Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan A bất hoại quy mô 100.000 liều / năm docx

bộ khoa học và công nghệ Bộ y tế



chơng trình khoa học và công nghệ
phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng



báo cáo tóm tắt dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc
hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin
viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm
m số KC.10-DA12















5972
10/8/2006

Hà nội 2004



dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc kc.10 da12
hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất
vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000
liều/năm
Chủ nhiệm dự án : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân
Các cán bộ tham gia
TS.Nguyễn Tuyết Nga
CNSH.Vũ Hồng Nga
CN.Lê Hoàng Long
TS.Đỗ Tuấn Đạt
TS.Đỗ Thủy Ngân
TS.Nguyễn Quế Anh
PGS.TS.Đoàn Huy Hậu
PGS.TS.Hồ Bá Do
BS.Đinh Hồng Dơng
Các cơ quan tham gia
Công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung
ơng
Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắc xin và các chế phẩm sinh học
Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin Sabin
Bộ môn Dịch tễ - Học viện Quân y


các chữ viết tắt

ADN Desoxyribonucleic acid

(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)
ALT Alanin transferaza
AST Asparagin Transferaza
CDC Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)
cADN Complementary ADN
(ADN bổ sung)
ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch
ED50 Effective dose 50
(Liều gây miễn dịch 50%)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
(thử nghiệm miễn dịch gắn enzym)
ELU ELISA Unit
(Đơn vị ELISA)
GMT Geometric mean titer
(hiệu giá trung bình nhân)
HAV Hepatitis A Virus
(Virút viêm gan A)
HLA kháng nguyên bạch cầu ngời
HT Huyết thanh
IFN interferon-
IFN interferon-
IFN

interferon-
kD kilodalton
(kilôdalton)
LH

3
E Lactalbumin hydrolysate Egle
mIU mili International unit
(mili đơn vị quốc tế)
àg mcg
M Mol
MSV Master seed virus
(Chủng gốc giống)
NMWL Nominal Molecular Weight Limit
( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử )
nm nanomet
NCR Non coding region
(Vùng không mã hóa)
ORF Open reading frame
(khung đọc mở)
PCR Polymerase chain reaction
(phản ứng chuỗi polymeraza)
PFU Plaque Forming Unit
(Đơn vị tạo đám hoại tử)
PMMK Primary Monkey Kidney Cell
(Tế bào thận khỉ tiên phát)
rpm round per minute
(Vòng/phút)
SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis
(điện di trên gel polyacrylamid)
TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới
TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50
(LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo)
VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1

VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng
VX V¾cxin
WSV Working seed virus
( Chñng s¶n xuÊt)


mục lục

Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG 1 : Vật liệu và phơng pháp 2
1.1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt
2
1.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 3
1. 2.1. An toàn chung 3
1. 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3
1.2.3. Kiểm tra chất gây sốt 3
1.2.4. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4
1.2.5. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 4
1.2.6. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 4
1.2.7. Kiểm tra công hiệu 4
1.3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 5
1.3.1. Đối tợng nghiên cứu. 5
1.3.2. Vật liệu nghiên cứu 5
1.3.3. Phơng pháp nghiên cứu 5
CHƯƠNG 2: Kết quả và bàn luận 8
2.1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt 8
2.1.1 Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình nuôi cấy8
2.1.2. Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình tinh khiết virút 8
2.1.3 Hàm lợng Protein toàn phần 8

2.1.4. Thử nghiệm bất hoạt9
2.1.5. Pha chế vắc xin và đóng ống 9
2.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 10
2. 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 10
2.2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học 11
2.3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm
gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng
13
2.3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm gan A trên các đối
tợng 13
2.3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối tợng có
anti-HAV (-) 14
2.3.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối tợng có
anti-HAV (+) 18
Kết luận 20
Kiến nghị 22
Tài liệu tham khảo 23









1
đặt vấn đề
Virút viêm gan A (HAV) là rất phổ biến ở tất cả các nớc khu vực Tây
Thái Bình Dơng và Đông Nam á. Điều kiện vệ sinh kém đã làm lây lan

