immunohistochemistry cancer

SIMINAR

IMMUNOHISTOCHEMISTRY TRONG
CHẨN ĐOÁN UNG THƯ


MỤC LỤC

2


DANH SÁCH HÌNH

3


DANH SÁCH BẢNG

4


1. Giới thiệu
1.1. Sơ lược về các phương pháp chẩn đoán ung thư
1.1.1 Chẩn đoán qua lâm sàng
Ung thư là loại bệnh mạn tính, trải qua nhiều giai đoạn phát triển: khởi
phát, tăng trưởng thúc đẩy, chuyển tiếp, lan tràn, di căn.
Khi ở giai đoạn ban đầu, vì kích thước q nhỏ và ln có những biến
đổi về mặt dịch thể (chưa có các men, các chất do u tiết ra),nên trên lâm sàng
cũng như trên xét nghiệm chưa thể phát hiện được u.
Về sau khi kích thước khối u dần phát triển, một số chất do tế bào ung
thư tiết ra cũng có thể đủ để phát hiện bệnh.

Tuy nhiên chẩn đốn qua lâm sàng sẽ khơng phù hợp trong trường hợp
khối u nằm ở vị trí khó phát hiện, bệnh trong giai đoạn sớm, vì thế bạn có thể
cân nhắc và lựa chọn các phương pháp hiện đại hơn trong chẩn đoán ung thư ở
trong phần dưới.
1.1.2. Chuẩn đốn hình ảnh
Các xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh được sử dụng trong chẩn đoán ung
thư bao gồm: chụp X quang, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ
hoặc chụp PET-CT giúp các bác sĩ quan sát chi tiết các bộ phận bên trong cơ
thể, đồng thời phát hiện ra các bất thường, chẳng hạn như khối u.
Xquang
Là phương pháp điển hình trong chẩn đốn bệnh ung thư. Chẳng hạn
Xquang phổi để phát hiện ung thư phế quản, phát hiện những di căn ở phổi.
Ung thư vú, ung thư xương, ung thư thận… cũng được phát hiện nhơ phương
pháp này.
Chụp cắt lớp vi tính (CT-Scan)
Một phương pháp mới, hiện đại với kỹ thuật điện quang được hoàn thiện.
Scanner cho phép nghiên cứu toàn bộ cơ thể và phát hiện được những khối u
nhỏ, khoảng 1 cm đường kính ở sâu như u não, u trung thận, u tụy, u sau phúc
mạc, u khung chậu...
Siêu âm

5


Siêu âm có giá trị để phát hiện những khối u gan, u buồng trứng, u thận.
Siêu âm cho biết được tính chất của khối u (u đặc, u nang ...). Siêu âm còn
giúp hướng dẫn sinh thiết khối u qua da đạt hiệu quả cao, ít làm tổn thương tổ
chức xung quanh.
PET/CT
Phương pháp PET/CT là thiết bị y khoa hạt nhân áp dụng công nghệ kết

hợp giữa máy PET và máy CT, có thể phát hiện được khoảng 80% các loại
ung thư, cả ung thư giai đoạn sớm ngay sau khi cơ thể chỉ mới có sự thay đổi
bệnh lý về chuyển hóa mà chưa hình thành tổn thương về mặt cấu trúc.
Ngồi ra, thiết bị cịn giúp tìm kiếm ở các bệnh nhân vị trí ung thư di
căn, vị trí ung thư nguyên phát, giúp các bác sĩ tiên lượng và có nững phương
pháp điều trị hiệu quả.
1.1.3. Chẩn đoán qua nội soi
Nội soi là phương pháp thăm khám các hốc tự nhiên và một số nội tạng
của cơ thể nhờ những phương tiện quang học (máy nội soi). Mỗi cơ quan có
máy nội soi riêng và ngày càng hoàn thiện nhờ sự tiến bộ của kỹ nghệ quang
học.
Nội soi đóng vai trị quan trọng trong chẩn đốn ung thư dạ dày, ung thư
đại tràng, ung thư thực quản, ung thư hạ họng thanh quản, ung thư phế quản,
ung thư bàng quang ...
Trong đó, ung thư dạ dày và ung thư đại trực tràng là loại ung thư gặp
khá phổ biến trong bệnh lý về đường tiêu hóa. Phần lớn ung thư dạ dày và đại
tràng chỉ được phát hiện thông qua nội soi.
Với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, nơi soi tiêu hóa khơng cịn
đáng sợ như nhiều người vẫn nghĩ. Hiện nay, ngồi nội soi thường (nội soi
tươi) người bệnh có thể lựa chọn hình thức soi có gây mê nhằm làm giảm bớt
cơn đau mà kết quả vẫn hồn tồn chính xác.
1.1.4. Chẩn đoán qua các xét nghiệm
Các xét nghiệm trong chẩn đoán ung thư gồm: xét nghiệm máu, xét
nghiệm tủy, xét nghiệm tế bào... Mỗi loại xét nghiệm lại tương thích với từng
bệnh khác nhau.
6


