Xây dựng phương pháp LC MS MS ứng dụng xác định họ sulfonamide trong thủy sản

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ BẠCH YẾN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS ỨNG
DỤNG XÁC ĐỊNH HỌ SULFONAMIDE TRONG
THỦY SẢN

Ngành: HĨA PHÂN TÍCH
Mã ngành: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022


Cơng trình được hồn thành tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí ngiệm Thành
Phố Hồ Chí Minh.
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Trọng
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại
học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 07 tháng 10 năm 2022.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS.TS. Lê Văn Tán

- Chủ tịch Hội đồng

2. PGS.TS. Trần Quang Hiếu

- Phản biện 1

3. TS. Nguyễn Quốc Hùng

- Phản biện 2

4. TS. Trần Thị Thanh Thúy

- Ủy viên

5. TS. Nguyễn Quốc Thắng

- Thư ký

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

GS.TS. Lê Văn Tán

PGS.TS. Nguyễn Văn Cường


BỘ CƠNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Bạch Yến ....................... MSHV: 20000481
Ngày, tháng, năm sinh: 31/10/1984 ............................... Nơi sinh: Tỉnh Bình Dương
Chuyên ngành: Hóa phân tích ........................................ Mã chun ngành: 8440118
I. TÊN ĐỀ TÀI:
Xây dựng phương pháp LC-MS/MS ứng dụng xác định họ Sulfonamide trong thủy
sản.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
(1) Khảo sát các thông số của thiết bị LC-MS/MS và xây dựng phương pháp phân tích
họ Sulfonamide trong tơm, cá chẽm và cá tra.
(2) Xây dựng phương pháp xử lý mẫu để xác định họ Sulfonamide trong tôm, cá chẽm
và cá tra bằng phương pháp LC-MS/MS.
(3) Thẩm định phương pháp phân tích trong nền tôm, cá chẽm và cá tra theo hướng
dẫn SANTE/11813/2017 và AOAC.
(4) Thực hiện phân tích mẫu thực tế họ Sulfonamide trên nền mẫu tôm, cá chẽm, cá
mua ngẫu nhiên tại các chợ dân sinh ở đại bàn TP.HCM bằng phương pháp đã xây
dựng.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 10/03/2022
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/09/2022
IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Trọng.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 10 năm 2022
NGƯỜI HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Nguyễn Văn Trọng
TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

PGS.TS. Nguyễn Văn Cường


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành chương trình thạc sĩ ngành hóa phân tích tại trường Đại Học Cơng
Nghiệp TP. HCM, đó là mợt q trình khơng ngừng phấn đấu giúp tôi học hỏi, trao
dồi, bổ sung thêm nhiều kiến thức cho bản thân. Trong quá trình học tập và thực hiện
nghiên cứu luận văn tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ và tận tình hướng dẫn, đợng
viên. Vì vậy tôi xin gửi lời cảm ơn tới:
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Trọng đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn
tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và hồn thiện luận văn này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Hóa Học và khoa Sau
Đại Học của Trường Đại học Cơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ,
truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho tôi thực
hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cám ơn các anh chị em ở Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí
Nghiệm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện luận văn này.
Qua đây, tơi cũng xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè
đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn
này.

Tp. HCM, ngày tháng

năm 2022

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Bạch Yến

i


TĨM TẮT
Việt Nam là nước có sản lượng thủy sản rất lớn, nhu cầu xuất khẩu cao tuy nhiên giá
thủy sản xuất khẩu của Việt Nam vẫn ở mức thấp do chất lượng kém, trong đó dư
lượng kháng sinh là vấn đề quan trọng nhất cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt giới
hạn cho phép, theo các quy định quốc tế như Quy Định Liên Minh Châu Âu (EU) Số
37/2010. Do đó, chúng tơi đã xây dựng mợt phương pháp phân tích hiệu quả và đáng
tin cậy để xác định hàm lượng đồng thời dư lượng kháng sinh của 19 hoạt chất họ
Sulfonamide

gồm:

Sulfadimethoxine,

Sulfanilamide,

Sulfadoxine,

Sulfacetamide,

Sulfadiazine,

Sulfachloropyridazine,

Sulfaguanidine,

Sulfisoxazole,

Sulfamonomethoxine, Sulfamethoxypyridazine, Sulfamerazine, Sulfadimidine,
Sulfamethoxazole,