HAV ở những vùng dịch lu hành cao. Mức độ lu hành của HAV trong
cộng đồng là cực kỳ cao. Các nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở
Bangladesh, Bhutan, India, Maldive và Nepal chứng minh rằng 85-95% trẻ
em ở 10 tuổi đã có miễn dịch với HAV. Chỉ có một số ít trẻ bị nhiễm phát
triển thành các trờng hợp nhiễm trùng có triệu chứng. Nghiên cứu căn
nguyên các trờng hợp viêm gan rải rác ở các nớc này chứng minh rằng
nhiễm HAV chịu trách nhiệm tới khoảng 10-25% tất cả các trờng hợp
viêm gan ở trẻ em, trong khi nhiễm ở ngời lớn thờng chỉ là 1-5%. Dịch
viêm gan A thờng xẩy ra ở các thành phố có liên quan đến việc sử dụng
nguồn nớc uống và thực phẩm không an toàn.
Kết quả nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Indonesia và Thái Lan
cho thấy huyết thanh dơng tính ở trẻ em giảm xuống trong năm 1994-
1995 (30-35%) so với kết quả nghiên cứu đã tiến hành vào năm 1977-1978
(85-90%) ở trẻ em tuổi từ 7-12 tuổi. Đây có thể là kết quả cải thiện tiêu
chuẩn vệ sinh, làm sạch môi trờng, thiết bị nớc uống và cũng do giảm
mạnh sự lu hành của HAV.
ở Việt nam nhiều nghiên cứu về HAV cũng đã đợc tiến hành và cho
thấy HAV là nguyên nhân chủ yếu các trờng hợp viêm gan cấp tính
(29%), 59% trong số đó có độ tuổi > 20 tuổi. Những nghiên cứu khác cho
thấy 90% dân ở nông thôn có anti-HAV (IgG) thuộc tuổi thanh niên.
Tình hình dịch tễ học HAV đang thay đổi ở nhiều nớc. Với việc tăng
cờng tiêu chuẩn vệ sinh ở nhiều nớc tỷ lệ nhiễm HAV ở trẻ nhỏ đã giảm
đi nhiều, thậm trí cả ở những nớc và vùng có dịch lu hành cao, song các

2
ổ dịch thấp đang xuất hiện. Do đó ở nhiều nớc đang chuẩn bị phải đón
nhận các trờng hợp viêm gan A lâm sàng ngày càng tăng ở những trẻ lớn
hơn và ngời lớn. Mặc dù đã có vắcxin tốt, song giá thành rất đắt và vì vậy
không có khả năng tiêm đại trà đợc. Các sinh phẩm chẩn đoán viêm gan A
hiện nay cũng rất đắt do đó cũng hạn chế việc sử dụng để thử nghiệm trớc

khi tiêm phòng.
Đề tài KHCN 11-10 đã nghiệm thu xuất sắc, nghiên cứu xây dựng đợc
công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ
PMMK, đảm bảo yêu cầu tối thiểu của TCYTTG về loại vắcxin này. Hiện
nay, tiêu chuẩn Việt nam đề ra cho loại vắcxin này vẫn cha đợc dự thảo.
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A
trên nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát PMMK có nguồn cung cấp dồi dào
trong nớc nhằm giảm giá thành của vắcxin là yêu cầu cấp thiết đợc đặt
ra. Mặt khác hiện nay liều tiêm và lịch tiêm rất khác nhau giữa các vắcxin
viêm gan A đợc sử dụng cũng nh sự cần thiết của liều tiêm nhắc lại vẫn
đang là vấn đề cần nghiên cứu. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó, dự
án Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt
quy mô 100.000 liều/năm có mục tiêu nh sau:
1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất
hoạt ở qui mô 100.000 liều/năm đạt tiêu chuẩn quốc tế.
2. Xây dựng tiêu chuẩn Việt nam cho vắcxin viêm gan A bất hoạt.
3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin trên thực địa lâm sàng, xác định
lịch tiêm và liều tiêm phù hợp.

Với những mục tiêu đó, Dự án có nội dung chính nh sau :

3
1.Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ
nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta : bổ sung trang thiết bị
cần thiết để mở rộng sản xuất; nghiên cứu và xây dựng đợc các thông số
hóa, lý, sinh học tối u; cải tiến một số công đoạn trong quy trình sản xuất
để nâng cao công suất
2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia thích hợp cho vắcxin viêm gan A
bất hoạt về các thành phần hoá học (protein, formaldehyt, hydroxyt nhôm,
pH), an toàn, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố. Nghiên cứu tính ổn định về

chất lợng và các thành phần của các loạt vắcxin viêm gan A do Việt nam
sản xuất so sánh với tiêu chuẩn của TTYTTG.
3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A trên thực địa lâm sàng
giai đoạn III, theo dõi tính an toàn, phản ứng phụ, đáp ứng miễn dịch trên
nhóm ngời tình nguyện, đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A với cỡ
mẫu n = 300. Xác định liều tiêm và lịch tiêm phù hợp cho các đối tợng
khác nhau.









4
Chơng 1
Tổng quan

1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan A
1.1. Lịch sử virút viêm gan A
Hội chứng vàng da đã đợc mô tả trong lịch sử từ thế kỷ thứ 8. Tuy
nhiên đến tận thế kỷ 17, 18 và 19 những vụ dịch vàng da lớn đã đợc mô tả
đầy đủ hơn. Năm 1947, Mac Callum đã đa ra cụm từ viêm gan A và viêm
gan B để phân biệt các loại viêm gan virút. Những cụm từ này đã đợc Uỷ
ban Viêm gan virút của Tổ chức y tế thế giới công nhận. Virút viêm gan A
đợc xác định lần đầu tiên bằng kính hiển vi điện tử năm 1973 nhờ
Feinstone. Năm 1979 Provost và Hilleman đã thành công trong nuôi cấy
virút viêm gan A trên tế bào, mở đầu cho những nghiên cứu phát triển

vắcxin.