Xét nghiệm máu
Phương pháp để tìm dấu ấn ung thư hay chính xác hơn là định lượng dấu

ấn ung thư trong máu cũng có giá trị nhất định nếu biết cách sử dụng. Xét
nghiệm này thật sự hữu ích trong đánh giá tình trạng nặng, nhẹ cũng như dự
đốn diễn tiến của bệnh trong quá trình điều trị.
Một số xét nghiệm máu giúp hỗ trợ trong chẩn đoán ung thư như:
Xét nghiệm kháng nguyên PSA giúp phát hiện ung thư tuyến tiền liệt
•

•

Xét nghiệm kháng nguyên CA 125 – một dạng kháng nguyên ung thư
125 trong máu giúp phát hiện ung thư buồng trứng
Xét nghiệm CA 199 phát hiện ung thư tụy, dạ dày…
Tuy nhiên, xét nghiệm máu thường phải kết hợp cùng các xét nghiệm
khác để đưa ra kết quả chính xác nhất, bởi kết quả xét nghiệm có lúc cho âm
tính giả, có lúc cho dương tính giả.
Xét nghiệm tủy để phát hiện ung thư máu
Phương pháp này giúp xác định chính xác hơn khả năng mắc ung thư
máu của bệnh nhân. Theo phương pháp này, các chuyên gia sẽ tiến hành chọc
tủy và đem đi xét nghiệm để phân loại và xác định các loại tế bào máu trong
tủy. Nếu lượng Junvenile cell trong máu tăng cao, vượt q 5% hoặc thậm chí
có thể hơn 30% thì có thể xác định bệnh nhân bị ung thư máu.
Xét nghiệm tế bào cổ tử cung
Xét nghiệm tế bảo cổ tử cung (xét nghiệm Pap) dùng để phát hiện tế bào
tiền ung thư trước khi chúng có thể chuyển thành ung thư xâm lấn. Nếu tế bào
tiền ung thư được tìm thấy, có thể tiến hành điều trị và ngăn chặn trước khi nó
bắt đầu ung thư.
1.1.5. Chẩn đốn qua sinh thiết
Sinh thiết là một xét nghiệm chẩn đoán ung thư được áp dụng cho hầu
hết tất các loại ung thư, vì nó cung cấp kết quả chính xác.

7


Thông thường, các bác sĩ Ung bướu sẽ cho làm sinh thiết sau khi một
loạt các xét nghiệm, chẩn đoán chẳng hạn như X-quang, CT,… và đã xác định
được khối u.
Trong quá trình thực hiện phương pháp này, bác sĩ sẽ phẫu thuật cắt bỏ 1
số mô và quan sát dưới kính hiển vi để tìm kiếm dấu hiệu của ung thư.
1.2. Sơ lược về hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry)
Hóa mơ miễn dịch (IHC) là q trình xác định chọn lọc kháng nguyên
(protein) trong tế bào của một mẫu mô nhờ nguyên tắc kháng nguyên gắn đặc
hiệu với kháng thể. Hóa mơ miễn dịch bắt nguồn từ "immuno" có nghĩa là q
trình sử dụng kháng thể, và "histo: có nghĩa là mô học được Albert Coons lần
đầu đưa ra và thực hiện vào năm 1941.
Hóa mơ miễn dịch (IHC) là sự kết hợp của 2 lĩnh vực: miễn dịch học và
mô học. Kỹ thuật IHC được sử dụng để xác định xem liệu một mơ có bộc lộ
hoặc khơng biểu lộ một kháng nguyên riêng biệt, xác định tình trạng kháng
ngun của các tế bào riêng biệt trong mơ đó và vị trí của kháng nguyên trên
tế bào. HMMD sử dụng các kháng thể để phân biệt sự khác nhau về kháng
nguyên giữa các loại tế bào. Sự khác nhau về kháng nguyên này có thể giúp
nhận biết một cách đặc hiệu dịng tế bào, xác định tính chất sinh học các quần
thể tế bào khác nhau trong cùng một dòng, nhận biết những sự khác biệt chức
năng giữa các tế bào.

