Thực tập sinh học động vật potx

Bài giảng TH CNSHĐV
1
Bài 1
NHẬN DIỆN KHÁNG NGUYÊN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP OUTERLONY


I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Các khái niệm cần nhớ
Miễn dòch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại bỏ các vật lạ
(kháng nguyên - Ag: Antigen). Từ cổ xưa, người ta đã biết ứng dụng
miễn dòch trong việc phòng trừ một số bệnh nhiễm khuẩn, vì thế khái
niệm về miễn dòch học đã xuất hiện từ rất sớm. Tuy nhiên, cho tới cuối
thế kỷ thứ XIX, miễn dòch học mới trở thành một môn khoa học riêng
biệt. Trong lòch sử phát triển của môn miễn dòch học, quan niệm về đáp
ứng miễn dòch thay đổi theo tiến bộ của khoa học kỹ thuật và đồng thời
nó cũng có mối liên hệ mật thiết với một số ngành khoa học khác như
Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học…
Trong cơ thể động vật bậc cao (trong đó có người), đáp ứng miễn
dòch có thể tạm chia ra thành hai loại: đáp ứng miễn dòch tự nhiên và
đáp ứng miễn dòch thu được. Tuy nhiên hai khái niệm này có mối quan
hệ mật thiết với nhau. Nói chung, khi có một yếu tố lạ có hại- có thể
gây các hiệu ứng sinh hóa (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể, hệ
thống miễn dòch có nhiệm vụ nhận biết và sau đó có những hoạt động
có hiệu quả tiếp theo để loại bỏ. Đáp ứng miễn dòch dòch thể và đáp
ứng miễn dòch tế bào là hai phương thức mà hệ thống miễn dòch sử dụng
để chống lại kháng nguyên. Đối với miễn dòch dòch thể thì kháng thể
hòa tan, chính xác hơn là globulin miễn dòch đảm đương chức năng này.
Các globulin miễn dòch này được sản xuất từ các tế bào plasma (tương
bào), biệt hóa từ lympho bào B.
Theo nghóa rộng thì tất cả các chất nội dòch đều có thể giúp sinh

vật chống đỡ lại yếu tố kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể. Tuy nhiên,
kháng thể dòch thể được hiểu ở đây là thành phần globulin miễn dòch có
trong huyết thanh miễn dòch (thành phần này có khoảng 20% trong
huyết thanh).

Bài giảng TH CNSHĐV
2











Hình 45 :Sơ đồ cấu trúc phân tử Ig.
Về phân loại, người ta chia Ig thành các lớp phân tử sau:
+ Globulin miễn dòch G (IgG): chiếm khoảng 70-75% tổng số Ig
của huyết thanh người. Đây là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp
ứng miễn dòch và cũng là phân tử độc quyền kháng độc tố. Lớp
IgG có vai trò quan trọng nhất trong cơ chế đáp ứng miễn dòch.
+ Globulin miễn dòch A (IgA): chiếm khoảng 15-20% tổng số Ig
trong huyết thanh. Chúng có hai loại là IgA nội dòch huyết thanh
và IgA tiết ra ngoài niêm mạc. IgA là phương tiện bảo vệ tại chỗ
rất hữu hiệu của cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của kháng nguyên
(virus, vi khuẩn, tế bào lạ, các phân tử sinh hóa…)
+ Globulin miễn dòch M (IgM): chiếm khoảng 10% tổng lượng

IgG huyết thanh, chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong những
trường hợp nhiễm khuẩn sớm.
+ Globulin miễn dòch D (IgD): chiếm 1% tổng lượng Ig huyết
thanh. Cho tới hiện nay thì chức năng chính của IgD vẫn chưa
được xác đònh rõ ràng, nhưng người ta thường thấy nồng độ của
chúng tăng chậm trong những trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính
nhưng không đặc hiệu cho loại nhiễm khuẩn nào.
+ Globulin miễn dòch E (IgE): rất ít, chúng chỉ chiếm khoảng
0,004% tổng lượng Ig huyết thanh. Vai trò của IgE là khởi động
việc giải phóng các sản phẩm từ tế bào bạch cầu ưa kiềm.

Bài giảng TH CNSHĐV
3

2. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể
IgG trong hệ thống miễn dòch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với
kháng nguyên. Đây là một trong những chức năng quan trọng nhất bên
cạnh các chức năng khác như hoạt hóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa cơ
chế vận chuyển qua màng tế bào…
Khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có được là do cấu trúc
đặc biệt của phân tử globulin miễn dòch .

Hình 46:Hình cấu trúc không gian
của protein kháng thể và cách bắt Ag.

