Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia

Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG THƯ VIỆN CHỨNG DƯƠNG CHO XÉT NGHIỆM
SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA
Bạch Thị Như Quỳnh1, Nguyễn Hải Bằng1, Hà Thị Thu2
Nguyễn Văn Thảnh, Vũ Thị Thu Trang1, Dương Quốc Chính3
TĨM TẮT

2

Mục tiêu: tạo thư viện chứng dương cho 6
đột biến trên gen alpha-globin. Đối tượng và
phương pháp: từ 200 bệnh nhân được chẩn đoán
mang gen bệnh Thalassemia tiến hành sàng lọc
nhằm phát hiện các đột biến SEA, THAI, α-4.2,
α-3.7, HbCs và C.2delT bằng kỹ thuật MultiplexPCR. Các gen đột biến được tạo dịng trong tế
bào E. Coli với chủng DH5α, ni cấy tăng sinh
để tạo thư viện chứng dương. Các dòng tế bào tái
tổ hợp được tiến hành đánh giá ngoại kiểm tại
Viện Huyết Học và Truyền máu Trung ương trên
quy trình phát hiện đột biến gen gây bệnh alpha
thalassemia bằng kỹ thuật multiplex PCR. Kết
quả: Từ các mẫu DNA của bệnh nhân dương tính
với alpha-thalassemia, nghiên cứu đã tạo ra
nguồn thư viện gồm các mẫu chứng dương tính
của 6 đột biến trên gen alpha-globin bao gồm:
SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT. Kết
quả ngoại kiểm cho thấy nguồn chứng dương
được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp ổn định và
đặc hiệu hơn khi so sánh với đối chứng dương là
mẫu máu người mang gen bệnh. Kết luận: Các

chứng dương tái tổ hợp đủ tiêu chuẩn sử dụng

Trường Đại học Y Dược Hải Phịng
Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa
học và công nghệ Việt Nam
3
Viện Huyết học và truyền máu Trung ương.
Chịu trách nhiệm chính: Bạch Thị Như Quỳnh
Email:
Ngày nhận bài: 11.1.2022
Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022
Ngày duyệt bài: 25.5.2022
1
2

12

trong xét nghiệm chẩn đốn bệnh alphathalassemia.
Từ khóa: Alpha-thalassemia, Thư viện chứng
dương, Công nghệ DNA tái tổ hợp.

SUMMARY
CREATING THE POSITIVE CONTROL
LIBRARY FOR MOLECULAR
BIOLOGY TECHNIQUES TO
DIAGNOSE OF ALPHA
THALASSEMIA
Objective: create a positive control library for
6 mutations on the alpha-globin gene. Subject
and method: 200 patients diagnosed with

Thalassemia genes were screened to detect
mutations SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs and
C.2delT using Multiplex-PCR technique. The
mutation genes were developed in E. coli cells
with DH5α strain, cultured and proliferated to
create the positive control library. Positive
controls were externally assessed at the National
Institute of Hematology and Blood Transfusion
using detection protocol for gene mutations
causing alpha thalassemia with multiplex PCR
technique. Result: From the available DNA of
alpha-thalassemia-positive patients, a library of
positive controls of 6 mutations in the alphaglobin gene was created, including SEA, THAI,
α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT. External quality
assessment results showed that the positive
controls generated by recombinant pathway are
more stable and specific comparing with the
positive controls derived from human blood
samples from genes carriers. Conclusion: The


TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022

recombinant positive controls can be applied in
diagnostic tests for alpha-thalassemia.
Keywords:
Alpha-thalassemia,
positive
control material, recombinant DNA technology.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Alpha-thalassemia là một bệnh lý di
truyền liên quan đến sự bất thường của
protein cấu trúc có chức năng vận chuyển
oxy của hồng cầu – Hemoglobin. Nguyên
nhân của bệnh là do bất thường về cấu trúc
và số lượng gen alpha-globin nằm trên cánh
ngắn nhiễm sắc thể số 16 [4]. Tùy thuộc vào
số gen alpha-globin bị bất thường dẫn tới các
kiểu hình thiếu máu từ nhẹ đến nặng hoặc tử
vong [5]. Những bệnh nhân alphathalassemia khơng có triệu chứng thường chỉ
được phát hiện khi làm xét nghiệm sinh học
phân tử về bất thường gen alpha-globin, do
đó tiềm ẩn nguy cơ di truyền gen bệnh cho
thế hệ sau. Việc phát hiện người lành mang
gen bệnh có ý nghĩa vô cùng to lớn trong tư
vấn di truyền nhằm hướng tới loại bỏ hoàn
toàn gen bệnh ra khỏi cộng đồng. Thành phố
Hải Phòng, từ năm 2018 đến nay, đã áp dụng
quy trình multiplex PCR trong chẩn đốn đột
biến gen gây bệnh thalassemia với 6 loại đột
biến phổ biến liên quan đến bệnh alphathalassemia tại khu vực Đông Nam Á cũng
như Việt Nam bao gồm: SEA, THAI, α-4.2,
α-3.7, HbCs, C.2delT [1].
Theo tiêu chuẩn của xét nghiệm đột biến
gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử, chứng
dương (positive control) chạy kèm trong mỗi
xét nghiệm là yếu tố bắt buộc phải có để
kiểm soát độ tin cậy của kết quả. Nguồn
chứng dương sẽ được thu thập từ đâu và

bằng cách nào luôn là một vấn đề mà những
người làm xét nghiệm chẩn đoán thực sự
quan tâm. Những yêu cầu này đã dẫn đến sự
thiếu hụt nghiêm trọng về các mẫu DNA

dương tính đặc biệt là những mẫu đột biến
hiếm do những chứng dương được sử dụng
tại Việt Nam hiện nay đều được tách chiết từ
máu của các bệnh nhân mang đột biến gen
alpha thalassemia [2]. Xuất phát từ lý do trên
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu
nhằm tạo ra thư viện gồm các mẫu đối chứng
dương cho 6 loại đột biến trên gen alphaglobin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
Sáu loại đột biến: SEA, THAI, α-4.2, α3.7, HbCs và C.2delT sàng lọc từ 200 bệnh
nhân được chẩn đoán mang gen bệnh
Thalassemia.
2. Địa điểm và thời gian: Nghiên cứu
được tiến hành tại Labo trung tâm - Trường
Đại học Y Dược Hải Phịng – Số 72A
Nguyễn Bỉnh Khiêm - Ngơ Quyền - Hải
Phòng. Thời gian nghiên cứu từ tháng
12/2019 đến tháng 3/2021.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu thực nghiệm
3.2. Các phương pháp sử dụng trong
nghiên
- Phương pháp thu mẫu

Phương pháp lấy mẫu thuận tiện, 2 mL
máu ngoại vi của bệnh nhân được thu thập
vào ống chống đông EDTA. Các mẫu được
thu thập dựa trên các dấu hiệu lâm sàng, chỉ
số hóa sinh, huyết học, điện di huyết sắc tố
điển hình của bệnh thalassemia. Loại trừ
những mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhũ
nhi dưới 6 tháng tuổi và những mẫu bệnh
phẩm có chỉ số hố sinh, huyết học cũng như
điện di huyết sắc tố khơng điển hình; bệnh
nhân không đồng ý chấp thuận tham gia
nghiên cứu.

13


Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

- Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn
phần theo kit Blood DNA Mini Kit
(OMEGA). Tất cả các mẫu sau tách chiết
được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch
bằng máy đo quang phổ Nanodrop.
- Phương pháp khuếch đại gen
Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu
được thừa hưởng từ nghiên cứu: “Xây dựng
quy trình phát hiện đột biến gen Thalassemia
tại Hải Phòng dựa trên kỹ thuật multiplex
PCR”. Thành phần phản ứng PCR (tổng thể

tích 25µL) gồm: GoTaq Hot Start Master
Mix 2x, 5 pmol primer, 100 - 150 ng DNA
khuôn. Chu trình nhiệt: 95°C/3 phút, 35 chu
kỳ [94°C/1 phút – 65°C /1 phút - 72°C/1
phút 30 giây], 72°C/8 phút, bảo quản 4°C.
Sản phẩm sau phản ứng được tiến hành điện
di trên gel agarose 1,5%, 100 Vol trong vòng
30 phút [1].
- Tạo dòng gen
Sản phẩm gen đột biến được gắn vào
vector tách dòng PCR2.1 biến nạp vào tế bào
E.coli chủng DH5 - . Các dòng tế bào được
sàng lọc bằng kỹ thuật enzyme cắt giới hạn;
kỹ thuật PCR và thực hiện giải trình tự gen
trên hệ thống ABI 3500 để khẳng định dòng
tế bào tái tổ hợp chứa các đột biến gen mong
muốn. Thực hiện kỹ thuật cấy chuyển sau 10
lần nuôi cấy và sau 3 tháng lưu giữ tại nhiệt
độ -800 để kiểm tra tính bảo tồn của gen
trong dịng tế bào tái tổ hợp. Kết quả giải
trình tự được so sánh với trình tự tham chiếu
trên ngân hàng gen bằng phần mềm BioEdit.
- Ngoại kiểm
Các dòng tế bào tái tổ hợp đại diện cho 6
loại đột biến được tiến hành ngoại kiểm trên
quy trình phát hiện đột biến gen gây bệnh
alpha thalassemia bằng kỹ thuật multiplex
PCR tại Viện Huyết học và Truyền máu
Trung Ương. Quy trình có sử dụng các mẫu
14