8


Hình 1: Sơ lược hóa mơ miễn dịch
Ngày nay, kỹ thuật này trở thành phổ biến và đóng vai trị quan trọng
trong việc đánh giá các dấu ấn sinh học trong ung thư, phát hiện nguồn gốc

của sự biệt hóa các tế bào và mơ, là cơng cụ hữu ích trong chẩn đoán xác định
các bệnh ung thư, dự đoán đáp ứng điều trị và tiên lượng bệnh. Hiện nay, đối
với bệnh ung thư vú, việc điều trị thường phải dựa vào việc đánh giá các yếu
tố tiên lượng. Bên cạnh các yếu tố tiên lượng kinh điển như kích thước u, tình
trạng di căn hạch nách, loại mơ học, độ mơ học... các nhà nghiên cứu cịn đi
sâu đánh giá các yếu tố sinh học. Ngoài đánh giá ER và PR giúp điều trị nội
tiết, người ta còn đánh giá một số các yếu tố khác như Her-2/neu, Ki67, p53,
sự tạo mạch và vi di căn bằng nhuộm HMMD để có một phác đồ điều trị
chuẩn mực cũng như tiên lượng bệnh.
Nhuộm hóa mơ miễn dịch là phương pháp được áp dụng phổ biến. Được
thực hiện để phát hiện các tế bào bị bệnh trong cơ thể. Đặc biệt nhất là tế bào
ung thư. Phương pháp này sử dụng kết hợp hóa chất với phản ứng miễn dịch.
Qua đó quan sát sự tồn tại của kháng nguyên ung thư trong một mô bệnh
phẩm. Thông thường, các kháng nguyên này khơng được thể hiện dưới dạng
một hình thái sinh học có thể quan sát. Bằng cách “nhuộm” với kỹ thuật miễn
dịch huỳnh quang hoặc miễn dịch men. Từ đó các bác sĩ có thể nhận biết
9


chúng một cách dễ dàng dưới kính hiển vi. Nhuộm hóa mơ sinh học là cơ sở
quan trọng để kết luận bệnh ung thư.
Hóa mơ miễn dịch là phương pháp xác định những kháng ngun đặc
hiệu có trong mơ hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể.
Hóa mơ miễn dịch đã áp dụng trong giải phẫu bệnh phẫu thuật từ lâu trên thế
giới và trở thành thường quy. Cách làm hóa mơ miễn dịch là từ mẫu mô đã
được đúc trong khối nến của phương pháp giải phẫu bệnh thường quy, được
cắt mỏng và nhuộm theo quy trình như sau: Bộc lộ kháng nguyên - ủ với
kháng thể thứ 1 - ủ với kháng thể thứ 2 - nhuộm với chất chỉ thị màu (DAB
hoặc AEC) - nhuộm Hematoxylin và đọc trên kính hiển vi thơng thường.
Phương pháp hóa mơ miễn dịch rất cần thiết cho việc xác định chính xác

các loại ung thư, xác định nguồn gốc tế bào của những bướu kém biệt hóa,
khơng biệt hóa bằng những kháng thể đặc hiệu của dịng tế bào như: Tế bào
biểu mơ, tế bào trung mô, tế bào limphô, tế bào sắc tố, tế bào thần kinh nội
tiết.
Hóa mơ miễn dịch cũng giúp xác định các loại ung thư biểu mô di căn
không rõ nguồn gốc nguyên phát; các loại ung thư trung mô (sarcoma); giúp
xác định các loại ung thư của tế bào hệ lympho; xác định các loại lympho
không Hogdkin: Loại tế bào B, tế bào T và các phân nhóm, xác định lympho
Hogdkin, xác định các dấu ấn sinh học trên tế bào bướu trong một số loại ung
thư như: bướu tế bào mầm, bướu của tế bào gan tụy.
Hóa mơ miễn dịch cũng giúp xác định các thụ thể nội tiết của tế bào
bướu như: ER (Estrogen), PR (Progesterone) trong ung thư vú và ung thư
tuyến nội mạc tử cung; xác định các biểu hiện quá mức của các gen sinh ung
trong tế bào bướu: Her2, EGFR, trong ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư
phổi; xác định chỉ số tăng sinh của tế bào bướu như Ki67, giúp xác định mức
độ ác tính của ung thư, xác định bệnh nhiễm trùng, nhiễm virus: Hepatitis B,
Herpesviruses, Adenoviruses, Epstein-Barr Virus, HIV...; nhiễm vi trùng:
Helicobacter Polori (HP); tổn thương dạng nhú của vú; bướu tuyến nước bọt...
Giúp chẩn đoán phân biệt u lành hay ác tính, u là của cơ quan nào. Do
hình ảnh của tổn thương rất giống nhau, đơi khi rất khó để khẳng định tổn
thương của bệnh nhân là lành tính hay ác tính, tổn thương là của cơ quan nào
nếu tổn thương nằm ở vị trí giao thoa hay u đã xâm lấn 2 hay nhiều cơ quan kề
nhau.
Giúp phân loại u lympho ác tính