1.2. Đặc điểm virút viêm gan A
Những nghiên cứu tiếp sau này đã xác định đợc HAV là một virút
picorna. Hạt virút hình cầu nhỏ không có vỏ có đờng kính khoảng 27-32
nm, tốc độ lắng 156 -160S, và các băng xung quanh 1.33 -1,34 g/cm
3
trong
CsCl. Genôm là sợi đơn ARN thẳng dài 7,5 kb với cực nhận biết thông tin ở
đầu 5 và đầu 3 là một chuỗi poly (A).
Giống nh tất cả các virút picorna khác, genom HAV có thể chia thành
3 phần : (a) đầu 5 không mã hóa (NCR) chiếm khoảng 10% genom và nối
với protein virút VPg ; (b) một khung đọc mở mã hóa cho tất cả các protein

5
virút bao gồm P1 cho protein capsit và P2,P3 cho protein không cấu trúc ;
(c) đầu 3 ngắn không mã hóa (NCR). Đầu 5 NCR là vùng ổn định nhất
của genom HAV (hơn 89% nucleotit giống nhau trong 7 chủng đại diện
cho genotýp I,II,III. Đột biến vùng 5 NCR làm tăng khả năng thích ứng
của HAV trong nuôi cấy tế bào nhng không đóng vai trò quan trọng trong
khả năng gây bệnh của virút. Đầu 3 NCR có tỷ lệ khác biệt cao giữa các
chủng HAV và đột biến (20%). Tác động của vùng 3 và 5 trong tổng hợp
ARN của picorna virut cha đợc hiểu biết đầy đủ nhng đóng vai trò quan
trọng.
Ba protêin cấu trúc, VP1 - VP3, sắp xếp theo kích thớc từ 24 đến 33
kD đợc sao chép từ trình tự axit nucleic của virút, và tơng tự giữa tổ
chức genom của HAV và các picornavirút đã biết khác, song cha bao giờ
xác định đợc ở viriôn. Ba polypeptit capsit chính đã đợc xác đinh bao
gồm : VP1 (30-33 kD), VP2 (24-27 kD), VP3 (23-29 kD). Trọng lợng
phân tử chính xác của polypeptit nhỏ (VP4) vẫn cha đợc xác định. Vùng

quyết định nguyên của protein capsit có thể rất bền vững trong quá trình
nuôi cấy lâu dài. Mặc dù quá trình chế biến sau phiên dịch và số phận cuối
cùng của đầu kết thúc amino của polyprotêin biểu thị vẫn cha đợc xác
định rõ ràng, một đoạn tín hiệu cho qúa trình myrin hoá ở vị trí axit amin
thứ bảy sau Methionin thứ nhất với một vùng VP4 ngắn giả thiết rằng khả
năng có một đầu dẫn peptit tắt (L).
VP1 là một protein có khả năng hoạt động bề mặt chính trong
picornavirut. Xác định trình tự dựa trên vùng VP1/2A phân loại đợc 7
genotýp khác nhau. Bốn trong số các genotýp đó có liên quan đến khả năng
gây bệnh cho ngời (I,II,III và VII). Genotýp I và III đợc tìm thấy phổ
biến trong các nghiên cứu trong khi genotýp II và VII mỗi loại chỉ đợc đại
diện bằng một chủng phân lập. So sánh bằng vùng VP1 cho thấy 23,7 %
biến đổi ở mức độ nucleotit và 10,5% biến đổi ở mức độ axit amin giữa các

6
chủng phân lập đợc. Nghiên cứu của Mauro Costa Mattioli và cộng sự đã
tìm thấy đột biến trong vùng VP1 với sự biến mất của 15 axit amin cho
thấy khả năng của đột biến trốn thoát kháng thể trung hòa. Một nghiên cứu
khác tìm thấy đột biến của vùng VP1 với sự biến mất của 18 nucleotit của
chủng HAV thích ứng trong nuôi cấy tế bào. Vùng gen mã hóa cho 2A của
picornavirut đại diện cho vùng hay thay đổi nhất trong genom. Trong khi
2A có chức năng proteolytic trong entero và rhinovirut thì ở các virút khác
không tìm thấy trình tự kiểu proteaza hoặc hoạt tính catalytic. Cấu trúc gen
vùng 2A và kích thớc vẫn còn cha đợc xác định rõ. Một vài nghiên cứu
đã chỉ ra rằng kích thớc của 2A và 2B không giống nh phỏng đoán ban
đầu. Việc xóa bỏ 10 đến 15 axit amin trong protein 2A chỉ có một tác động
rất nhỏ trong nuôi cấy HAV trên tế bào và gan khỉ đuôi sóc. Mặc dù đột
biến vùng P2 (protein 2C và 2B) cần thiết cho khả năng thích ứng của
chủng HM175 và các chủng HAV khác trong nuôi cấy tế bào, đột biến của
vùng 5 không dịch mã cũng có vai trò quan trọng .

