kính 20-50 nin và mật độ sôi

11

1,158 g/ cm3 chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharide, chứa 5 phần

phospholipid và khoảng 350 phần polusacarid [24],

1.3.3

Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học

CHHBMSH có một số tính chât hóa học như độc tính thấp, khá năng phân
húy sinh học cao, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH và chịu lực ion tốt[ 12] [281.
❖

Hoạt tính bề mặt.

CHHBM có hoạt tính tốt có thế làm giám sức căng bề mặt của nước từ 72

mN/m xuống 1 mN/m[l].Rhamnolipd làm giám sức căng bề mặt cúa nước xuống
25-30 mN/m và sức căng bề mặt giữa pha nước với hexandecan xuống dưới

ImN/m. Sophorolipid do Torulopsis bomlicoỉa tạo ra làm giâm sức căng bề mặt cùa
nước xuống 33mN/m và làm giảm sức căng bề mặt giữa hai pha nước và

hexandecan xuống 5mN/m[27].
❖

Khả năng phân hủy sinh học và tính độc thấp

So với các chất hoạt hóa bề mặt hóa học(CHHBMHH)thì các CHHBMSH

phân húy dề dàng hon và có tính dộc thấp hơn. Đo không dộc và dề dàng phân húy,
giá thành sán xuất lại rẻ nên chúng được ứng dụng trong các ngành công nghiệp

thực phấm, mỹ phẩm, dược phấm và xứ lý mơi trường.
❖

Sự hình thành nhũ hóa cùa CHHBMSH

Các CHHBMSH khối lượng phân lữ cao có khá năng nhũ hóa tốt hơn các

CHHBMSH có khối lượng phân tư thấp. Các Sophorolipid có khả năng làm giám

sức căng bề mặt nhưng khả năng nhũ hóa khơng cao[ í I ].Ngược lại, các
CHHBMSH tạo ra từ các chung vi khuẩn thuộc chi Acinetobactercó nhũ hóa cao

nhưng khá năng làm giảm sức căng bề mặt thấp.
❖

Đa dạng về cấu trúc hóa học

CHHBMSH là nhóm đa cấu trúc, mồi loài vi sinh vật khác nhau có thể tạo

ra các loại CHHBMSH khác nhau có bàn chất và trọng lượng phân từ khác nhau.
Với sự đa dạng này mà chúng có những đặc tính như tạo bọt. giữ ấm, hòa tan, khá
năng hoạt động bề mặt và khá năng nhũ hóanên CHHBMSH được sử dụng rộng rãi

trong các ngành cơng nghiệp.
1.3.4

ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong dời sống
12


CHHBMSH được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực cơng nghiệp, nơng

nghiệp, khai thác dầu mó, thuộc da, thu hồi dầu, cơng nghệ hóa học, mỹ phấm, dược
phẩm, thực phẩm và y học với đặc tính là nhân tố làm ướt. tạo bọt, hoạt động bề
mặt, nhũ tương hoá.
Trong công nghiệp thực phẩrmSứ dụng làm chất phụ gia thực phẩm

như lecithin và các dẫn xuất của nó, este acid béo chứa glycerol, sorbitan, ethylene
glycol và các dẫn xuất cùa ethyoxylated monoglycerides đượcsứ dụng như là chất
tạo nhũ trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm trên tồn the giới[9].CHHBMSH

được dùng trong sàn xuất bánh mì và các săn phấm thịt, nó ành hường đến đặc tính
cùa bột hoặc nhũ tương của mô mỡ.