Phản ứng in-vitro diễn ra giữa kháng nguyên kháng thể hay còn
được gọi là các phương pháp huyết học (serological assays) đã và đang
được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh.
Sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể chính là kết quả của hàng
loạt các phản ứng tủa, phản ứng ngưng kết, phản ứng cố đònh bổ thể và

phản ứng miễn dòch đánh dấu. Sản phẩm hóa lý của sự kết hợp kháng
nguyên với kháng thể mà cụ thể là kết quả của phản ứng trung hòa
kháng nguyên có ý nghóa rất lớn và được

Bài giảng TH CNSHĐV
4
II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
- Lame 9 x 8,5cm.
- Bộ dụng cụ đục lỗ thạch.
- Bình tam giác.
- Ống tiêm 1ml.
- Buồng ẩm.
- Agarose tinh khiết.
- Nước muối sinh lý.
- Dung dòch đệm PBS.
- Dung dòch nhuộm màu Commassive brilliant blue.
- Dung dòch tẩy màu.
- Vaccine DPT.
- Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu.
- Huyết thanh chuẩn (đã biết trước nồng độ).
- Giải độc tố bạch hầu.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
(Phương pháp khuyếch tán hai chiều do Outerlony đề xuất)
- Giải hấp phụ vaccine DPT: dùng vaccine DPT để giải hấp phụ
độc tố bạch hầu ra khỏi gel aluminum bằng dung dòch Na Citrat nồng độ
2% trong 24 giờ.
- Tiến hành phản ứng nhận diện: dùng phản ứng khuyếch tán kép
(double diffusion) do Outerlony đề xuất (được gọi tắt là phản ứng
Outerlony).

- Các bước tiến hành như sau:
+ Chưng thạch: Agarose tinh khiết 1% pha trong dung dòch
đệm PBS có pH= 7,2.
+ Đổ thạch lên lame: dùng lame nhỏ hoặc film 2,5x8cm,
khoảng 3ml thạch/ lame.
+ Đục lỗ thạch.



Bài giảng TH CNSHĐV
5












Hình 47 : Cách bố trí các lỗ thạch trên lame.

Tiến hành phản ứng Outerlony trong buồng ẩm, thực hiện nhuộm
và ép tiêu bản.
GỒM CÁC BƯỚC SAU:
 Ngâm tiêu bản vào dung dòch sinh lý trong 12- 18 để loại bỏ các
yếu tố kết hợp không đặc hiệu.

 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm commassive brilliant blue
trong 10 phút.
 Rửa sạch thuốc nhuộm bằng cách ngâm tiêu bản vào dung dòch
tẩy màu (chú ý trong quá trình ngâm phiến phải thay dung dòch
tẩy màu thường xuyên). Cẩn thận tránh làm biến dạng phiến
thạch hoặc bong agarose.
 Ép khô tiêu bản.

IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
Không để hóa chất dây vào tay, quần áo
Làm thí nghiệm, sinh viên phải mang găng tay

V. YÊU CẦU
- Nộp lại cho cán bộ hướng dẫn mẫu kết quả

Huyết thanh kháng độc tố
bạch hầu 50 Iu/ml
Vaccine DPT đã giải hấp phụ được pha loãng
ở các nồng độ khác nhau
Lame
Bài giảng TH CNSHĐV
6
Bài 2
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HUYẾT
THANH TỪ MÁU NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
a. Đònh nghóa
Huyết thanh là huyết tương không có fibrinogen và một số yếu tố
đông máu khác.

b. Vai trò của huyết thanh trong Công nghệ Sinh học động vật
Là thành phần quan trọng, không thể thiếu đối với môi trường
nuôi cấy mô và tế bào động vật. Huyết thanh có các đặc điểm:
(1) Cung cấp các chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như
các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên
tố vi lượng…
(2) Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào
phân chia.
(3) Chứa các protein có khả năng làm bất hoạt trypsin (một
enzyme được sử dụng để tách tế bào động vật) tránh hiện
tượng enzyme gây tổn thương tế bào.
(4) Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
(5) Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các
yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ.
(6) Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy mạnh và ức
chế độc tính của oxy.
Huyết thanh còn là nguyên liệu hàng đầu trong điều chế vaccin và
công nghiệp dược phẩm nói chung.

c. Nguyên tắc thu nhận huyết thanh

Máu tươi vừa được lấy ra trực tiếp từ cơ thể động vật thường được
để yên trong vài giờ, trong suốt thời gian này fibrinogen chuyển thành
fibrin gel (cục máu đông). Cục máu đông này co dần lại và làm chừa ra
phần dòch lỏng hay huyết thanh của máu. Người ta thu nhận lấy phần
dòch lỏng này trong điều kiện vô trùng.
Bài giảng TH CNSHĐV
7
Các bước thiết yếu trong việc thu nhận huyết thanh bao gồm:

- Thu nhận máu từ cơ thể.
- Tạo cục máu đông trong bình chứa.
- Tách huyết thanh khỏi cục máu đông bằng lọc và ly tâm.
- Tinh sạch, bảo quản.
II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
1. Hóa chất
- Hóa chất bảo quản: merthiolate cần được sử dụng với nồng độ
sao cho việc bổ sung chúng vào huyết thanh sẽ không làm loãng
huyết thanh.
- Mẫu máu (thu nhận từ thỏ).
2. Dụng cụ - thiết bò

a. Dùng cho việc thu máu
 Thỏ 2,5kg hoặc nặng hơn (không cho ăn trong 12 giờ trước đó để
huyết thanh thu được ít lipid nhất).
 Bàn cột thỏ, 4 đoạn dây cột.
 Dao cạo mới.
 Kéo, pince y tế.
 Bông gòn + cồn 70
o
.
 Bộ dụng cụ lấy máu:
+ Kim tiêm vô trùng, 18G, 2in.
+ Ống dẫn nhựa hoặc cao su.
+ Ống nghiệm vô trùng có sẵn nắp đậy.
 Đèn bóng tròn 15W (đặt bên dưới tai thỏ, làm nóng để máu
không đông nhanh trong quá trình lấy máu).
 Băng keo y tế.
 Chai đựng máu có nắp đậy (đã hấp khử trùng).
 10.Giá để ống nghiệm.

 11.Găng tay, khẩu trang và quần áo bảo hộ.
 12.Đồ cấp cứu cá nhân.

b. Dùng cho việc thu nhận huyết thanh
 Tủ lạnh.
 Que gỗ vô trùng.
Bài giảng TH CNSHĐV
8
 Micropipette 100-1000l + tip.
 Máy li tâm ống nghiệm.
 Chai thủy tinh có nắp vặn để chứa huyết thanh (vô trùng).
 Phễu lọc + giấy lọc (vô trùng).
 Milipore filter (màng lọc) 0,22-0,45m.
 Thiết bò làm lạnh sâu (-80
0
C  -20
0
C).
 Giấy hoặc khăn lau sạch.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Phương pháp thu máu

a. Cố đònh thỏ nằm úp trên bàn thao tác
b. Cạo lông trên tai thỏ để có thể nhìn thấy rõ tónh mạch tai.
c. Để lấy máu dễ dàng, cần làm giãn nở mạch bằng cách dùng đèn
bóng tròn 15W làm ấm mặt trong của tai thỏ.
d. Sát trùng nơi đònh lấy máu trên tai thỏ.
e. Ghim kim tiêm vào tónh vạch theo chiều hướng vào gốc tai thỏ

(ngược với chiều chảy của máu).
f. Giữ thỏ nằm yên và thu máu vào ống nghiệm vô trùng gắn với
kim tiêm qua ống dẫn.
g. Phương pháp này có thể thu được đến 20ml máu thỏ (một con,
một lần). Nếu máu ngưng chảy, búng nhẹ vào tónh mạch tai để có
thể tiếp tục thu máu.
h. Sau khi thu đủ thể tích máu cần dùng, đặt gòn hoặc gạc lên vết
cắt, dùng ngón cái và ngón trỏ để ép chặt vết thương lại.
i. Dùng băng keo để giữ miếng gạc đúng vò trí.
j. Thu huyết thanh theo quy trình bên trên.
k. Xử lý và bảo quản.
2. Thu nhận huyết thanh
a. Để yên mẫu máu trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng nhằm tạo
cục máu đông. Cẩn thận tách cục máu đông khỏi thành ống nghiệm
bằng thìa thép hoặc que gỗ. Giữ ống nghiệm đựng máu trong tủ lạnh
trong vòng 12-24 giờ để cục máu đông co lại.
b. Gạn lấy phần huyết thanh vào các ống nghiệm sạch và li tâm
với tốc độ 1000xg trong 30 phút ở 4
o
C (khoảng 2500 vòng đối với
Bài giảng TH CNSHĐV
9
rotor có bán kính 14cm). Cẩn thận lấy huyết thanh ra bằng cách gạn
lấy phần dòch trong bên trên hoặc dùng pipette hút ra
c. Thường thì huyết thanh thu được ở lần li tâm đầu tiên chứa
một ít bạch cầu, để loại những tế bào này, cần li tâm lặp lại các sản
phẩm đã thu ở lần ly tâm thứ nhất như mô tả trên.
e. Khử trùng huyết thanh thu được bằng phương pháp lọc
f. Thêm chất bảo quản, sau đó bảo quản lạnh để giữ được huyết
thanh trong nhiều ngày.

g. Để thuận lợi cho việc lưu giữ huyết thanh và do mỗi khi sử
dụng chỉ cần một lượng nhỏ, huyết thanh cần được chia vào nhiều chai
đựng có kích thước nhỏ. Đây là điều bắt buộc khi thực hiện lưu trữ
huyết thanh ở trạng thái đông lạnh.

IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
 Trong quá trình làm cần thật nhẹ nhàng, tránh gây lắc mạnh ống
đựng máu khiến vỡ tế bào hồng cầu.
 Sau khi lấy máu (không quá 10ml) thì phải khử trùng vết thương
trên tai thỏ ngay và băng lại.
 Khử trùng toàn bộ dụng cụ.
 Trước khi li tâm phải cân đối trọng cho đều các ống nghiệm

V. YÊU CẦU
- Huyết thanh có màu vàng nhạt đều, trong suốt, ít có hồng cầu vỡ.
- Không có lớp mỡ váng bên trên.
- Không có lớp cặn dưới đáy chai đựng.
- Không có bọt khí hoặc vật lạ hoặc các sợi huyết lơ lửng.
- Huyết thanh thu được đảm bảo vô trùng.
+ Dòch nuôi cấy đục so với ban đầu: có sự hiện diện của vi sinh vật
trong mẫu huyết thanh.
+ Dòch nuôi cấy không đổi so với ban đầu: không có sự hiện diện
của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh.
- Cũng có thể kiểm tra vi sinh vật bằng cách cấy mẫu để theo dõi
sự phát triển của các khuẩn lạc
Bài giảng TH CNSHĐV
10

Để lạnh 4
o

C, 12-24h

Lặp lại 2-3 lần
Ly tâm 4
o
C, 50.000g, 20 phút

Gạn lấy phần huyết thanh cho vào chai đựng

Ly tâm 1000g, 30 phút, t
o
=40
o
C

Hút dòch trong ra

BẢO QUẢN Ở –20
O
C
Chia thành các mẫu nhỏ
Lọc vô trùng

Lọc qua giấy lọc nhám
QUY TRÌNH THU NHẬN HUYẾT THANH.
Thu máu
Để yên 1-2h, t
o
phòng

Tách cục máu đông khỏi thành chai đựng

Bài giảng TH CNSHĐV
11
Bài 3
TÁCH TẾ BÀO TỪ MÔ ĐỘNG VẬT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRYPSIN

I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Nuôi cấy sơ cấp (primary culture)
Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa
được tách ra từ mô hay cơ quan.
Các tế bào thu được trong lần nuôi sơ cấp này được gọi là tế bào sơ
cấp (primary cell). Các tế bào sơ cấp thường không thuần nhất vì là hậu
duệ của nhiều tế bào ban đầu khác nhau.
Để thực hiện quá trình nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu
tiên là tách chúng thành các tế bào riêng rẽ từ những mảnh mô và cho
chúng bám vào giá thể phù hợp.
Việc tách tế bào có thể thực hiện bằng biện pháp cơ học hay bằng
enzym để tạo thành một dòch huyền phù tế bào. Hầu hết các loại tế bào
động vật bình thường (trừ tế bào máu) đều cần bám vào một giá thể để
sống và phát triển với hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, những tế bào ung
thư có thể phát triển ở trạng thái lơ lửng trong môi trường.
Có nhiều loại enzym được sử dụng để tách tế bào như collagenase,
elastase, hyaluronidase, pronase…nhưng trypsin được dùng phổ biến
nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá rẻ.
Trypsin có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các
protein liên kết các tế bào với nhau. Tuy nhiên trypsin cũng có thể làm
tổn thương màng tế bào trong quá trình tách, do đó cần phải xác đònh
nồng độ enzym và thời gian tách tối ưu.