10


Định hướng nguồn gốc của ung thư di căn. Bệnh nhân nhập viện được
chẩn đoán với tổn thương di căn ở vị trí nào đó, tuy nhiên khơng phải lúc nào

u nguyên phát cũng được xác định chắc chắn. Hóa mơ miễn dịch giúp xác
định u ngun phát đó để điều trị cho bệnh nhân.
2. Ngun lý của hóa mơ miễn dịch
2.1 Một số khái niệm
2.1.1 Hóa mơ miễn dịch
Hóa mô miễn dịch là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, sử dụng kháng thể
(KT) đặc hiệu để xác định sự hiện diện của các kháng nguyên (KN) tương ứng
trên các lát cắt mô học hoặc trên các loại tế bào có trong mơ.
Ngun tắc: cho KT đặc hiệu lên mơ, nếu trong mơ có KN sẽ có phản
ứng kết hợp KN - KT. Có 2 cách quan sát phức hợp này:
+ Miễn dịch huỳnh quang: KT được gắn với một chất phát huỳnh quang
(quan sát kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang). Chất huỳnh quang có thể
được gắn trực tiếp vào kháng thể đặc hiệu, gọi là phương pháp miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp hoặc gắn vào kháng thể thứ hai đặc hiệu với kháng thể
thứ nhất, gọi là phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
+ Miễn dịch men: KT được gắn với một vài loại men, men này xúc tác
cho một phản ứng hóa học để chuyển một chất khơng màu thành một chất có
màu (quan sát được dưới kính hiển vi quang học).
2.1.2 Kháng nguyên
Các KN thường là các protein, một số khác là carbohydrate, có thể từ
ngoài cơ thể vào (vi khuẩn, độc tố, virus,…) hoặc từ trong cơ thể (các tơ trung
gian, các thụ thể hormon, các protein là sản phẩm của đột biến gen…, có thể
hiện diện ở bào tương, màng tế bào hoặc nhân).
Quyết định KN (epitope) là một phần nhỏ của KN, nơi tiếp xúc với KT.
Một KN có thể có vài epitope, mỗi epitope được nhận biết bởi một KT riêng
biệt. Trong qui trình nhuộm HMMD, cần bộc lộ epitope trước khi cho tiếp xúc
với KT.
2.1.3 Kháng thể
KT là các protein nhận biết và kết nối với KN đặc hiệu, được sản xuất từ
sự đáp ứng với biểu hiện của KN. Mỗi KT có ít nhất hai vị trí kết nối KN.

KT chủ yếu là IgG, tiếp đến là IgM. KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là
KT thứ nhất. Tuỳ theo cách sản xuất, có 2 loại KT:
11


+ KT đa dòng: được sản xuất bằng cách gây miễn dịch ở động vật với
KN đặc hiệu. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao
gồm nhiều loại KT đặc hiệu và không đặc hiệu. Sau đó KT được làm tinh khiết
(loại bỏ các KT khơng cần thiết). KT đa dịng có thể kết hợp với nhiều vị trí
của một KN nên độ nhạy cao, tăng khả năng phát hiện. Tuy nhiên KT đa dịng
có thể chứa các KT phản ứng không đặc hiệu với các KN nên có khuynh
hướng nhuộm nền cao.
+ KT đơn dòng: được sản xuất bằng kỹ thuật u lai, phối hợp khả năng tạo
KT đặc hiệu từ tương bào với lympho bào B ở lách động vật được gây miễn
dịch, hình thành nhiều dịng tế bào u lai sản xuất ra KT đặc hiệu. Các tế bào
này được lựa chọn và nhân giống trong môi trường nuôi cấy tế bào. KT đơn
dòng được sản xuất ra từ một dòng của tế bào u lai nên rất tinh khiết, chỉ phản
ứng với một loại quyết định KN. Tuy nhiên, vì KT đơn dịng chỉ phản ứng với
một vị trí đặc hiệu chứ khơng phải tồn bộ KN nên ít nhậy hơn so với KT đa
dòng. Hơn nữa, một số KT đơn dòng chỉ phản ứng được trên tiêu bản cắt lạnh.
Cấu trúc của KT có hình chữ Y với 4 chuỗi protein, gồm 2 chuỗi nhẹ và
2 chuỗi nặng. KT có hai vùng:
+ Vùng thay đổi (Fab): hai phần đầu của nhánh chữ Y chứa vị trí kết nối
KN.
+ Vùng ổn định (Fc): phần gốc của chữ Y, đây là vùng rất quan trọng vì
có thể kết nối với bổ thể hay các tế bào.
2.1.4 Hệ thống nhận biết
vì các phức hợp KN - KT không quan sát thấy được dưới kính hiển vi
quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng KN-KT. Hệ
thống này gồm 2 phần: KT thứ 2 (KT bắc cầu) và hệ thống phóng đại dấu hiệu