Trong công nghiệp mỹ phấm:CHHBMSH cũng đã được sử dụng làm
kem dường da. chất khứ mùi,sàn phấm chăm sóc móng tay và kem đánh

răng,...Sophorolipid được Cơng ty TNHH Kao được xem là một chất giữ độ âm

cho nhãn hiệu mỹ phẩm trang điếm Sofina. Qua quá trình phát triển và lên men đế

sàn xuất sophorolipid, công ty này đã tìm ra được ứng dụng trong các sản phẩm như
son mơi và kem dưỡng ấm cho da và tóc.
Trong y học: CHHBMSH cũng được ứng dụng rất nhiều. Các
Succinoyl-trehaloselipid được tạo ra bởiRhodococcus erythropolishas có khả năng

ức chế virus herpes simplex và virus cúm với liều gây chết là 10 đến 30
pg/ml[34][35]. Sunf'actin là một trong những CHHBMSH có thế ức chế hình thành

cục máu đơng sợi huyết và hình thành các kênh ion trong màng lipid.Một so
CHHBMSH có tính kháng khuân mạnh, kháng nấm và kháng virus, do các câu trúc

đa dạng cua CHHBMSH[42].
CHHBMSH cịn có ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác như

trong lĩnh vực chế biến bột giấy và giấy, than đá, dệt may và chế biến quặng

uranium.

1.3.5

ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lý ơ nhiễm Cd

Ngồi những ứng dụng trên CHHBMSH còn dược sứ dụng trong xừ lý đất
bị ô nhiễm kim loại nặng. Đây là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc

phục hồi đất bị ô nhiễm. Wang và Mulligan (2004) đã đánh giá tính khả thi cùa việc
13


sử dụng bọt Rhamnolipid để loại bò Cd từ đất cát. hiệu quáloại Cd lên tới 73.2%
[37],

Một nghiên cứu khác cho thấy, chúng Serratia sp có khá năng tạo polymer

ngoại bào (EPS), có khã năng liên kết với kim loại, Ig EPS hấp thụ được 170 mg

Cd[36].

1.4 Phuong pháp xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học
1.4.1

Vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa hề mặt sinh học

Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có khá năng tạo CHHBMSH như vi
khuẩn, nấm men, xạ khuẩn,... trong đó vi khuẩn chiếm đa số.Một số vi khuân tạo ra

CHHBMSH nhằm thích nghi với các điều kiện môi trường sống đặc biệt như trong

các bể chứa dầu. đất. trong đại dương [33].
Yakimov và cộng sự( 1995) đã phân lập được chung Bacillus licheniformis

BSA50, có khà năng sinh trướng kị khí trong mơi trường có bo sung glucose và
0.1% NaCl tạo ra CHHBMSH có tên là lichenysin[40].

1.4.2

Các yếu tố ánh hưởng dến tổng họp chất hoạt hóa bề mặt sinh học

1.4.2.1 Anh hưởng của nguồn carbon

Nguồn carbon là một trong những yeu tố quan trọng nhất anh hường đến
quá

trình

sinh

trường

và

tạo

CHHBMSH

của

vi

sinh

vật.Chúng

Pseudomonasaeruginosa tạo ra một chất giống protein trên nguồn hydrocarbon
nhưng không tạo ra trên glucose, glycerol hoặc axit palmitic[18]. Đối với chủng

Pseudomonas aeruginosa khi nuôi cấy trên môi trường chứa glycerol bồ sung thêm
glucose, acetate, succinate hoặc citrate vào mơi trường thì rhamnolipid giám

mạnh[17][18]. Lồi Torulopsis petrophilum khơng sãn xuất bất kỳ một loại
glycolipids nào khi nuôi trên một mơi trường có chứa bất cứ nguồn carbon hịa tan
trong nước[l 1].

1.4.2.2 Anh hưởng của nitơ

Nguồn nitơlà một trong những thành phân không thê thiêu cho vi khuân
sinh tổng hợp CHHBMSH. Đối với chủngA. paraffineu.sis thì CHHBMSH tạo ra
14


nhiều khi thêm các acid amin như acid aspartic, acid glutamic, asparagine, và

glycine vào môi trường nuôi cấy [13].Tương tự, với chúng B. lichenifonnis BAS50
hàm lượng lichenysin-A tăng lên gấp hai hoặc bốn lần khi them L- gutalic và L-

asparagine vào môi trường.