Sulfamoxole,

Sulfamethizole,

Sulfanitran,

Sulfapyridine,

Sulfaquinoxaline, Sulfathiazole. Các chất phân tích được xác định và định lượng bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ. Sử dụng phương pháp chiết
QuEChERS và phương pháp làm sạch DSPE đã được nghiên cứu. Ảnh hưởng của
các thông số như dung mơi trích ly, loại cợt, loại lọc ảnh hưởng đến sự phân tách đã
được tối ưu hóa. Kết quả thu hồi và đợ chính xác của các nền mẫu tôm, cá chẽm, cá
tra đều đáp ứng nhu cầu RSD theo AOAC. Giới hạn phát hiện và giới hạn định định
lượng đối với nền cá chẽm tương ứng là 0,83 – 2,79 µg/kg; 1,76 – 9,30 µg/kg, nền
mẫu cá tra 0,87 – 2,45 µg/kg; 2,89 – 8,16 µg/kg, nền tơm 0,88 – 2,16 µg/kg; 2,94 –
7,19 µg/kg. Đợ chính xác trong ngày nền mẫu cá chẽm (89,1 – 105,1%, RSD: 2,64 –
12,34%), nền cá tra dao động từ (92,1% đến 105,9%, RSD: 2,66 – 9,18), mẫu tôm
dao động từ (84,7 – 105,8%, RSD: 2,32– 9,48%).

ii


ABSTRACT
Vietnam is a country with a very rich seafood production, high export demand, but
the price of Vietnam's seafood exports is still low due to poor quality. In which,
antibiotic residue is the most important issue that needs to be strictly controlled to

reach the allowable limit, according to international regulations such as European
Union Regulation (EU) No 37/2010. Therefore, we have developed an efficient and
reliable analytical method for the simultaneous determination of antibiotic residues
of 19 Sulfonamides, including: Sulfanilamide, Sulfacetamide, Sulfachloropyridazine,
Sulfadimethoxine,

Sulfadoxine,

Sulfadiazine,

Sulfaguanidine,

Sulfisoxazole,

Sulfamonomethoxine, Sulfamethoxypyridazine, Sulfamerazine, Sulfadimidine,
Sulfamethoxazole,

Sulfamoxole,

Sulfamethizole,

Sulfanitran,

Sulfapyridine,

Sulfaquinoxaline, Sulfathiazole. Analytes were identified and quantified by ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry, using the QuEChERS
extraction method and the DSPE cleaning method were studied. The influence of
factors such as extraction solvent, column type and filter type on the separation was
optimized. The results of recovery performance and accuracy of the shrimp, seabass
and pangasius samples that have RSD demand according to AOAC. The limit of

detection and limit of quantification for seabass background were 0.83 – 2.79 µg/kg,
respectively; 1.76 – 9.30 µg/kg, pangasius sample background 0.87 – 2.45 µg/kg;
2.89 – 8.16 µg/kg, shrimp background 0.88 – 2.16 µg/kg; 2.94 – 7.19 µg/kg. The
intraday accuracy of seabass samples (89.1 – 105.1%, RSD: 2.64 – 12.34%),
pangasius background ranged from (92.1% to 105.9%, RSD: 2.66 – 9.18), shrimp
samples ranged from (84.7 – 105.8%, RSD: 2.32 – 9.48%).

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên là: Nguyễn Thị Bạch Yến xin cam đoan:
-

Những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là cơng trình của riêng
tác giả dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Trọng.

-

Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao
chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào.

-

Những kết quả nghiên cứu của các tác giả khác và các số liệu được sử dụng trong
luận văn đều có trích dẫn đầy đủ theo đúng quy định.

Học viên
(Chữ ký)

Nguyễn Thị Bạch Yến

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1.
Đặt vấn đề ......................................................................................................1
2.

Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................2

3.

Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................3

4.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................4

5.

Cách tiếp cận nghiên cứu...............................................................................4

6.

Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu ..................................................................4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN ..................................................................................6
1.1 Giới thiệu về kháng sinh ................................................................................6
1.1.1

Khái niệm ................................................................................................6

1.1.2

Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc .....................................................6

1.2

Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide ..........................................................6

1.3

Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs .......................................................7

1.4

Phân loại thuốc SAs .......................................................................................9

1.5

Các tác dụng phụ của SAs .............................................................................9

1.6

Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs ................................................................10

1.7

Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ .........................................10

1.7.1

Nguyên lý chung ...................................................................................10

1.7.2

Các nguồn ion hóa ................................................................................11

1.7.3

Các loại đầu dò khối phổ ......................................................................14

1.7.4

Các kỹ thuật ghi phổ .............................................................................16

1.8

Đánh giá kết quả các cơng trình nghiên cứu đã cơng bố .............................17