DNA là mẫu máu của các bệnh nhân mang
các đột biến trên gen alpha-globin tương ứng
với 6 loại đột biến trên để đối sánh. Kết quả
được phân tích so sánh giữa nguồn chứng
dương từ mẫu máu bệnh nhân và nguồn
chứng dương tái tổ hợp về độ đặc hiệu và
nồng độ sản phẩm PCR sau khi thực hiện
phản ứng multiplex PCR. Nồng độ DNA
được đo bằng phương pháp quang phổ kế.
Độ đặc hiệu của phản ứng được kiểm tra
bằng kỹ thuật điện di trên gel Agarose.
4. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu tuân thủ các quy định về đạo
đức trong nghiên cứu y sinh được sự thông
qua của Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y
dược Hải Phịng. Bệnh nhân hồn tồn tự
nguyện tham gia vào nghiên cứu và hồn
tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi
không đồng ý tiếp tục tham gia. Bệnh nhân
được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để
giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa
chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thơng tin
cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Sàng lọc 6 đột biến trên gen alphaglobin bằng kỹ thuật Multiplex-PCR
Từ 200 mẫu DNA thu được trên 200 bệnh
nhân được chẩn đoán mang gen bệnh
thalassemia tại bệnh viện Trường Đại học
học Y dược Hải Phòng và bệnh viện Phụ sản

Hải Phịng, chúng tơi thực hiện phản ứng
multiplex PCR. Kết quả có 86 bệnh nhân
mang gen α-thalassemia gồm 6 loại đột biến.
Trong số các đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ
lệ cao nhất: 73%, kế tiếp là các đột biến 3.7,
THAI, HbCs, c2delT và 4.2 với tỉ lệ tương
ứng lần lượt là: 19.3%, 3,3%, 2,2%, 1.1% và
1.1%.
2. Kết quả tổng hợp đoạn gen chứa đột
biến gây bệnh bằng kỹ thuật PCR


TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022

Bằng phản ứng PCR sử dụng 6 cặp mồi
đặc hiệu tương ứng cho đột biến SEA, THAI,
3.7, 4.2, HbCs và c2delT để khuếch đại DNA

của bệnh nhân mang đột biến. Kết quả PCR
khuếch đại một số loại đột biến alphathalassemia được minh họa ở Hình 1.

Hình 1. Hình ảnh minh họa kết quả PCR khuếch đại các đột biến trên gel Alpha-globin
M 1kb: marker 1 kilobase, Pos: dương
tính, NC: âm tính, 3.7: đột biến mất đoạn 3.7
kilobase, 4.2: đột biến mất đoạn 4.2 kilobase,
SEA: đột biến SEA, Cs: đột biến HbCs, C2:
đột biến C2DelT.
Kết quả diện di trên gel agarose 1.5% cho
thấy sản phẩm PCR thu được (tương ứng với
mỗi loại đột biến) là một băng sáng duy nhất,

rõ nét, kích thước đúng với kích thước giữa 2
mồi khuếch đại; mẫu chứng âm khơng có
vạch chứng tỏ phản ứng khơng bị nhiễm
DNA ngoại lai.