Hình 1 : Hình ảnh virút viêm gan A dới kính hiển vi điện tử

7
HAV vợt xa poliovirút về ổn tính định nhiệt hoàn toàn ở 20
o
C , sống
sót do nhiệt tới 60
o
C trong một thời gian dài. Sự ổn định nhiệt này cho thấy
có sự khác biệt đáng kể trong hình ảnh cấu trúc capsit của HAV mà vẫn
cha xác định đợc. Giống nh các enterovirút và cardiovirut, hạt HAV
tinh khiết bền vững với axít. HAV tinh khiết bền vững hơn HAV không
tinh khiết, giữ đợc tính gây nhiễm trên 8 giờ. HAV bền vững với nhiệt độ
60C ở pH trung tính trong ít nhất 60 phút. Virút chỉ bất hoạt một phần sau
10 đến 12 giờ khác với các picornavirut không bền vững ở 56C. Hoạt tính
gây nhiễm có thể duy trì ít nhất 1 tháng sau khi đông khô và bảo quản ở
25C với 42% độ ẩm hoặc nhiều năm ở nhiệt độ -20C hoặc thấp hơn. HAV
không bị bất hoạt bởi chloramin T (1g/l trong 15 phút ở 20C) hoặc
perchloracetic axit. HAV bị bất hoạt nhờ sấy ớt (121C trong 20 phút), tia
cực tím hoặc formalin (1 :4000 trong 72 giờ ở 37C).
Cuối cùng thì quá trình sao chép của HAV trong tế bào hoàn toàn

không giống nh phần lớn các picornavirút đã đợc biết rõ đặc tính khác.
Thậm trí ở điều kiện tối u thì chu trình sao chép của HAV đợc thực hiện
và kéo dài trên 24 đến 48 giờ. Sự sao chép có liên quan đến hủy hoại tế bào
hiếm khi gặp trừ khi các chủng virút khác nhau phải đợc chọn lọc một
cách thận trọng, ở một vài hệ tế bào, và với điều kiện nuôi cấy đợc xác
định chặt chẽ . Không có sự làm suy sụp sinh tổng hợp đại phân tử ở tế bào
chủ. Nhìn chung một nhiễm trùng dai dẳng đã đợc xác định và virút tiền
gen còn lại một lợng lớn trong tế bào.Trong một vài trờng hợp có thể cần
tới 2 đến 3 tuần nuôi cấy để đạt đợc hàm lợng virút thậm trí 100 đến
10.000 lần thấp hơn, thí dụ, hàm lợng poliovirút trong cùng điều kiện nuôi
cấy tế bào đặc hiệu.
Đặc điểm nhân lên của virút viêm gan A là một trở ngại lớn trong việc
sản xuất và mở rộng qui mô sử dụng vắcxin viêm gan A. Việc nuôi cấy
HAV rất khó đạt đợc hiệu suất cao hoặc không tạo ra hủy hoại tế bào để

8
có thể quan sát đợc. Bằng cách sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Provost đã xác định đợc HAV cấy truyền 31 lần trên khỉ đuôi sóc có thể
nuôi cấy đợc trên tế bào. Kháng nguyên virút phần lớn là protein nội bào.
Thời gian để có đợc lợng kháng nguyên HAV tối đa trong nuôi cấy tế
bào có thể giảm sau khi cấy truyền liên tiếp. Nhiều dòng tế bào tiên phát và
tế bào thờng trực của động vật linh trởng thích hợp cho việc nuôi cấy
HAV, mặc dù kết quả nuôi cấy phụ thuộc vào chủng virút, loại tế bào và
nhiệt độ. Dòng tế bào cảm nhiễm với HAV bao gồm tế bào thận khỉ xanh
châu Phi tiên phát và thứ phát, tế bào thận khỉ cynomologus sơ sinh, tế bào
thận khỉ Rhesus bào thai (FRhK-4), tế bào thận khỉ cercopithecus, tế bào
gan Alexander, tế bào màng ối FL, và tế bào lỡng bội bào thai ngời (WI-
38 và MRC-5). Tế bào thận khỉ xanh châu Phi tiên phát (AGMK), tế bào
nguyên bào sợi của ngời và dòng tế bào phổi lỡng bội ngời (MRC5)
thờng đợc sử dụng trong sản xuất vắcxin viêm gan A. Hiệu giá của HAV