1.8.1 Một số kết quả nghiên cứu phương pháp xác định kháng sinh họ
Sulfonamide trong và ngoài nước .....................................................................17

1.8.2

Ưu và hạn chế của các nghiên cứu đã công bố .....................................20

CHƯƠNG 2
THỰC NGHIỆM............................................................................22
2.1 Dụng cụ, thiết bị, hoá chất – chất chuẩn......................................................22

v


2.1.1

Dụng cụ .................................................................................................22

2.1.2

Thiết bị ..................................................................................................22

2.1.3

Hố chất - chất chuẩn: ..........................................................................23

2.2

Nợi dung thực hiện ......................................................................................24

2.2.1

Chuẩn bị hóa chất, pha đợng, dung dịch chuẩn ....................................24

2.2.2

Chuẩn bị mẫu khảo sát ..........................................................................28

2.3

Nội dung nghiên cứu thực nghiệm ..............................................................29

2.3.1

Xây dựng phương pháp LC-MS/MS ....................................................29

2.3.2

Xây dựng phương pháp xử lý mẫu .......................................................30

2.3.3

Thẩm định quy trình phân tích họ Sulfonamide trong thủy sản ...........33

CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................39
3.1 Kết quả thực nghiệm....................................................................................39
3.1.1

Xây dựng phương pháp LC-MS/MS ....................................................39

3.1.2

Xây dựng phương pháp xử lý mẫu .......................................................47

3.2

Thẩm định phương pháp ..............................................................................51

3.2.1

Đợ chọn lọc ...........................................................................................52

3.2.2

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ......................................................55

3.2.3

Ảnh hưởng của nền mẫu (ME) .............................................................58

3.2.4

Xác định MDL, MQL của phương pháp ..............................................59

3.2.5

Hiệu suất thu hồi, độ lặp, độ tái lập ......................................................63

3.2.6

Độ không đảm bảo đo ...........................................................................65

3.3

Ứng dụng phân tích họ Sulfonamide trong nền mẫu thủy sản ....................67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................73
PHỤ LỤC ..................................................................................................................79
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .......................................................127

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cơng thức chung của nhóm Sulfonamide ....................................................7
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs ......................................................9
Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ .......................11
Hình 1.4 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI ........................................................13
Hình 1.5 Sự ion hóa hóa học áp śt khí quyển (APCI) ...........................................13
Hình 1.6 Cấu tạo của đầu dị khối phổ Triple quadrupole QQQ ..............................15
Hình 1.7 Kiểu quét phổ Scan và SIM .......................................................................17
Hình 3.1 Cợt C8, C18 và cợt XDB C18 sử dụng trong hệ thống HPLC ..................43
Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn Sulfonamide trên cợt Alltech Apollo C8 ........................43
Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn Sulfonamide trên cột GL Inert Sustain C18 ...................44
Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn Sulfonamide trên cợt XDB-C18 .....................................44
Hình 3.5 Sắc ký đồ Sulfaguanidine khi khảo sát cợt ................................................45
Hình 3.6 Sắc ký đồ so sánh ba loại cợt phân tích......................................................46
Hình 3.7 Biểu đồ so sánh khảo sát cợt phân tích ......................................................46
Hình 3.8 Quy trình xử lý mẫu ...................................................................................48
Hình 3.9 Khảo sát dung mơi trích ly .........................................................................49
Hình 3.10 Khảo sát bợt khuếch tán QuEChERS .......................................................51

Hình 3.11 Sắc ký đồ so sánh giữa mẫu trắng (A), dung dịch chuẩn 10 µg/L (B) và
50 µg/L (C) của các chất SAs ..................................................................53
Hình 3.12 Sắc ký đồ của 4 mẫu tôm phát hiện Sulfamethoxazole ...........................69