nhận biết (gồm men, các phân tử phát hiện, chất kết nối và chất màu).
+ Kháng thể thứ hai (KT bắc cầu, KT kết nối): là KT phản ứng đặc hiệu
với KT thứ nhất sau khi KT này đã gắn với KN. Nó phản ứng với phân tử
globulin miễn dịch huyết thanh của động vật mà đã sản xuất KT thứ nhất. KT
thứ hai thường được gắn biotin và được coi như kít phát hiện chung.
+ Các enzym: enzym là một protein gây ra sự thay đổi hoá học của các
chất khác nhưng bản thân nó khơng thay đổi, enzym đóng vai trị như chất chỉ
điểm. Trong kỹ thuật HMMD, enzym cần phải đảm bảo được các điều kiện
sau:
• Phải tạo ra một sản phẩm phản ứng mà khơng thể hồ tan, màu rõ ràng,
kết tủa trực tiếp tại sản phẩm đó.
12


• Phải được bền vững ở nhiệt độ phịng, có thể sản xuất được nhiều và có
thể duy trì hầu hết các hoạt động của nó sau khi đã kết nối.
Chỉ có một vài loại enzym đáp ứng được những nhu cầu trên, hai loại
enzym được sử dụng rộng rãi do sản xuất dễ và giá thành thấp là peroxydase,
được chiết xuất từ rễ cây cải ngựa và phosphatase kiềm (Alkaline
phosphatase), chiết xuất từ E.Coli hoặc từ đại tràng.
+ Các phân tử phát hiện: protein A, biotin và avidin là những phân tử
phát hiện. Các IgG hoặc những đoạn của nó phải ở dạng đã được tinh chế. Sự
kết nối tốt chỉ có thể đạt được khi đoạn phân tử IgG lấy từ huyết thanh được
sử dụng như một chất khởi động. Cần lưu ý, các KT không được lẫn với các
protein, các peptid hoặc những chất khác có chứa nhóm amino. Chất kết nối:
những chất này phải có hai chức năng:
• Có thể phản ứng với men.
• Phản ứng đồng thời hoặc tiếp theo với phân tử phát hiện để hình thành
cầu nối giữa các kháng thể.
Sự kết nối hố học gây nên bởi cầu nối này phải khơng bị thay đổi và

không bị phá huỷ bởi các hoạt động của men và của kháng thể. Càng giữ cho
hoạt động sinh học của các thành phần này tốt thì quá trình kết nối càng được
thực hiện tốt.
+ Chất tạo hợp chất màu: dùng để tạo ra một sản màu tại vị trí kết hợp
KN-KT mà có thể quan sát được trên kính hiển vi quang học. Phản ứng này
cũng để chứng minh sự có mặt của men. Hiện nay, các phòng xét nghiệm
HMMD thường sử dụng diaminobenzidine (DAB), loại này tạo ra một sản
phẩm màu nâu, bền vững trong nhiều năm. Ngồi ra, người ta cịn sử dụng 3amino-9-ethylcarbazole (AEC), tạo ra sản phẩm màu đỏ mà không bị nhầm
với sắc tố melanin, vì vậy AEC hay được dùng trong các bệnh của da. AEC
hay bị hoà tan trong các dung mơi của mơ, vì thế phải cần một số vật liệu đặc
biệt cho việc gắn. Mặt khác, sản phẩm màu của AEC không bền vững, dễ bị
phai màu theo thời gian và nó cũng là một chất có thể gây ung thư nên AEC ít
được sử dụng hơn DAB. Hiện nay cũng có một số chất tạo màu đưa ra những
sản phẩm phản ứng màu khác như chloronaphthol để tạo ra sản phẩm màu
xanh.
2.2. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch men (enzyme)
2.2.1 Phản ứng Elisa
2.2.1.1. Phản ứng Elisa là gì?