trong nuôi cấy tế bào có thể từ 10
3
đến 10
9
TCID50/ml. Thời gian để có
đợc hiệu giá virút tối đa từ 2 ngày cho đến 21 ngày sau gây nhiễm. Tuy
nhiên sự ổn định hiếm thấy của virút ở mức độ cấu trúc và di truyền sẽ làm
dễ dàng đi rất nhiều vấn đề này.
Ba giai đoạn nhân lên của virút trong quá trình nuôi cấy đã đợc xác
định. Từ ngày thứ 2 cho đến ngày thứ 8 sau gây nhiễm, sợi ARN âm và sợi
dơng của virút và tỷ lệ tổng hợp virút HAV có khả năng lây nhiễm đạt
mức cao nhất. Từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 14, kháng nguyên virút đợc
tổng hợp ở mức cao nhất và sợi ARN dơng, HAV lây nhiễm vẫn ở mức
cao nhất nhng sợi ARN âm giảm xuống ở dới mức phát hiện đợc. Số
lợng thấp ARN sợi kép phát hiện đợc đã chứng minh rằng có rất ít sợi
ARN âm đợc tổng hợp. Sau 14 ngày, có rất ít hoạt tính quá trình trao đổi
chất của virút. Có nhiều cơ chế đã đ
ợc đa ra để giải thích cho sự sao chép

9
chậm HAV trong tế bào. Có nhiều hóa chất ảnh hởng đến quá trình sao
chép của virút nh guanidin, hóa chất kháng virút, amantadin, monensin
Từ những số liệu của các thử nghiệm miễn dịch, HAV chỉ có 1 serotýp.
Hạt virút tinh khiết kích thích sinh kháng thể trung hòa anti-HAV. Ngợc
lại, kháng thể kháng lại protein capsit tinh khiết hoặc peptit tổng hợp không
có hoạt tính trung hòa hoặc rất yếu. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng
98% IgG và 94% IgM đợc tìm thấy trong giai đoạn nhiễm HAV cấp tính
là kháng thể kháng VP1. Kháng thể anti-VP1, anti-VP0 và anti-VP3 IgG
đợc tìm thấy nhiều năm sau khi nhiễm HAV. Điều đó cho thấy rằng
kháng thể kháng polypeptit capsit có thể có vai trò quan trọng trong việc

duy trì đáp ứng miễn dịch lâu dài. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng
thể trung hòa có thể đợc tạo ra ở chuột khi gây miễn dịch bằng protein
virút riêng lẻ VP1,VP2 hoặc VP3. Hơn nữa, vị trí gây miễn dịch trung hòa
đã đợc tìm thấy trên protein capsit VP3 của HAV.
Một kho tàng các số liệu nghiên cứu viêm gan A đợc lu trữ trong hơn
một nửa thế kỷ đã củng cố quan điểm cho rằng các chủng virút có tính chất
sinh bệnh học và kháng nguyên thay đổi sẽ không xẩy ra . Bất kỳ lúc nào
các quan sát dịch tễ và lâm sàng cho rằng có sự thay đổi về các tính chất
sinh học cơ bản của virút, nh khi có dịch viêm gan do nguồn nớc gây nên
ở Delhi năm 1956, thì nghiên cứu sau này đã phát hiện thêm một tác nhân
căn nguyên không có liên quan, cũng là một tác nhân virút truyền nhiễm
đờng ruột, một viêm gan không A, không B ( hiện nay đợc mô tả là virút
viêm gan E). Sự ổn định và đồng nhất kháng nguyên của HAV có thể là kết
quả theo dõi tiêm glôbulin miễn dịch huyết thanh ngời bảo vệ đợc viêm
gan A trên toàn thế giới, không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của chế
phẩm glôbulin miễn dịch đã đợc sử dụng.

10

Hình 2 : Cấu trúc genom HAV và các sản phẩm mã hóa

1.3. Sinh bệnh học
Nhiễm trùng tự nhiên với HAV thờng xẩy ra sau khi nhiễm virút theo
đờng tiêu hóa do các chất bị nhiễm phân có chứa HAV. Quá trình từ khi
virút xâm nhập theo ống tiêu hóa cho đến khi gây ra hậu quả viêm gan vẫn
cha đợc hiểu biết đầy đủ. Mặc dù vị trí sao chép đầu tiên của HAV là tế
bào gan, quá trình tự nhiên của các vật thể cảm thụ trên tế bào chủ đối với
tác nhân vẫn cha đợc xác định rõ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho
biết sự kết dính của virút đối với tế bào là phụ thuộc vào canxi. Trong giai
đoạn ủ bệnh, trạng thái virút huyết xuất hiện đồng thời với sự đào thải virút

theo phân. Trạng thái virút huyết kết thúc nhanh sau khi triệu chứng viêm
gan xuất hiện, trong khi HAV vẫn tiếp tục đào thải ra phân trong 1 đến 2
tuần nữa. Trong một vài trờng hợp, HAV có thể lu hành trong máu gắn
với những đoạn màng có lipit có tác dụng bảo vệ virút tránh kháng thể
trung hòa.