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Giới thiệu 19 hoạt chất họ Sulfonamide ......................................................7
Bảng 1.2 Tóm tắt mợt số nghiên cứu Sulfonamide trong và ngồi nước .................17
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng .......................................................................................23
Bảng 2.2 Chất chuẩn sử dụng ...................................................................................24
Bảng 2.3 Nồng độ dung dịch chuẩn gốc ...................................................................26
Bảng 2.4 Cách pha chuẩn hỗn hợp trung gian ..........................................................27
Bảng 2.5 Cách xây dựng đường chuẩn nghiên cứu ..................................................28
Bảng 2.6 Cách chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn...........................................................28
Bảng 2.7 Khảo sát các chương trình pha đợng khác nhau ........................................30
Bảng 2.8 Tiêu chí đánh giá đợ chính xác và độ đúng theo hàm lượng chất .............37
Bảng 2.9 Độ khơng đảm bảo đo mở rợng .................................................................38
Bảng 3.1 Chương trình gradient của hệ LC ..............................................................39
Bảng 3.2 Các thông số của đầu dị ............................................................................41
Bảng 3.3 Thơng số cài đặt khối phổ ..........................................................................42
Bảng 3.4 Thời gian lưu của 19 chất Sulfonamide và 1 chất nợi chuẩn ....................55
Bảng 3.5 Quy trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2 nền cá chẽm ..........56
Bảng 3.6 Quy trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2 nền cá tra...............57
Bảng 3.7 Quy trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2 nền tôm .................58
Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của nền mẫu ...............................................................59
Bảng 3.9 Kết quả MDL và MQL của nền cá chẽm...................................................60
Bảng 3.10 Kết quả MDL và MQL nền mẫu cá tra ....................................................61
Bảng 3.11 Kết quả MDL và MQL của nền tôm........................................................62

Bảng 3.12 Bảng tổng hợp độ thu hồi (độ lặp) của ba nền, n=6 ................................63
Bảng 3.13 Bảng tổng hợp độ thu hồi (độ lặp) của ba nền, n=12 ..............................64
Bảng 3.14 Độ không đảm bảo đo của nền mẫu cá chẽm ..........................................65
Bảng 3.15 Độ không đảm bảo đo của nền mẫu cá tra ...............................................66
Bảng 3.16 Độ không đảm bảo đo của nền mẫu tôm .................................................67
Bảng 3.17 Kết quả phân tích mẫu thực tế .................................................................68
Bảng 3.18 Kết quả cụ thể 4 mẫu tôm phát hiện Sulfamethoxazole ..........................68

viii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AA
AOAC

Acid acetic
Association of Official Analytical Chemists: Hiệp hợi các nhà hố phân
tích chính thống
C
Nồng đợ
CAS
Chemical Abstracts Service: Số đăng ký định danh hóa học
DLKS
Dư lượng kháng sinh
DSPE
Dispersive SPE clean up: Bột làm sạch QuEChERS
FA
Acid formic
FDA
Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm & dược

phẩm Hoa Kỳ
ISTD
Chất nội chuẩn
LC-MS/MS Liquid chromatography-mass spectrometry: Sắc ký lỏng ghép khối phổ
LOD
Limit of Detection: Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quatitation: Giới hạn định lượng
M
Phân tử lượng
MDL
Method Detection Limit: Giới hạn phát hiện của phương pháp
MeCN
Acetonitrile
MeOH
Methanol
MQL
Method Quatification Limit: Giới hạn định lượng của phương pháp
MRL
Maximum Residue Limit: Giới hạn cho phép tối đa
MS
Mass Spectrometry: Đầu dò khối phổ
PPB
Parts per billion: phần tỷ
PPM
Parts per million: phần triệu
PSA
Primary secondary amine: Amin bậc mợt, bậc hai.
S
Diện tích mũi sắc ký

SAs
Sulfonamides: Kháng sinh họ Sulfonamide
SPE
Solid phase extraction: Kỹ thuật vi chiết pha rắn
TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam

ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vấn nạn trên thế giới hiện nay là tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh. Nước Việt
Nam là mợt trong những nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao. Cơ sở nuôi tôm đã được
phát triển nhanh chóng trong thời gian gần đây ở những vùng ngập nước gần biển
Việt Nam do điều kiện tự nhiên thuận lợi. Tuy nhiên, ngành công nghiệp này đã gây
ra một số tác động không tốt đến môi trường. Một trong số các vấn đề quan trọng là
việc áp dụng quá mức các chất kháng sinh bao gồm cả thuốc chữa bệnh cho người.
Những hóa chất này có thể được thải ra từ các ao ni tơm, sau đó tích tụ và làm ô
nhiễm hệ sinh thái. Đặc biệt, do tác động tiêu cực của chúng đối với hệ sinh thái, một
số loại kháng sinh đã được phân loại là chất gây ơ nhiễm, ví dụ: Trimethoprim,
Erythromycin, Lincomycine và Sulfamethoxazole [1].
Do sự trao đổi chất khơng hồn tồn trong người hoặc động vật, 50–90% lượng kháng
sinh sử dụng được thải trừ qua phân và nước tiểu nước tiểu dưới dạng hỗn hợp của
các dạng chất chuyển hóa, kết quả thường xuyên phát hiện kháng sinh trong nước thải
và các vùng nước mặt. Trên thực tế, DLKS xâm nhập vào môi trường nước thông qua
một số đường, bao gồm: xả trực tiếp nước thải chưa qua xử lý từ các khu dân cư, bệnh
viện, các nhà sản xuất gia cầm và chế biến thịt và vật nuôi trong nhà; xả nước thải đã
qua xử lý từ nhà máy xử lý nước thải; dòng chảy bề mặt [2].
Trên thực tế, rất nhiều loại kháng sinh dùng để phòng và chữa bệnh cho đợng vật là