Các nhà khoa học thường mong muốn có thể tiến hành nghiên
cứu một chức năng nhất đònh của một mô hay một tế bào trong một hệ
thống đơn giản. Để thực hiện điều này, người ta tìm cách tách tế bào ra
khỏi mô nội quan của cơ thể và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều
kiện nhân tạo.
Đây là kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật. Bằng kỹ
thuật tách tế bào động vật, chúng ta có thể làm chủ được những dòng tế
bào tạm thời hay liên tục, từ đó có những ứng dụng quan trọng về sau.
Bài giảng TH CNSHĐV
12
Tế bào sơ cấp là các tế bào được tách ra lần đầu tiên và chưa hề
qua nuôi cấy. Các tế bào này có thể tạo lớp đơn. Người ta có thể dùng
các tế bào lớp đơn để thực hiện các test vi sinh vật và miễn dòch. Mỗi
lớp đơn của các tế bào sơ cấp thường rất nhiều chủng loại, có thể tìm
kiếm được các tế bào mầm trong lớp đơn khi phân lập và đem cấy
chuyền nhiều lần.
Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép có
thể thu được một lượng lớn tế bào rời trong thời gian ngắn. Nhờ đó, việc
nuôi cấy sơ cấp có nhiều thuận lợi và tiết kiệm được thời gian, do có sự
tăng cường khả năng tiếp xúc giữa các tế bào với môi trường.
Tuy nhiên, điều quan trọng cần chú ý là phải làm giảm đến mức
thấp nhất sự tiếp xúc giữa tế bào với trypsin hoạt động, nhằm giữ cho tỷ
lệ sống của tế bào càng cao càng tốt.
+ Do đó trong quá trình tách tế bào bằng trypsin ở 36,5
o
C thì các tế
bào rời cần được thu mỗi 30 phút. Trypsin được loại ra bằng cách ly tâm
và hoạt tính bò ức chế do huyết thanh hiện diện trong môi trường.
+ Quy trình tách tế bào bằng cách ngâm mô trong trypsin ở 4
o

C, 6-
18 giờ sẽ cho phép trypsin thấm vào khối mô với hoạt tính trypsin thấp
nhất và quá trình phân giải có thể tiến hành tiếp theo đó với thời gian
ngắn hơn nhiều (20-30 phút), ở 37
o
C.
Mặc dù phương pháp sử dụng trypsin lạnh cho phép thu được
nhiều tế bào sống và tế bào cũng ít bò ảnh hưởng của trypsin hơn, nhưng
phương pháp sử dụng trypsin ấm vẫn được sử dụng một cách rộng rãi do
ít tốn thời gian và ít phức tạp hơn.

Bài giảng TH CNSHĐV
13



II. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
1.Vật liệu: Gan bò
Bài giảng TH CNSHĐV
14
2. Hóa chất
-Dung dòch PBS.
-Dung dòch trypsin 1%.
-Môi trường nuôi cấy (E'MEM-10% huyết thanh).
3. Dụng cụ- thiết bò
-Erlen 50ml vô trùng.
-Pipetman 200 -1000l.
-Pipetman 10 -100l.
-Đầu tip vô trùng.
-Máy lắc.

-Kéo nhïn vô trùng.
-Đóa petri vô trùng.
-Becher 250ml.
-Pipette 1ml, 2ml, 5ml vô trùng.
-Bóp cao su (loại nhỏ).
-Bóp cao su (các loại).
-Kính hiển vi.
-Buồng đếm tế bào.
-Máy Vortex.
-Máy sấy.
-Lamelle.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Tách tế bào
a) Cân 3 mẫu mô gan, mỗi mẫu 5g. Rửa mẫu trong đóa Petri vô
trùng bằng dung dòch PBS 3 lần, hút bỏ dòch rửa.
b) Cho 3 mẫu gan vào 3 erlen vô trùng, cắt nhuyễn mô gan bằng
kéo vô trùng.
c) Cho vào mỗi erlen (đánh số 1, 2, 3).
-Erlen 1: 18ml PBS + 2ml trypsin 1%.
-Erlen 2: 15ml PBS + 5ml trypsin 1%.
-Erlen 3: 12ml PBS + 8ml trypsin 1%.
Như vậy, ta được 3 dung dòch trypsin có nồng độ 0,1; 0,25;
0,4% tương ứng với erlen 1, 2, 3.
d) Lắc các erlen mẫu trên máy lắc.
Bài giảng TH CNSHĐV
15
e) Sau 60, 90, 120 phút, lấy mẫu ở mỗi erlen và xác đònh mật
độ tế bào gan trong dung dòch bằng buồng đếm. Lưu ý phân biệt tế bào

gan và tế bào hồng cầu.


Hình : Tế bào động vật trong phòng đếm.

IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
- Thời gian phải chính xác trong suốt quá trình lắc và đếm mật độ
tế bào.
- Rửa sạch máu để tránh đếm nhầm tế bào máu trong buồng đếm.