3. Kết quả tạo dòng các plasmid tái tổ
hợp mang các đột biến
Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu
tương ứng của 6 loại đột biến trên gen alpha
globin được gắn vào vector tách dòng pCR
2.1/TA cloning (Invitrogen) và biến nạp vào
tế bào E. coli–DH5α. Tế bào E. coli–DH5α
sau biến nạp phát triển trên môi trường LB
lỏng. Dịch nuôi cấy được cấy trải trên môi
LB agar (100 μl/đĩa) có bổ sung Amp; Xgal
và IPTG (Hình 2)

Hình 2. Kết quả cấy chọn lọc trên môi trường LB Amp=Xgal = IPTG
15


Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHỊNG

Khuẩn lạc xanh: các tế bào khơng nhận
được gen đột biến;
Khuẩn lạc trắng: những tế bào có khả
năng nhận được gen đột biến
Lựa chọn các khuẩn lạc màu trắng và một
khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa môi trường
tương ứng với mỗi loại đột biến để tiến hành

tách DNA plasmid và sử dụng enzyme cắt
giới hạn để chọn lọc các plasmid mang đột

biến gen mong muốn. Sản phẩm sau đó được
điện di trên gel agarose 1.5% (Hình 3).
Quan sát ảnh điện di chúng ta thấy rằng,
DNA plasmid sau khi cắt tại đường chạy: T2,
T3, S3, S5, CS1, CS2, DEL1, 42.2. 37.1 xuất
hiện 1 băng rõ rệt có kích thước tương ứng
với kích thước của đoạn gen đích được gắn
vào vecto.

Hình 3. Kết quả cắt chọn lọc DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
Đường chạy M: thang ADN chuẩn; X:
plasmid dòng khuẩn lạc xanh; T2-T3: các
dòng tế bào mang plasmid pA/THAI; S3-S5:
các dòng tế bào mang plasmid pA/SEA;
CS1-CS2: các dòng tế bào mang plasmid
HbCs; DEL1-DEL2: các dòng tế bào mang
plasmid C2DELT; 42.2: dòng tế bào mang
plasmid pA/4.2; 3.7: dòng tế bào mang
plasmid 3.7.
3. Giải trình tự các dịng tế bào mang
đột biến.
Lựa chọn Các dòng plasmid tái tổ hợp
tương ứng với 6 loại đột biến t để tách chiết

16

DNA. Nồng độ ADN plasmid được đo bằng

quang phổ kế. Nồng độ ADN plasmid sau
tách chiết của tất cả các dòng đều từ 119,2
ng/ μl trở lên. Kết quả tỷ số A260/280 của
100% mẫu đều thỏa mãn trong khoảng giá trị
1,8-2. ADN sau tách chiết có độ tinh khiết
cao và đảm bảo chất lượng để tiến hành kỹ
thuật giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự
bằng máy ABI 3500 cho thấy tín hiệu giải
trình tự gen đặc hiệu, rõ nét, khơng xuất hiện
tín hiệu nhiễu. Từ các trình tự gen thu nhận
được, tiến hành phân tích bằng phần mềm
BioEdit. (Hình 4)


TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022

Hình 4. Đại diện kết quả phân tích trình tự gen đột biến Thai
trên phần mềm Bio Edit
5. Kết quả kiểm tra tính bảo tồn của
gen đột biến
Chọn ngẫu nhiên một dòng tế bào tái tổ
hợp cho mỗi loại đột biến để tiến hành hoạt
hóa trong mơi trường nghèo dinh dưỡng. Sau
đó thực hiện cấy chuyển các dịng tế bào
trong mơi trường LB lỏng đến lần thứ 10.
Sau mỗi lần cấy chuyển sẽ tiến hành đo mật
độ phát triển tế bào tại bước sóng 600 nm để
đánh giá khả năng phát triển của tế bào sau
mỗi lần nuôi cấy. Kết quả sau mỗi lần cấy
chuyển, mật độ tế bào đạt OD600 trong

khoảng 5.9-6.3 sau thời gian 2,5h-3h. Và sau
mỗi lần cấy chuyển, tế bào được thu lại để
tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Các tế
bào sau 10 lần nuôi cấy đều chứa những đột
biến tương ứng đưa vào ban đầu.
6. Kết quả ngoại kiểm các chứng dương
tái tổ hợp
Các dịng tế bào tái tổ hợp sau đó được
chuyển đến Viện Huyết học và Truyền máu
Trung Ương để đánh giá. Kết quả ngoại kiểm
được thể hiện tại Bảng 1.