từ kháng sinh chữa bệnh cho người. Tình trạng kháng thuốc ở vi khuẩn gia tăng là do
vật nuôi được sử dụng quá nhiều kháng sinh, trở thành vi khuẩn kháng kháng sinh
khi gây bệnh cho người. Những thực phẩm hàng ngày chúng ta ăn như tôm, cá, sữa,
trứng, thịt… có DLKS đáng kể trong đó.
Đề kháng kháng sinh dẫn đến các vấn đề sau: Gia tăng bệnh tật, tử vong ở người;
tăng tác dụng phụ từ việc sử dụng nhiều loại kháng sinh mạnh; gia tăng chi phí, thời

1


gian điều trị; suy giảm sức đề kháng của bệnh nhân; gia tăng nhu cầu chăm sóc đặc
biệt, … [3].
Sulfonamide, cũng là kháng sinh tổng hợp, được đưa vào thực hành lâm sàng năm
1935, được sử dụng rộng rãi để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn. Trong khi ở các
nước phát triển, việc sử dụng Sulfonamide ở người đã giảm, chúng vẫn được dùng
thường xuyên ở các nước đang phát triển Châu Á do giá thành rẻ Sulfamethoxazole
một chất thuộc họ Sulfonamide thường được sử dụng, đã được phát hiện ở mức ppm
trong các ao nuôi tôm ở Việt Nam vào cuối những năm 1990. Mặc dù mức độ như
vậy là rất cao, nhưng mức độ Sulfamethoxazole trong các con sông ở Nhật Bản và
Việt Nam thường vào khoảng 100 ng/kg trong những năm trở lại đây.
Trimethoprim được phát hiện từ 20 - 1800 ng/kg, có thể vì nó thường được sử dụng
với Sulfamethoxazole. Trong nước thải trang trại chăn nuôi, nồng độ
Sulfamethoxazole thấp hơn, trong khoảng 68 - 600 ng/kg, trong khi nồng độ của
Sulfamethazine cao hơn nhiều (400 - 6000 ng/kg). Ở Việt Nam hiện nay, các
Sulfonamide khác hoặc khơng được phát hiện hoặc tìm thấy ở mức vết, cho thấy
Sulfamethoxazole và Sulfamethazine là các Sulfonamide chính đang được sử dụng
phổ biến [4].
2. Tính cấp thiết của đề tài
Theo tìm hiểu hiện nay chưa có TCVN xác định hàm lượng Sulfonamide trong thủy
sản bằng phương pháp LC-MS/MS.

Theo tìm hiểu về các quy định về dư lượng kháng sinh họ SAs trong nước: thơng tư
24/2013/BYT chỉ tìm thấy thông tin về giới hạn của Sulfadimidine (thuốc kháng
khuẩn, là mợt chất tḥc họ Sulfonamide) trong sữa (MRL: 25 µg/L), thịt, gan (MRL:
100 µg/kg) và chưa có thơng tin giới hạn trên nền mẫu thủy hải sản [5].
Theo quyết định 46-2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và
hóa học trong thực phẩm” ta thấy rằng chỉ quy định MRL của hoạt chất Sulfadimidine
thuộc họ SAs, giới hạn trong trong sữa (MRL: 25 µg/L), thịt, gan, thận, mỡ (MRL:
100 µg/kg), chưa có quy định cho các hoạt chất khác thuộc họ SAs [6].