13


ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Hay còn gọi là phương
pháp ELISA hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một phương pháp sinh hoá
sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng
thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu.
Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu
như y học, nông nghiệp và trong các quy trình kiểm tra an tồn chất lượng các
sản phẩm sinh học.
2.2.1.2. Nguyên lí chung của xét nghiệm Elisa

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó.
Kháng thể này được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và
tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa
KN-KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát
ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay khơng có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Các thành phần tham gia phản ứng elisa
+ Kháng nguyên
+ Kháng thể
+ Chất tạo màu
2.2.1.3. Phân loại Elisa
+ Direct ELISA ( ELISA trực tiếp)
+ Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)
+ ELISA sandwich
+ ELISA cạnh tranh

14


Hình 2: Phân loại ELISA
2.2.1.3.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Hình 3: ELISA trực tiếp
Đơn giản và tiết kiệm thời gian
Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA.

Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể
và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn
enzyme).

15


Hình 4: Sơ đồ các bước tiến hành ELISA trực tiếp
Ưu điểm của phương pháp ELISA trực tiếp
So với các phương pháp ELISA khác, phương pháp này được thực hiện
trong thời gian ngắn hơn vì chỉ có một kháng thể được sử dụng và ít bước tiến
hành hơn. Điều này có thể được sử dụng để kiểm tra phản ứng kháng thể kháng nguyên cụ thể, và giúp loại bỏ phản ứng chéo giữa các kháng thể khác.
Nhược điểm của phương pháp ELISA trực tiếp
Các kháng thể chính phải được đánh dấu riêng, nên tốn nhiều thời gian
và không linh hoạt khi thực hiện nhiều thí nghiệm.
Ngồi ra, kỹ thuật này có độ nhạy thấp hơn do các tín hiệu được khuếch
đại ít hơn, nghĩa là độ nhạy thấp hơn.
2.2.1.3.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)
Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể
bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của
một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme).

16


Hình 5: ELISA gián tiếp
- Các bước tiến hành:

Hình 6: Sơ đồ các bước tiến hành ELISA gián tiếp
Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều

loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này
dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm
với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được.
2.2.1.3.3 ELISA sandwich - Độ nhạy cao
- Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do
nó cho phản ứng mạnh và nhạy
- ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể
(kháng thể bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định
17


lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng ngun có khả năng liên kết với các
kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich.

Hình 7: ELISA sandwich
Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như
là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich.
Kháng thể đơn dịng có một epitope duy nhất cho phép phát hiện và định
lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường
được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt.
(Epitope- Quyết định kháng nguyên, là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với
kháng thể).
- Quy trình thực hiện:

Hình 8: Sơ đồ các bước tiến hành ELISA sandwich
+ Chuẩn bị bề mặt đã biết trước lượng kháng thể bắt được gắn.
+ Khóa các vị trí bám khơng đặc hiệu trên bề mặt.
+ Cho các mẫu có chứa kháng nguyên lên đĩa.
+ Rửa đĩa, để loại bỏ các kháng nguyên không gắn.

18


+ Thêm một kháng thể đặc hiệu vào, và gắn với kháng nguyên (do đó gọi
là "sandwich": kháng nguyên bị kẹp giữa hai kháng thể);
+ Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - đây là kháng thể phát hiện,
kháng thể này sẽ liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể (không đặc
hiệu).
+ Rửa đĩa, để các liên kết enzyme- kháng thể không gắn bị loại bỏ.
+ Thêm cơ chất của enzyme để tạo màu hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc
điện hóa.
+ Đo độ hấp thụ hoặc huỳnh quang hoặc tín hiệu điện của các giếng để
xác định sự có mặt và số lượng kháng nguyên
Đặc điểm nổi bật của phương pháp Sandwich ELISA:
+ Mẫu không cần phải được tinh sạch trước khi phân tích.
+ Độ đặc hiệu cao, vì sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất
phân tích được bắt và phát hiện đặc hiệu.
+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp, bới vì các kháng ngun khơng u
cầu địi hỏi phải tinh sạch trước khi tiến hành định lượng.
+ Linh hoạt và độ nhạy cao, vì cả hai phương pháp phát hiện trực tiếp và
gián tiếp đều có thể được sử dụng. Độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương
pháp ELISA trực tiếp hoặc gián tiếp, nhưng thấp hơn ELISpot.
2.2.1.3.4 ELISA cạnh tranh
Vấn đề chủ yếu của ELISA cạnh tranh là quá trình gắn cạnh tranh thực
hiện bởi kháng nguyên gốc (kháng nguyên mẫu) và kháng nguyên được thêm
vào. - Quy trình của phương pháp ELISA cạnh tranh khác một vài điểm so với
ELISA gián tiếp, ELISA sandwich và ELISA trực tiếp.
- Quy trình cơ bản :