11
Phức hợp miễn dịch giữa kháng thể IgA đặc hiệu và HAV trong phân
đã đợc phát hiện. Điều này giải thích tại sao HAV có thể phát hiện bằng
phản ứng lai ghép sau khi kháng nguyên HAV âm tính đối với các thử
nghiệm miễn dịch.
Đã có giả thuyết cho rằng có vị trí sao chép ban đầu khác ngoài tế bào
gan đối với HAV. Trên gây bệnh thực nghiệm cho động vật linh trởng,
kháng nguyên HAV và/hoặc vật liệu di truyền đã đợc tìm thấy ở lách,
thận, amidan và nớc bọt nhng không thờng xuyên thấy ở niêm mạc
ruột. Sự phát hiện của HAV trong amidan và nớc bọt, ngay sau khi virút
xuất hiện trong máu đã gợi ý rằng quá trình sao chép sớm có thể xẩy ra ở
khoang miệng hầu hoặc tuyến nớc bọt.
Mặc dù có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng có vài mối liên hệ giữa mức
độ tiến triển của bệnh với đào thải virút trong phân nhng lợng virút đào
thải trong phân lớn nhất trớc khởi đầu của tổn thơng gan biểu hiện bằng
ALT tăng cao. Trong vitro, tế bào nhiễm HAV lâu dài không bị phá hủy và
sự trao đổi chất hoàn toàn không bị ảnh hởng. Điều đó gợi ý rằng, khả
năng gây độc của virút có thể không phải là nguyên nhân gây ra những thay
đổi bệnh lý trong nhiễm HAV và bệnh lý gan có thể là kết quả ban đầu của
cơ chế miễn dịch.
Cơ chế đào thải HAV ra khỏi gan vẫn cha đợc nghiên cứu nhiều,
song có lẽ bao gồm việc gây cảm ứng các tế bào giết không đặc hiệu cũng
nh kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA) lớp I- giới hạn cho lymphô bào T
gây độc. Phân tử đích cho tế bào hoạt hoá kiểu này cha đợc biết, song

ngời ta cho rằng prôtêin virút đợc mã hoá có mặt trên bề mặt của tế bào
bị nhiễm. Sự đáp ứng qua trung gian tế bào này đối với nhiễm HAV trong
gan có lẽ chịu trách nhiệm phần lớn thơng tổn gan kèm theo viêm gan A
cấp tính khi virút nhân lên mạnh mẽ và tiếp đến là khởi đầu hủy hoại tế bào

12
gan và sự nhân lên của phần lớn các biến chủng HAV là không gây thơng
tổn hủy hoại tế bào ở các giòng tế bào nuôi. Tế bào đơn nhân cũng xâm
nhập vào bức tranh toàn cảnh trong tổ chức học của viêm gan A cấp tính.
Mặc dù vai trò của interferon trong điều trị viêm gan A cha đợc xác định
rõ, song quá trình nhân lên của HAV có lẽ là hoàn toàn nhậy cảm với
interferon- (IFN

) và IFN

. Tuy nhiên IFN


không đợc sản xuất từ
nguyên bào sơ bị nhiễm và chứng cớ để sản xuất IFN

vẫn còn đang tranh
cãi. Mặt khác IFN

nh đã biết sẽ đợc sản xuất từ lymphô bào T trong đáp
ứng với viêm gan A cấp tính và có lẽ đóng vai trò chủ yếu trong sinh bệnh
học của căn bệnh này. Hơn nữa, đối với hiệu quả kháng virút trực tiếp,
IFN

có thể khởi động các tế bào lymphô gây độc bằng cách gây cảm ứng

ban đầu của HLA lớp kháng nguyên trên bề mặt tế bào gan.

1.4. Đặc điểm lâm sàng
Đặc điểm lâm sàng của viêm gan virút rất đa dạng. Qúa trình nhiễm
virút viêm gan cấp có thể chia thành 4 giai đoạn : (a) giai đoạn ủ bệnh giữa
phơi nhiễm và ngày đầu tiên xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc vàng da ;
(b) giai đoạn tiền lâm sàng ; (c) giai đoạn lâm sàng ; (d) giai đoạn hồi phục.
Thời gian ủ bệnh của viêm gan A từ 10 đến 50 ngày, trung bình 1 tháng.
Tuy nhiên, lợng virút lớn xâm nhập sẽ làm rút ngắn giai đoạn ủ bệnh.
Trong giai đoạn này, bệnh nhân không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng
mặc dù virút vẫn sao chép và nhân lên. Điều đáng quan tâm nhất trong giai
đoạn ủ bệnh là khả năng lây truyền.
Giai đoạn tiền lâm sàng kéo dài từ vài ngày đến vài tuần, kéo theo khởi
đàu của vàng da. Triệu chứng thờng gặp là sốt, chán ăn, mệt mỏi, đau cơ,
buồn nôn, nôn. Giai đoạn lâm sàng bao gồm các triệu chứng nớc tiểu sẫm
mầu do tăng bilirubin niệu, kéo theo phân bạc mầu vài ngày sau đó và vàng

13
da niêm mạc. Có thể gặp viêm gan kịch phát trong 6 đến 8 tuần của bệnh
gây ra sốt cao đột ngột, đau dữ dội, nôn, và vàng da tiếp theo là hội chứng
não do viêm gan lên quan đén hôn mê sâu và chảy máu não. Tỷ lệ chết cao
liên quan đến tuổi, tỷ lệ sống sót rất hiếm đối với bệnh nhân trên 45 tuổi.
Chẩn đoán lâm sàng viêm gan virút cấp dựa trên đánh giá chức năng
sinh hóa của gan với sự tăng cao men gan ALT và AST.