V. YÊU CẦU
Xác đònh nồng độ trypsin và thời gian tối ưu để tách tế bào.

Bài giảng TH CNSHĐV
16
Bài 4

TÁCH VÀ NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO
SƠ PHÔI GÀ



I. MỤC ĐÍCH:

 Làm quen với kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật.
 Tách tế bào từ phôi gà và nuôi cấy sơ cấp.
 Phân lập dòng tế bào cơ bản từ phôi gà.
 So sánh kết quả nuôi cấy từ hai dòng tế bào cơ.

II. PHƯƠNG PHÁP TẠO TẾ BÀO SƠ CẤP :

 Tế bào sơ cấp là tế bào được tách ra lần đầu tiên và chưa hề qua
nuôi cấy. Các tế bào này có thể tạo lớp đơn. Người ta có thể dùng các
tế bào lớp đơn để thực hiện các test vi sinh vật và miễn dòch. Mỗi lớp
đơn của các tế bào sơ cấp thường rất nhiều chủng loại, có thể tìm kiếm
được các tế bào mầm trong lớp đơn khi phân lập và đem cấy chuyền
nhiều lần.
 Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép có
thể thu được một lượng lớn tế bào rời trong thời gian ngắn. Nhờ đó, việc
nuôi cấy sơ cấp có nhiều thuận lợi và tiết kiệm được thời gian, do có sự
tăng cường khả năng tiếp xúc giữa các tế bào với môi trường mà việc
tách tế bào cũng trở nên dễ dàng hơn.
 Tuy nhiên, đối với phương pháp này, điều quan trọng cần chú ý là
phải làm giảm đến mức thấp nhất sự tiếp xúc giữa tế bào với enzyme
Trypsin hoạt động, nhằm giữ cho tỷ lệ sống của tế bào càng cao càng
tốt. Để thực hiện điều này chúng ta có 2 phương pháp:
+ Qui trình Trypsin ấm: Trong quá trình tách tế bào bằng Trypsin
ở 36,5
0
C, các tế bào sẽ được tách rời và được thu nhận sau 30 phút.
Trypsin được loại ra bằng cách li tâm, lọc bằng giấy lọc. Sau đó, cho
vào môi trường nuôi cấy. Hoạt tính bò ức chế do huyết thanh hiện diện
trong môi trường.
Bài giảng TH CNSHĐV
17
+ Qui trình Trypsin lạnh: Quá trình tách tế bào bằng cách ngâm
mô trong trypsin bằng 4
0
C trong 6- 18 giờ sẽ cho phép Trypsin ngấm
vào khối mô với hoạt tính Trypsin ở mức thấp nhất. Sau khi loại bỏ

Trypsin, quá trình phân giải có thể tiến hành bằng cách ủ ấm ống chứa
mô ở 36.5
0
C với thời gian ngắn hơn nhiều (20-30 phút).

Mặc dù phương pháp sử dụng Trypsin lạnh cho phép thu được
nhiều tế bào sống và tế bào cũng ít bò ảnh hưởng của Trypsin hơn ,
nhưng phương pháp sử dụng Trypsin ấm vẫn được sử dụng một cách
rộng rãi do ít tốn thời gian và ít phức tạp hơn .

 Có một số phương pháp tách bằng cơ học thuần túy, tuy nhiên các
phương pháp này không đem lại hiệu quả cao.
Ở bài này, chúng ta sử dụng qui trình Trypsin ấm để tách tế bào phôi gà
và tiến hành nuôi cấy sơ cấp những tế bào này.
II.1. Dụng cụ
 Khay inox
 Miếng lót cao su
 2 bộ dụng cụ mổ (kéo thẳng, kéo cong, pinch thẳng, pinch
cong)
 ng nghiệm
 Đóa petri (đường kính 10cm)
 Becher 50ml và 100ml
 Erlen 50 ml
 Eppendorf 1500l
 Kim tiêm 1ml
 Tip 10 - 100l và 100 - 1000l
 Lame
 Pipette (1ml, 2ml, 5ml, 10ml)
 Micropipette (10 - 100l và 100 - 1000l)
 Pipettus - Junior

 Phòng đếm tế bào NEUBAUER
 Đóa nuôi cấy 4 giếng, đóa petri nuôi cấy tế bào
 Đèn cồn
 Gòn không thấm, gòn thấm, vải mùng, giấy lọc
 ng đong 100ml, 500ml, 1000ml
 Bình đònh mức 100ml
 Chai thủy tinh nút nhám 100ml
Bài giảng TH CNSHĐV
18
II.2. Thiết bò
 Phòng vô trùng
 Cân điện tử
 pH kế
 Autoclave
 Phin lọc (filter)
 Tủ lạnh
 Tủ cấy vô trùng