2


Đồng thời tìm hiểu về các quy định Thơng tư số 15/2009/TT-BNN dư lượng kháng
sinh họ SAs trong văn bản hợp nhất số 08 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
ban hành ngày 25/02/2014 quy định cụ thể giới hạn tối đa họ SAs cho phép trong
thủy sản là 100 ppb [7].
Theo Quy Định của tiêu chuẩn quốc tế [8]: Liên Minh Châu Âu (EU) Số 37/2010, Ủy
ban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế Codex [9], Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm
Hoa Kỳ (FDA) đều quy định dư lượng tối đa Sulfonamide trong thực phẩm là 100
µg/kg.
Theo các tài liệu đã tìm hiểu trên ta có thể thấy rằng MRL cho phép của hoạt chất
Sulfamidine là 100 µg/kg trong sản xuất và kinh doanh thủy sản. Vì vậy trong nghiên
cứu này để đáp ứng MRL quy định cho nền mẫu thủy sản là 100 µg/kg chúng tôi dự
kiến thẩm định phương pháp với MDL và MQL dưới mức MRL 100 µg/kg. Từ những
tìm hiểu trên chúng tơi thấy rằng thủy sản có thể nhiễm kháng sinh họ SAs trong q
trình ni và kinh doanh thủy sản. Ở Việt Nam nguồn thủy sản rất phong phú và có
giá trị kinh tế cao, nhằm góp phần kiểm sốt DLKS trong thủy sản, đẩy mạnh xuất
khẩu. Chúng tôi đã quyết định thực hiện nghiên cứu “XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP LC-MS/MS ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HỌ SULFONAMIDE TRONG
THỦY SẢN”

3. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng thành công phương pháp LC - MS/MS xác định đồng thời 19 hoạt chất
họ SAs trong nền mẫu thủy hải sản: nền mẫu cá chẽm, tôm và cá tra.
- Xây dựng thành cơng quy trình xử lý mẫu tôm, cá chẽm, cá tra để xác định đồng
thời 19 hoạt chất họ SAs trong nền mẫu thủy hải sản.
- Xác định được MDL và MQL của 19 hoạt chất SAs của phương pháp đối với nhỏ

hơn dư lượng tối đa cho phép 100 µg/kg.
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để thực hiện phân tích mẫu thủy sản nhằm
xác định họ SAs, áp dụng phương pháp tại các phịng thí nghiệm.

3


4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Xác định đồng thời 19 hoạt chất họ SAs: Sulfacetamide,
Sulfachloropyridazine,

Sulfadimethoxine,

Sulfadoxine,

Sulfadiazine,

Sulfaguanidine, Sulfisoxazole, Sulfamonomethoxine, Sulfamethoxypyridazine,
Sulfamerazine Sulfadimidine (Sulfamethazine), Sulfamethoxazole, Sulfamoxole,
Sulfamethizole (Sulfamethiazole hoặc Sulfamethizol), Sulfanitran, Sulfapyridine,
Sulfaquinoxaline, Sulfathiazole trong thủy hải sản nền mẫu nền mẫu cá chẽm, tôm và
nền mẫu cá tra.
Phạm vi nghiên cứu là mẫu thủy hải sản: cá chẽm, cá tra và tôm mua ngẫu nhiên tại

các chợ dân sinh trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh.
5. Cách tiếp cận nghiên cứu
Tơi đã tiến hành tìm kiếm và thu thập các hướng dẫn, các tài liệu, tiêu chuẩn, bài báo
khoa học liên quan đến việc xác định hàm lượng kháng sinh thuộc họ SAs bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ.
Tiến hành nghiên cứu lý thuyết xong, tôi triển khai đề tài bằng cách xây dựng kế
hoạch thực nghiệm, chuẩn bị các điều kiện về thiết bị, hóa chất và chất chuẩn để tiến
hành nghiên cứu thực nghiệm.
6. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu
Thông qua nghiên cứu này chúng tơi có thể thu được những kết quả sau:
- Xây dựng qui trình phân tích nhằm xác định 19 chất họ SAs bao gồm:
Sulfacetamide,

Sulfachloropyridazine,

Sulfadiazine,

Sulfaguanidine,

Sulfamethoxypyridazine,
Sulfamethoxazole,

Sulfisoxazole,

Sulfamerazine

Sulfamoxole,

Sulfadimethoxine,

Sulfamonomethoxine,

Sulfadimidine

Sulfamethizole

Sulfadoxine,

(Sulfamethazine),

(Sulfamethiazole

hoặc

Sulfamethizol), Sulfanitran, Sulfapyridine, Sulfaquinoxaline, Sulfathiazole trong
nền mẫu thủy hải sản: cá chẽm, cá tra và tơm.
- Kết quả phân tích mẫu thực tế ngẫu nhiên sẽ giúp nhìn nhận thực trạng về DLKS

4


họ SAs trong thủy hải sản ở đia bàn TP. HCM hiện nay.
- Giúp các doanh nghiệp có thêm thơng tin về DLKS trong thủy sản đáp ứng MRL
cho phép của thị trường trong và ngồi nước, góp phần đẩy mạnh xuất khẩu thủy
hải sản Việt Nam ra nước ngoài.