17


Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

Bảng 1. Kết quả ngoại kiểm các chứng dương tái tổ hợp bằng kỹ thuật Multiplex-PCR
Nồng độ DNA (ng/L)
Độ đặc hiệu của
Trước phản ứng
Sau phản ứng
phản ứng
(ng/l)
(ng/l)
STT
Mã số
Tế bào
Tế bào

Mẫu
Mẫu
Tế bào
Mẫu
tái tổ
tái tổ
máu BN
máu BN tái tổ hợp máu BN
hợp
hợp
1
SEA-R
60
1,8
812
1250
++++
+++++
2
THAI-R
75
1,8
822
1211
+++
+++++
3
3.7-R
102
1,8

709
1210
++
+++++
4
4.2-R
123
1,8
789
1234
++
+++++
5
HbCs-R
97
1,8
806
1300
++
+++++
6
C2DELT-R
64l
1,8
864
1321
+
+++++
(“+”, “++”, “+++”, “++++”: mức độ đặc hiệu của phản ứng multiplex-PCR)
Có sự đồng nhất về kết quả xác định đột biến giữa DNA tách chiết từ mẫu máu của bệnh

nhân và DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp cho kết quả ổn định và đặc hiệu hơn.
IV. BÀN LUẬN
Nghiên cứu phát hiện được 86/200 mẫu
dương tính với 6 loại đột biến trên gen alpha
globin được sàng lọc, chiếm 43%. Trong số
các đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ lệ cao
nhất: 73%, các đột biến 3,7, THAI, HbCs,
C2DelT và -4.2 với tỉ lệ tương ứng lần lượt
là: 19,3 %, 3,3%, 2,2%, 1.1% và 1.1%. Kết
quả nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên
cứu của tác giả Đ T Q Mai (2021) trên 85
bệnh nhi Thalassemia điều trị tại bệnh viện
Trẻ em Hải Phòng [3]. Kết quả nghiên cứu
cũng chỉ ra tỷ lệ mang đột biến C.2delT và 4.2 là tương đối thấp trong cộng đồng (1.1%)
chứng tỏ sự cần thiết của việc tạo ra nguồn
thư viện chứng dương. Các quy trình PCR
phát hiện 6 loại đột biến sử dụng cặp mồi đặc
hiệu tương ứng đã được nhóm tác giả tối ưu
trong nghiên cứu trước đây, do đó đảm bảo
độ nhạy và độ đặc hiệu [1].

18

Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung
Amp chỉ những tế bào nhận được plasmid
biến nạp vào mới có thể phát triển do đó giúp
loại bỏ những tế bào không nhận plasmid.
Sàng lọc các dòng tế bào mang plasmid gắn
gen đột biến alpha-thalassemia bằng X-gal
và IPTG dựa trên nguyên lý: những tế bào

nhận vector pCR®2.1 tự đóng vịng sẽ có gen
lac-Z hoạt động thường tạo ra enzyme galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp
chất có màu xanh nên khuẩn lạc có màu
xanh. Những tế bào nhận được plasmid tái tổ
hợp có đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa lac
promoter và gen cấu trúc Lac-Z của operon
Lac nên lac promoter không thể điều khiển
gen cấu trúc phiên mã do đó khơng có sự tạo
thành enzyme β-galactosidase để phân hủy
X-gal tạo ra những khuẩn lạc màu trắng.
IPTG được sử dụng với tư cách là chất cảm
ứng cho operon lac gắn trong vector
pCR®2.1 [6].


TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022

Những dịng tế bào có khả năng mang gen
đột biến, được tiến hành cắt với enzyme cắt
giới hạn cùng một vài khuẩn lạc từ dòng tế
bào màu xanh làm đối chứng. Kết quả điện
di (Hình 3) đã chỉ ra 20 dịng tế bào mang
đột biến SEA, 17 dòng tế bào mang đột biến
HbCs, 15 dòng tế bào mang đột biến THAI,
6 dòng tế bào mang đột biến -4.2 và 5 dòng
tế bào mang đột biến -3.7. Song song với
việc chọn lọc các dòng tế bào mang đột biến
bằng phương pháp sử dụng enzyme cắt giới

hạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR với

các cặp mồi đặc hiệu để sàng lọc các dịng tế
bào mang đột biến. Kết quả cho thấy có sự
tương đồng 100% giữa hai phương pháp.
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng
phần mềm BioEdit, trình tự sau phân tích
được so sánh với trình tự chuẩn tương ứng
trên phần mềm Genebank. Kết quả cho thấy
các trình tự có độ tương đồng cao (99%)
(Bảng 2).