19

Hình 9: Sơ đồ các bước tiến hành ELISA cạnh tranh
(1). Kháng thể chính- sơ cấp (chưa đánh dấu) được ủ với kháng nguyên
mẫu.
(2). Phức hợp kháng thể- kháng nguyên sau đó được thêm vào đĩa 96
giếng đã được phủ trước các kháng nguyên tương tự.
(3). Kháng thể không bám được sẽ bị loại bỏ thông qua bước rửa đĩa.
(Càng nhiều kháng nguyên trong mẫu, càng ít kháng thể sẽ có thể liên kết với
các kháng nguyên trong giếng, do đó gọi là "cạnh tranh".)
(4). Các kháng thể thứ cấp gắn enzym mà đặc hiệu với các kháng thể sơ
cấp sẽ được thêm vào.
(5). Thêm cơ chất, enzyme phân giải cơ chất và tạo tín hiệu màu hoặc
huỳnh quang.

Hình 10: Sơ đồ các bước tiến hành ELISA cạnh tranh

20


Đối với phương pháp ELISA cạnh tranh, nồng độ kháng nguyên mẫu
càng cao, các tín hiệu cuối cùng càng yếu. Ưu điểm chính của phương
pháp này là khả năng sử dụng các mẫu thô hoặc không tinh khiết mà vẫn
gắn chọn lọc bất kỳ kháng nguyên nào có mặt. (Lưu ý rằng một số bộ kit
ELISA cạnh tranh bao gồm kháng nguyên gắn enzyme nhiều hơn là kháng thể
gắn enzyme. Kháng nguyên đánh dấu sẽ cạnh tranh vị trí gắn với kháng thể sơ
cấp với kháng nguyên trong mẫu (kháng nguyên này không đánh dấu). Kháng
nguyên trong mẫu càng nhiều thì càng ít kháng ngun đánh dấu được giữ lại
trong giếng và tín hiệu càng yếu).
Đặc điểm nổi bật của phương pháp ELISA cạnh tranh:

+ Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất
phân tích được giữ và phát hiện.
+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp, vì các kháng ngun khơng địi
hỏi tinh sạch trước khi tiến hành phản ứng.
+ Tính linh hoạt và độ nhạy cao.
+ Phát hiện được lượng kháng nguyên ít - kháng nguyên càng ít tín hiệu
càng mạnh.
2.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng Elisa
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
+ Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng.
+ Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
+ Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA
+ Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm
từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị
nhiễm.
+ Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu
thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện
bảo quản
+ Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm
tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo
màu.

21


+ Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng khơng tạo màu với đối chứng
dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện
bảo quản.
+ Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên

thay đổi một yếu tố thí nghiệm.
2.2.1.5. Ứng dụng của Elisa
Kỹ thuật Elisa (Enzyme-linked immunosorbent assay) là một phương
pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện
của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu. Sau đây là một số ứng
dụng chính của Elisa.
- Trong y học kĩ thuật elisa được sử dụng phổ biến, và là xét nghiệm rất
hữu ích để :
+ Đo lượng kích thích tố tuyến giáp: T3, T4, FT3, FT4
+ Xét nghiệm nội tiết tố sinh dục: Estradiol, FSH, Visual – HCG, LH,
Progesterone, Prolactin, Testosterone, Cortisol..
+ Phát hiện các dấu ấn ung thư: CEA, AFP, PSA, NSE, Beta HCG, CA
153, CA199, CA 125….
+ Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng
nguyên p24.
+ Giúp chẩn đoán các loại virus viêm gan( B, C,...)
+ Giúp chẩn đoán các loại vi khuẩn,virus và các loại kí sinh trùng
Trong thực phẩm
+ Kỹ thuật ELISA có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực
phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.
+ Phát hiện độc tố trong tảo
+ Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonell, Staphylococcus aureus, sán lá
gan,.. trong thực phẩm.
+ Phát hiện chất chloramphenicol trong tôm, cá và cá sản phẩm thuỷ sản
+ Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ,
thuốc trừ sâu,…
2.2.2. Men – chống men

22

Phương pháp PAP (phương pháp peroxidase chống peroxidase) là một
bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật gián tiếp và nó liên quan đến lớp thứ ba
là kháng thể thỏ với peroxidase, kết hợp với peroxidase để tạo nên phức hợp
peroxidase antiperoxidase rất bền vững. Phức hợp, bao gồm gaba-globulin thỏ
và peroxidase, hoạt động như một kháng nguyên lớp thứ ba và trở nên liên kết
với gaba-globulin chống thỏ không liên hợp của lớp thứ hai. Độ nhạy cao hơn
khoảng 100 đến 1000 lần vì phân tử peroxidase khơng liên hợp hóa học với
kháng IgG nhưng liên kết về mặt miễn dịch và khơng mất hoạt tính enzym của
nó. Nó cũng cho phép pha lỗng kháng thể chính cao hơn nhiều , do đó loại bỏ
nhiều kháng thể khơng mong muốn và giảm hiện tượng nhuộm nền không đặc
hiệu.
Phương pháp này có tính đặc hiệu và nhạy cảm hơn 2 phương pháp trên