5


CHƯƠNG 1

1.1

TỔNG QUAN

Giới thiệu về kháng sinh

1.1.1 Khái niệm
Kháng sinh là những chất có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được
vi khuẩn do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với
nồng độ rất thấp [10].
1.1.2 Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc
1.1.2.1 Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên
Là những kháng sinh hoàn toàn do vi sinh vật tổng hợp (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn...).
1.1.2.2 Kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp
Là những kháng sinh có phần cấu trúc cơ bản do vi sinh vật tổng hợp, sau đó được
gắn thêm các nhóm hóa chức bằng phương pháp hóa học.
1.1.2.3 Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hóa học
Là những kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hồn tồn bằng phương pháp hóa học.
Ví dụ: Nhóm Sulfonamide (SAs).
1.2

Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide

Năm 1932, Domard (Đức) đã tìm ra Sulfonamide [11]. Kháng sinh Sulfonamide
thường được nhận diện với tiếp đầu ngữ Sulf trong tên hoạt chất: Sulfadoxine,
Sulfadiazine, Sulfamoxole, Sulfamethoxazole, Sulfaquinoxaline...
-

Sulfonamide thuộc họ kháng khuẩn được sử dụng phổ biến trong thú y do hiệu
quả trong điều trị và giá thành thấp.

-

Có dạng bợt tinh thể của acid yếu, ít tan trong nước và mơi trường acid yếu, tan
tốt ở pH = 9. Tức là chúng có khuynh hướng kết tinh mơi trường pH acid của
nước tiểu.

-

Tính hịa tan của hỗn hợp nhiều Sulfonamide cũng có hiệu quả trị liệu tốt hơn.

6


Bảng 1.1 Giới thiệu 19 hoạt chất họ Sulfonamide
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

15
16
17
18
19
1.3

Hoạt chất
Sulfanilamide
Sulfacetamide
Sulfachloropyridazine
Sulfadimethoxine
Sulfadoxine
Sulfadiazine
Sulfaguanidine
Sulfisoxazole
Sulfamonomethoxine
Sulfamethoxypyridazine
Sulfamerazine
Sulfadimidine
(Sulfamethazine)
Sulfamethoxazole
Sulfamoxole
Sulfamethizole
(Sulfamethiazole)
Sulfanitran
Sulfapyridine
Sulfaquinoxaline
Sulfathiazole

Công thức hố học
C6H8N2O2S
C8H10N2O3S
C10H9ClN4O2S
C12H14N4O4S
C12H14N4O4S
C10H10N4O2S
C7H10N4O2S
C11H13N3O3S
C11H12N4O3S
C11H12N4O3S
C11H12N4O2S

CAS
63-74-1
144-80-9
80-32-0
122-11-2
2447-57-6
68-35-9
57-67-0
127-69-5
1220-83-3
80-35-3
127-79-7

M (g/mol)
172.21
214.24
284.72

310.33
310.33
250.28
214.25
267.31
280.31
280.31
264.31

C12H14N4O2S

57-68-1

278.33

C10H11N3O3S
C11H13N3O3S

723-46-6
729-99-7

253.28
267.31

C9H10N4O2S2

144-82-1

270.30

C14H13N3O5S
C11H11N3O2S
C14H12N4O2S
C9H9N3O2S2

122-16-7
144-83-2
59-40-5
72-14-0

335.34
249.29
300.34
255.30

Cơng thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs

Hình 1.1 Cơng thức chung của nhóm Sulfonamide

7


Sulfanilamide

Sulfacetamide

Sulfachloropyridazine

Sulfadimethoxine

Sulfadoxin

Sulfadiazine

Sulfaguanidin

Sulfisoxazol

Sulfamonomethoxin

Sulfamethoxypyridazin

Sulfamerazin

Sulfadimidine

Sulfamethoxazole

Sulfamoxol

Sulfamethizole

Sulfanitran

Sulfapyridin

Sulfaquinoxaline

8

Sulfathiazol
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs [12].
Trong 19 hợp chất Sulfonamide ta thấy Sulfisoxazole và Sulfamoxole là hai đồng
phân cấu tạo của nhau có cùng công thức phân tử C11H13N3O3S và tương tự
Sulfamonomethoxine và Sulfamethoxypyridazine cũng là hai đồng phân cấu tạo của
nhau có cơng thức C11H12N4O3S.
1.4

Phân loại thuốc SAs

Các Sulfonamide kháng khuẩn và các chất chuyển hóa của chúng được coi là chất ơ
nhiễm hữu cơ khó phân hủy.
Theo thời gian tác dụng và thời gian bán hủy, các Sulfonamide uống có thể hấp thụ
được có thể được chia ra gồm:
-

Sulfonamide tác dụng ngắn (3-8 giờ): Sulfadiazine, Sulfamethoxazol,
Sulfisoxazol.