1.5. Chẩn đoán
Bởi vì tác nhân gây bệnh của viêm gan virút thờng không thể phân biệt
dựa trên đặc điểm lâm sàng và bội nhiễm HAV có thể xẩy ra trên bệnh
nhân nhiễm virút viêm gan B và C nên các thử nghiệm huyết thanh đợc
tiến hành để xác định nguyên nhân. Để chẩn đoán giai đoạn cấp của nhiễm

HAV, một dấu ấn quan trọng thờng đợc xác định là IgM anti-HAV.
Kháng thể này tăng cao nhanh chóng trong 4 đến 6 tuần, rồi giảm xuống
dới mức phát hiện trong vòng 3 đến 6 tháng ở phần lớn các bệnh nhân.
Trên 85% các trờng hợp men gan vẫn bình thờng trớc khi hoặc tại thời
điểm IgM anti-HAV biến mất. IgG anti-HAV có thể phát hiện đợc trong
vòng 1 hoặc 2 tuần của giai đoạn cấp tính và thay thế IgM. IgG có thể tồn
tại nhiều năm sau khi nhiễm HAV.
Ngoài các phơng pháp xác định kháng thể IgG hoặc IgM anti-HAV
trong huyết thanh bệnh nhân, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đợc áp
dụng nhằm tăng cao độ nhậy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán. Kỹ thuật lai
ghép đã phát hiện đợc virút với nồng độ 10
4
-10
5
PFU/ml. Tuy nhiên, kỹ
thuật này thiếu độ nhậy cần thiết để phát hiện trực tiếp hạt virút vơi số
lợng nhỏ trong thực phẩm. Hiện nay, phản ứng chuỗi polymeraza - sao
chép ngợc là kỹ thuật duy nhất cho phép phát hiện virút đờng ruột trong

14
thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã cho rằng kỹ thuật này cho phép phát hiện
virút có nồng độ từ 10- 10
5
PFU/ml trong thực phẩm sau khi cô đặc mẫu
bằng sử dụng miễn dịch từ trờng.

1.6. Điều trị
Hiện nay không có điều trị đặc hiệu với viêm gan virút cấp. Liệu pháp
điều trị mang tính chất hỗ trợ và mục đích là duy trì nghỉ ngơi và dinh
dỡng hợp lý. Yêu cầu cung cấp 10% glucoza bởi vì bệnh nhân viêm gan

thể nặng có thể khó khăn trong việc bài tiết lợng nớc bình thờng. Triệu
chứng buồn nôn có thể hạn chế bằng promethazin, cisaprit hoặc
ondansetron. Nếu thời gian chẩy máu kéo dài có thể sử dụng liều đơn
vitamin K (10mg). Việc điều trị với viêm gan kịch phát vẫn cha thành
công và tỷ lệ chết vẫn cao. Việc sủ dụng neomyxin hoặc lactuloza theo
đờng uống có thể làm giảm hàm lợng ammonia trong máu, do đó hạn
chế hội chứng viêm não do viêm gan. Điều trị rối loạn các yếu tố đông máu
bằng cách sử dụng plasma tơi. Bởi vì giảm glucoza huyết thờng hay gặp
trên bệnh nhân nên lợng glucoza phải đợc kiểm soát hàng ngày.


15

Hình 3 : Những biến đổi huyết thanh học trong nhiễm HAV

1.7. Đặc điểm dịch tễ học
HAV là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nên hội chứng
vàng da nhiễm trùng trên thế giới. 1,4 triệu ca bệnh hàng năm trên thế giới
và chi phí điều trị lên tới 1,5 cho đến 3 tỷ đô la Mỹ hàng năm.
HAV gây bệnh trên ngời, vợn (Pan troglodytes), khỉ mắt cú (Aotus
trivirgatus), khỉ cộc đuôi (Macaca speciosa) và một vài loài khỉ đuôi sóc
Nam Mỹ (Saguinus mystax và S.labiatus). Bệnh phát triển trên động vật
linh trởng gần giống nh ngời nhng thờng nhẹ hơn.
Đờng lây truyền chính là đờng tiêu hóa từ ngời này sang ngời
khác. Khả năng lây truyền cao nhất trong thời kỳ 3 đến 10 ngày trớc khi
khởi đầu của bệnh, khi có lợng virút bài tiết cao nhất qua phân. Tuy nhiên,
việc đào thải kháng nguyên HAV và HAV ARN kéo dài hơn đối với trẻ sơ