Hình 11: Phương pháp PAP (phương pháp peroxidase chống peroxidase)
2.2.3. Cầu nối biotin – Streptavidin
Streptavidin, có nguồn gốc từ streptococcus avidini, là một cải tiến gần
đây để thay thế avidin. Phân tử streptavidin khơng tích điện so với mơ động
vật, khơng giống như avidin có điểm đẳng điện là 10, và do đó liên kết tĩnh
điện với mơ bị loại bỏ. Ngồi ra, streptavidin khơng chứa các nhóm
carbohydrate có thể liên kết với lectin mơ, dẫn đến một số vết màu nền.
Lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp không gắn nhãn . Lớp thứ hai là kháng
thể thứ cấp được đánh dấu biotin . Lớp thứ ba là liên hợp Enzyme-Streptavidin
23


(HRP-Streptavidin hoặc AP-Streptavidin) để thay thế phức hợp peroxidase
avidin-biotin. Sau đó, enzyme được hình dung bằng cách áp dụng các dung
dịch chromogen cơ chất để tạo ra các sản phẩm cuối cùng có khả năng so màu
khác nhau. Lớp thứ ba cũng có thể là Thuốc nhuộm huỳnh quang-Streptavidin

như FITC-Streptavidin nếu ưu tiên ghi nhãn huỳnh quang.
- Phương pháp này được sử dụng nhiều vì có tính nhạy cảm cao và đặc
hiệu cao. Avidine có ái lực mạnh với biotin và men peroxydase, làm cầu nối
cho men gắn vào biotin (trên kháng thể thứ hai). Một phân tử avidin có 4 vị trí
gắn men peroxydase nên hệ thống nhận biết được phóng đại lên gấp 4 lần.

Hình 12: Phương pháp Cầu nối biotin – Streptavidin
2.2.4. Chuỗi dextran
Phương pháp polyme: Hệ thống EnVision dựa trên cơng nghệ polyme
dextran. Hóa học độc đáo này cho phép liên kết một số lượng lớn các phân tử
enzym với một kháng thể thứ cấp thông qua xương sống dextran. Các lợi ích
mang lại là rất nhiều, bao gồm tăng độ nhạy, giảm thiểu hiện tượng nhuộm nền
không đặc hiệu và giảm tổng số bước xét nghiệm so với các kỹ thuật thông
thường.
Hệ thống nhận biết được phóng đại lên rất nhiều lần

24


Hình 13: Phương pháp chuỗi dextran

3. Makers IHC và sàng lọc kháng thể cho các markers IHC
3.1. Makers IHC
Markers IHC (Immunohistochemistry) hay cịn gọi là dấu ấn hóa mơ
miễn dịch. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp nhuộm IHC: cho kháng thể
(KT) đặc hiệu lên mơ, nếu trong mơ có kháng nguyên (KN) sẽ có phản ứng
kết hợp KN-KT. Trong trường hợp này, các kháng nguyên là các dấu ấn hóa
mơ miễn dịch đặc trưng cho tế bào hoặc mơ bệnh.
Kháng nguyên thường là các protein, một số khác là carbonhydrate.
Kháng nguyên có nhiều loại: các sợi trung gian: keratin, vimentin, desmin,

neurofilament, glial fibrillarry acidic protein; các thụ thể hormone (thụ thể
tranferin, estrogen, progesterom, androgen); các KN ung thư phôi, các sản
phẩm gen (bcl, p53, c-kit, ras, RGFR…). Biểu hiện kháng nguyên ở mỗi loại
tế bào là khác nhau, đây là cơ sở để xác định nguồn gốc các khối u.
3.1.1. Kháng nguyên thường sử dụng trong IHC
3.1.1.1. Nhóm các Cytokeratins và markers của tế bào biểu mô
a) Cytokeratins
Cytokeratin (CK) là các protein của các sợi trung gian chứa keratin. Các
protein này tìm thấy ở bộ khung trong tế bào chất của các tế bào biểu mơ
(epithelium). Có nhiều loại CK (được xếp theo số thứ tự), biểu hiện các loại
này đặc hiệu cho các mơ trong cơ thể ví dụ CK7 đặc trưng cho tế bào biểu mô

25