-

Các

Sulfonamide

tác

dụng

trung

gian

(8-18

Salazosulfapyridin.
1.5

Sulfonamde tác dụng kéo dài (> 35 giờ): Sulfadoxine
Các tác dụng phụ của SAs

Triệu chứng phổ biến: Phát ban da, ngứa [13].

9

giờ):

Sulfaguanidine,


Các triệu chứng ít gặp: Da nhợt nhạt, đau các khớp và cơ, đỏ, phồng rợp, bong tróc
da hoặc lỏng lẻo, khó nuốt, mệt mỏi hoặc suy nhược bất thường, chảy máu hoặc bầm
tím bất thường, đau họng và sốt, mắt hoặc da vàng.
Ngoài ra, các triệu chứng hiếm sau mà người bệnh có thể gặp: Co thắt và đau bụng
nghiêm trọng, tiêu chảy nhiều nước và nặng, cũng có thể có máu, cơn khát tăng dần,
thay đổi tâm trạng hoặc tinh thần, xuất hiện máu trong nước tiểu, đau lưng dưới, đau
hoặc rát khi đi tiểu, sưng phần trước của cổ.
1.6

Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs

SAs có thể gây ra các vấn đề liên quan đến máu, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao
hơn, chảy máu nướu, vết thương chậm lành.
Thuốc có thể làm da nhạy cảm với ánh nắng bất thường, gây phát ban da, đỏ, ngứa,
cháy nắng nghiêm trọng hoặc đổi màu da.
Thuốc cũng có thể khiến mợt số người bị chóng mặt [14].
1.7

Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ

1.7.1 Nguyên lý chung
Phân tích sắc ký (Chromatography): Kỹ thuật tách riêng các hợp chất đã được Tsvett
(1906) sử dụng để tách riêng các chất màu trong cây cỏ. Từ ngữ “Chromatography”
xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu [15].
LC-MS/MS là hệ thống được kết hợp giữa LC với đầu dị MS, trong đó LC có nhiệm
vụ tách chất phân tích (thực hiện bởi cợt sắc ký). MS có nhiệm vụ phân tích khối phổ
dựa vào giá trị (m/z), là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích [16].

10


Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ [17]
Chất phân tích khi vào bợ phận MS được ion hố bằng các phương pháp khác nhau.
Các ion được hình thành đi vào bợ phận đo khối phổ. Do cơng thức hóa học các chất
khác nhau hình thành các ion mang điện tích dương hoặc âm khác nhau, ta chọn kiểu
quét âm hoặc dương.
1.7.2 Các nguồn ion hóa
Có ba kiểu hình thành ion trong LC-MS/MS [18]:
-

Ion hóa phun điện tử (ESI, electrospray ionization) là mợt kỹ thuật ion hóa chính
của LC-MS/MS.

-

Ion hóa hóa học ở áp śt khí quyển (APCI, atmospheric pressure chemical
ionization).

-

Ion hóa sử dụng photon tại áp suất khí quyển (APPI, atmospheric pressure
photoionization).

11


Kỹ thuật ESI được sử dụng nhiều nhất, APCI sử dụng ít hơn và trong nghiên cứu đề
tài chúng tơi sử dụng phân tích các chất bằng kỹ thuật ESI.
Khi so sánh 2 kỹ thuật ion hóa APCI và ESI có thể thấy:
•

Giống nhau

−

Đều tḥc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều trường hợp còn
thấy được phân tử ban đầu.

−

Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng đơn giản, giúp đoán nhận cấu
trúc chất ban đầu dễ dàng hơn.

−

Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dương tùy theo cấu trúc hợp chất khảo
sát.

−

Khác nhau

Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI):
−

Ion hình thành trong pha lỏng

−

Phân tích chất khơng khó bay hơi, nhiệt đợ bay hơi cao.

−

Có thể tạo sự phân mảnh ít hơn APCI

−

Phân tích các chất phân cực nhiều

−

Các chất có khối lượng phân tử lớn

−

ESI hình thành các ion có nhiều điện tích khác nhau, kỹ thuật ion hóa ESI sử
dụng nhiều hơn APCI.

12


Hình 1.4 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường (APCI):
− Ion được hình thành ở dạng hơi
− Phân tích các chất dể bay hơi.
− Có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn ESI
− Phân tích các chất phân cực kém
− Phân tích các chất có khối lượng phân tử nhỏ

Hình 1.5 Sự ion hóa hóa học áp śt khí quyển (APCI)

13