16
sinh hoặc trẻ nhỏ so với ngời lớn. Có nghiên cứu đã xác định đợc HAV

ARN trong phân trẻ sơ sinh tới 4-5 tháng sau khi bị nhiễm.
Sự đào thải của virút qua phân là nguyên nhân chủ yếu gây nên những
vụ dịch ở các trung tâm chăm sóc trẻ sơ sinh, quân đội, nhà trẻ và trong
cộng đồng. Ngợc lại với kiểu lây truyền giữa ngời ngời, sự bùng nổ
của các vụ dịch thờng do nguồn thực phẩm hoặc nớc uống chung bị
nhiễm phân.
Một vài vụ dịch lớn liên quan đến việc tiêu thụ sò sống hoặc không
đợc nấu chín từ nguồn nớc ô nhiễm với nớc thải. Vụ dịch lớn nhất gần
đây xẩy ra ở Thợng Hải năm 1988 với hơn 300.000 ca bệnh.
Các nghiên cứu về hình thái lây truyền cùng với các kỹ thuật sinh học
phân tử đã chỉ ra rằng trạng thái virút huyết có thể tồn tại 7 đến 10 ngày
trớc khi có triệu chứng lâm sàng. Lây truyền HAV qua máu hiếm gặp
nhng có thể xẩy ra do sau truyền máu bị nhiễm virút viêm gan.


17


Hình 4 : Bản đồ dịch tễ học nhiễm HAV trên thế giới

Có 4 hình thái nhiễm HAV trên thế giới dựa trên tỷ lệ mang kháng thể
anti-HAV liên quan đến tuổi. Các hình thức này biến đổi từ vùng có tỷ lệ
cao nh châu Phi, một phần châu á và Mỹ La tinh, nơi có phần lớn các
trờng hợp nhiễm HAV xẩy ra trong thời kỳ thơ ấu cho đến vùng có tỷ lệ
thấp và rất thấp nh Bắc Mỹ và Tây Âu, nơi phần lớn các trờng hợp nhiễm
xẩy ra ở ngời trởng thành. Các trờng hợp nhiễm ở trẻ dới 6 tuổi đều
không có triệu chứng và nếu có triệu chứng lâm sàng thì thờng nhẹ và
không đặc hiệu. Các trờng hợp nhiễm ở trẻ lớn và ngời trởng thành
thờng có triệu chứng và hội chứng vàng da là biểu hiện lâm sàng chính.
Tỷ lệ tử vong tăng từ 0,2% trong trẻ 5-14 tuổi cho tới 1,8% trong nhóm

18
ngời lớn trên 50 tuổi bị nhiễm HAV. Tại vùng có tỷ lệ mang kháng thể
anti-HAV cao, tỷ lệ bệnh có thể thấp do phần lớn các trờng hợp bị nhiễm
ở lứa tuổi nhỏ không có triệu chứng lâm sàng. Sự lan truyền xẩy ra giữa
ngời và ngời nhng những vụ dịch từ nớc hoặc thực phẩm ô nhiễm có
thể xẩy ra. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV trung bình, tỷ lệ bệnh cao vì virút
lu hành trong quần thể ở mức độ cao có thể gây bệnh cho trẻ lớn, ngời
trởng thành, thiếu niên và có biểu hiện lâm sàng. Sự lây truyền qua tiếp
xúc giữa ngời và ngời có thể gây ra những vụ dịch lớn, lây truyền qua
nớc và thực phẩm cũng có thể xẩy ra. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV thấp,
phần lớn trẻ lớn, thiếu niên và ngời trởng thành đều có khả năng cảm thụ
bệnh nhng tỷ lệ bệnh thấp hơn do ít cơ hội tiếp xúc với virút. Phần lớn các
hình thái lây nhiễm là từ ngời sang ngời, thờng liên quan đến các vụ
dịch lớn, có thể có những vụ dịch do thực phẩm ô nhiễm nhng không thể
là nguyên nhân chính của bệnh. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV rất thấp, bệnh
thờng giới hạn trong nhóm ngời lớn ở một vài quần thể xác định nh
khách du lịch quốc tế và tiêm chích ma túy.
Bởi vì mức độ lu hành HAV liên quan chặt chẽ đến mức độ phát triển,
việc cải thiện điều kiện vệ sinh và điều kiện sống cùng với tăng cao điều
kiện kinh tế xã hội sẽ chuyển dịch lứa tuổi cảm nhiễm sang nhóm tuổi lớn
hơn. Điều này biểu hiện bằng sự giảm tỷ lệ anti-HAV theo tuổi và tăng
quần thể không đợc bảo vệ ở trẻ lớn, thiếu niên và ngời trởng thành. Sự
thay đổi hình thái từ tỷ lệ anti-HAV cao trong quần thể đến tỷ lệ trung bình
có thể gây ra tỷ lệ bệnh cao.