Robert và các cộng sự (1989) đã chứng minh ràng NOj là nguồn nitơ tốt
nhất cho việc sản xuất CHHBMSH ở chung

Pseudomonastrain44T 1 và

Rhodococcus ST-5 sinh trường trên dầu oliu và dầu hòa[31 ].
1.4.2.3

Anh hưởng của các yếu tố pH
Ngồi nguồn cacbon và nguồn nitơ thì các yếu tố pHcũng ảnh hưởng tới

quá trình sản xuất CHHBMSH cùa vi sinh vật.Độ pH của mơi trường đóng một vai
trị quan trọng trong sàn xuất sophorolipid bới chủng T.bombicola[ 141.Khoảng pH

7-9 thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo CHHBMSH củac chủữgBacillus

licheniformis F2.
Powalla và cộng sự chứng minh rằng sản xuất lipid penta và disaccharide

bớiA. corynbacteroidesis giới hạn trong phạm vi pH 6,5 đen 8[ 16].

1.4.2.3

Anh hưởng của các yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố không thế thiếu trong quá trình tạo CHHBMSH của vi
sinh vật. Với chúng A. paraffineus ATTCC19558, Rhodotorua erythropolis và

Pseudomonas .vpDSM-2874 nhiệt độ lại dóng vai trị quan trọng, nó dãn dến sự thay

đối thành phần trong sàn xuất CHHBMSH. Lồi Thermophilic Bacillussp sinh

trường

và

tạo

CHHBMSH

ở

nhiệt

độ

trên

40°C[8].

Bên

cạnh

đó.chủngRhodococcus sp tạo CHHBMSH tốt nhất ở 37°C(Abu-Ruwaida và cộng

sự, 1991)[5][6].

15


PHÀN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1

2.1.1

Vật liệu

Chủng vi khuân
Chúng vi khuẩn DM 26 được lấy từ ngân hàng chung giống cùa phịng Vi

sinh dầu mỏ, Viện cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam. Đây là chung được phân lập từ làng nghề ơ nhiễm kim loại nặng

2.1.2

Hóa chất và mơi trường ni cấy

❖

Hóa chất : Các hóa chất được dùng cho nghiên cứu là các hóa chất tinh

khiết, hầu hết các hóa chất này được cung cấp bời hãng Merck.
Mơi trường nuôi cấy.

❖

* Môi trường nuôi cấy vi sinh vợt hiếu khí tơng số (g/l)
Glucose

1

KC1

0.25

Cao men

0.2

NaCl

10

Cao thịt

3

MgCl2

1.2

Pepton

5

KH2PO4

1

NH4NO3

Thư viện2Viện Đại học Mở HLNoi

20

pH = 7-4-7,2

* Mơi trường khống cải tiến dùng cho vi khuẩn sử dụng hydrocachon

NH4NO3

2

MnSO4

0.002

KH2PO4

2

CaCl2

0.002

Na2HPO4

2

CuSO4

0.002

MgSơị

0.2

FeSO4

0.002

pH=7-r 7.2

16


. Máy móc và thiết bị

2.1.3

Bâng I: Máy móc và thiết bị
Hãng sản xuất

Tên thiết bị

Be ổn nhiệt

Memmert (Đức)

Cân phân tích

Sartorius (Đức)

Kính hiên vi quang học

Labovall (Đức)

Máy đo quang phổ

Sacoman (Pháp)

Máy li tâm

Microcentrifuge (Mỹ)

Máy vortex

Beckman (Đức)

Nồi khứ trùng áp suất cao

Sturdy (Đức)

Túcấyvôtrùng

Việt.Nam
Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội

Máy đo pH

Mettler Toledo (Pháp)

Máy lac

Backman (Đức)

Pipetmen

Gilson (Pháp)

2.2 . Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hình tháikhuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
*

Phương pháp quan sát hình thái khuân lạc vi khuân tạo CHHBM trên môi

trường thạch

Môi trường thạch HKTS 0% sau khi khử trùng trong các bình tam giác

được đồ ra đìa petri vơ trùng (mồi đĩa đổ khoảng 25ml). Sau dó bọc lại cất trong tú

ấm trong vịng 24 giờ kiểm tra mức độ vô trùng. Những đĩa không xuất hiện vi
khuẩn sau 24 giờ dược coi là sạch và sứ dụng đcphân lập.

17