II.3. Hóa chất
II.3.1. Dung dòch PBS (Phosphate Buffered Saline)
 NaCl :10g
 KCl : 0,25g
 Na
2
HPO
4
.12H
2
O: 3,6g
 KH

2
PO
4


: 0,255g
 Nước cất : đủ 1.000ml
II.3.2. Dung dòch L - Glutamine 200mM
 L-glutamine: 7,25g
 NaCl : 5g
 Nước cất

: đủ 500ml
II.3.3. Penicillin - Streptomycin 200X
 Penicillin G : 1.000.000 đơn vò
 Streptomycin sulfate: 1g
 PBS : đủ 50ml
II.3.4. Amphotericin B 0,1%
 Amphotericin B vô trùng: 100mg
 Nước cất vô trùng

: 100ml
II.3.5. Bicarbonate 7,5%
 NaHCO
3
: 7,5g
 Nước cất: đủ 100ml
Bổ sung: _100l Pen-strep 200X
_ 20l Ampotericin B
Bài giảng TH CNSHĐV

19
II.3.6. HEPES 1M
 HEPES : 11,915g
 Nước cất: đủ 50ml
II.3.7. Phenol Red 0,4%
 Phenol red: 0,2g
 Nước cất : 50ml
II.3.8. Dung dòch NH
4
Cl 10X
 NH
4
Cl

: 8,4g
 Nước cất: 100ml
II.3.9. Môi trường E'MEM 5%
 E’MEM

: 4,72g
E'MEM có thành phần như sau:
Thành
phần

Nồng độ
(mg/l)
Muối vô cơ
CaCl
2

200. 0

KCl
400. 0

MgSO
4
. 7 H
2
O
200. 0

NaCl
6800. 0

NaHCO
3

2200. 0

NaH
2
PO
4
.H
2
O
140. 0
Glucose
D-Glucose

1000. 0
Amino acid
L-Arginine
.
HCl
126. 0

L-Cystine
24. 0

L-Glutamin
292. 0

L-Histidine
.
HCl
.
H
2
O
42. 0

L-Isoleucine
52. 0

L-Leucine
52. 0

L-Lysine
.

HCl
73. 1

L-Methyonine
15. 0

L-Phenylalanine
33. 0
Bài giảng TH CNSHĐV
20

L-Threonine
48. 0

L-Tryptophane
10. 0

L-Tyrosine
36. 0

L-Valine
47. 0
Vitamin
D-Ca pantothenate
1. 0

Choline chloride
1. 0

Acid Folic

1. 0

I-Inositol
2. 0

Nicotinamide
1. 0

Pyridoxal HCl
1. 0

Riboflavine
0. 1

Thyamine HCl
1. 0

 Phenol Red 0,4%

: 1ml
 NaHCO
3
7,5% vô trùng : 7,5ml
 HEPES 1M vô trùng

: 10ml
 Amphotericin B vô trùng: 125l
 Pen-strep 200X : 2,5ml
 Glutamine 200mM

: 5ml
 Huyết thanh

: 50ml
(FBS: Fetal Bovine Serum)
 Nước cất : đủ 500 ml











Bài giảng TH CNSHĐV
21
III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN:






 Trên đây là những hình ảnh ghi nhận được trong quá trình tách tế
bào cơ của phôi gà để nuôi cấy sơ cấp.
 Để xác đònh nồng độ tế bào đem đi nuôi cấy, ta sử dụng phương
pháp đếm bằng phòng đếm hồng cầu. Kết quả ghi nhận được:

+ Trung bình một ô nhỏ ở phòng đếm trên ta có: 0.7125 tế bào
+ Diện tích một ô nhỏ là : 0.0025 mm
2

+ Chiều cao một ô nhỏ : 0.1 mm

Thể tích một ô nhỏ : 0.0025 x 0.1 = 0.00025 mm
3

Vậy mật độ đem đi nuôi cấy là : 0.7125 : 0.00025 = 2850 tế
bào/mm
3

Mật độ tế bào đem đi nuôi cấy: 2850 x 1000 = 285 x 10
4
tế bào/ml
(vì 1 ml = 1 cm
3
)

Các tế bào đã bám và
mọc tại bề mặt nuôi cấy.
Bài giảng TH CNSHĐV
22
Vậy mật độ tế bào đem đi nuôi cấy khoảng: 285 x 10
4
tế bào/ml

IV. NHẬN XÉT VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ:

 Ta thấy mật độ tế bào đem đi nuôi cấy thấp: 285 x 10
4
tế bào/ ml.
 Vì trong quá trình sử dụng Trypsin để phân cắt tế bào, có thể ta
cho nồng độ Trypsin hơi cao hoặc trong thời gian khuấy từ ta để thời
gian hơi lâu.
 Mẫu có sự hiện diện nấm do có sự nhiểm khuẩn, do sai sót trong
thao tác chưa đảm bảo vô trùng.