Bảng 2. So sánh trình tự gen của 6 đột biến trên gen Alpha-Globin
Độ tương đồng với gene
STT
Tên đột biến
Mã số trên Genbank
nghiên cứu
1
SEA
KX4581114
99%
2
THAI
AP023476
99%
3
-3.7
NG0000006
99%
4
-4.2

AF221717
99%
5
HbCs
HQ156224
99%
6
C.2delT
SAF271160
99%
Các dòng tế bào tái tổ hợp khi thực hiện
tăng sinh 10 lần liên tục và không xảy ra hiện
tượng đào thải gen nhận đã khẳng định sự
thành công của nghiên cứu. Phương pháp cấy
chuyển để đánh giá tính ổn định của tế bào
tái tổ hợp đã được Bernacki S. H. và cộng sự
khẳng định giá trị trong nghiên cứu công bố
năm 2005 cho thấy cơ sở khoa học của
phương pháp [7]. Để khẳng định thêm tính
ổn định của tế bào tái tổ hợp chứa gen đột
biến, nghiên cứu tiến hành kiểm tra tính bảo
tồn của gen sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ
-800 C. Kết quả cho thấy tất cả các dịng tế
bào khơng xảy ra hiện tượng đào thải gen
nhận.

Các dòng tế bào tái tổ hợp mang 6 loại đột
biến trên gen alpha globin được đánh giá thử
nghiệm tại Labo xét nghiệm Di truyền - Sinh
học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu

Trung ương – đơn vị đầu nghành trong việc
chẩn đoán phát hiện các bệnh về máu tại Việt
Nam. Kết quả cho thấy nguồn chứng dương
được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp ổn
định và đặc hiệu hơn khi so sánh với đối
chứng dương là mẫu máu người mang gen
bệnh. Khi thực hiện phản ứng multiplex
PCR, nồng độ DNA khn từ dịng tế bào tái
tổ hợp đều rất thấp (1,8 ng/L) so với nồng
độ DNA khuôn tách chiết từ mẫu máu toàn
phần của người mang gen bệnh (SEA- 60
19


Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

ng/l). Đặc biệt hơn là việc sử dụng các
chứng dương tạo ra theo kỹ thuật tái tổ hợp
đã loại bỏ được những sản phẩm không đặc
hiệu thường xuất hiện từ các chứng dương là
mẫu máu của người mang đột biến.
V. KẾT LUẬN
Chúng tôi đã thành công trong việc tạo
thư viện chứng dương của 06 loại đột biến
trên gen alpha globin: SEA, THAI, -3.7, -4.2,
HbCs và C.2delT. Đây là nguồn chứng
dương ổn định, cần thiết để thay thế cho
nguồn chứng dương từ các mẫu bệnh phẩm
trong các phịng thí nghiệm chẩn đoán phân
tử. Sản phẩm này cũng đưa ra một giải pháp

thay thế nhanh chóng, chi phí thấp, cho các
đột biến di truyển khác mà chưa được tạo bởi
các dòng tế bào bất tử.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Quỳnh B.T.N., Thu L.H., Hường V.T.B. và
cộng sự. Áp dụng kỹ thuật PCR phát hiện đột
biến gen trên bệnh nhân nghi ngờ alphaThalassemia tại Hải phòng. Y học Việt Nam,

20

2017, 461(2), 7-10.
2. Quỳnh B.T.N., Bằng N.H., Thu H.T. và
cộng sự. (2022). Tạo thư viện chứng dương
cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán
bệnh Beta Thalassemia. TCNCYH, 151(3), 9–
17.
3. Mai Đ.T.Q, Sáng N.N, Quỳnh B.T.N. Xác
định đột biến gen gây bệnh Thalassemia ở trẻ
em tại bệnh viện Trẻ em Hải Phòng. Y học
Việt Nam, 2021, 509(1), 361-365.
4. Raja Z.A.M, Ainoon O., Hafiza al et al.
(2014), Molecular characteristic of alpha
thalassaemia among patients diagnosed in
UKM Medical Centre, Malaysian J Pathol;
36(1):27 – 32.
5. Galanello R. và Cao A. (2011). Alphathalassemia. Genet Med, 13(2), 83–88.
6. Sambrook, J., Fritsch, E. R., & Maniatis, T.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2nd ed.). Cold Spring Harbor.1989., NY:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.

7. Bernacki S. H. et al,. Genetically
characterized positive control cell lines
derived from residual clinical blood sample,
Clinical Chemistry. 2005 , 51:11: pp. 20132024.