giảng TH CNSHĐV

21
Bài 5
TẾ BÀO SINH DỤC
CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ

I. ĐẠI CƯƠNG

1. Hệ sinh dục đực

a. Cấu tạo
- Tinh hoàn (testis): có cấu trúc dạng cặp được bọc trong một túi (bìu).
Bên trong tinh hoàn có nhiều ngăn, trong mỗi ngăn đều là tổ chức mô biệt hóa
và sinh sản tinh trùng.
- Mào tinh (epididymis): được nối với tinh hoàn, đây là các đường dẫn của
tinh trùng.
- Ống dẫn tinh (ductus deferens): nối với các ống mào tinh.
- Túi tinh: nơi chứa tinh trùng và tiết dòch trộn với tinh trùng tạo tinh dòch.
Túi tinh còn là nơi tập kết tạm thời của tinh trùng trước khi ra ngoài.
- Tuyến tiền liệt: sản xuất dòch (có trong thành phần của tinh dòch) được

tiết vào túi tinh.
- Niệu đạo: nằm trong dương vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo.
- Dương vật: xuất tinh và bài xuất nước tiểu.

b. Sinh lý tinh trùng
Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: đầu, thân và đuôi.
+ Phần đầu: chứa thể đỉnh acrosome, đây là nơi giải phóng các enzyme
giúp cho tinh trùng xâm nhập trứng.
+ Phần thân: chứa ty thể, có liên quan đến các hoạt động chuyển hóa chất
và năng lượng.
+ Phần đuôi: có vai trò vận động, không tham gia vào quá trình thụ tinh.


Hình 7.1: Cấu tạo tế bào tinh trùng.
giảng TH CNSHĐV

22
Số lượng tinh trùng: chiếm trung bình 5% thể tích tinh dòch (95% dòch tiết).
Ở người, trung bình có 3ml tinh dòch cho một lần xuất tinh số lượng trung bình
từ 60-120 triệu tế bào/ml. Số lượng trên ở bò là 4-5ml và lợn là 150-200ml.
Tinh trùng vận động bằng cách tự quẫy đuôi.
Sự sinh tinh xảy ra gần như suốt đời sống của cá thể đực, tuy nhiên số
lượng và chất lượng tế bào có thể thay đổi.

Cơ chế của sự sinh tinh

Điều kiện để quá trình thụ tinh xảy ra bình thường:
+ Tinh trùng gặp trứng sau 12 giờ phóng vào ống dẫn trứng.
+ Số lượng tinh trùng phải đảm bảo trong 1ml tinh dòch.
+ Tỷ lệ % tinh trùng dò dạng không vượt quá 2-5%.

+ Phần đầu tinh trùng có chứa đủ lượng enzyme hyaluronidase.


Hình 7.2: Cấu tạo tinh hoàn (a) và sự sinh tinh (b).
2. Hệ sinh dục cái
a. Cấu tạo
Buồng trứng: nơi chứa các nang trứng.

Tinh nguyên bào Tinh bào 4 tinh trùng (n)
NP
GP
Ống
sinh tinh
Vách
ngăn


Mào tinh hoàn
Vỏ bao tinh
hoàn
Dây tinh
hoàn
Ống dẫn
tinh
Màng
cơ sở
Tinh nang
Tế bào
Sertoli
Tế bào tinh

trùng
Ống
sinh
tinh
Vách
ngăn
giảng TH CNSHĐV

23
Vòi tử cung (ống dẫn trứng): nơi trứng gặp tinh trùng và thụ tinh (ở 1/3 ống
dẫn trứng).
Tử cung: cơ quan để thai làm tổ và phát triển.
Âm đạo: cơ quan giao hợp.
Một số cơ quan phụ (thứ cấp) khác.
b. Sinh lý buồng trứng
Buồng trứng cấu tạo dạng cặp, gồm 2 phần vỏ và tủy. Phần vỏ chứa các tế
bào trứng đã phát triển, phần tủy có nhiều mạch máu và bạch huyết, một số tế
bào phụ trợ khác.
Các trứng non nằm dưới màng liên kết (nang nguyên thủy).



Hình 7.3: Buồng trứng và sự phát triển các giai đoạn của trứng.

Ở người, khi sơ sinh có khoảng 3.10
4
-3.10
5
nang trứng nguyên thủy. Khi
trưởng thành còn 400-500 nang.

Hình 7.4: Thời điểm kích hoạt hormon cho tới khi rụng trứng.