TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HUỲNH QUANG VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

LỜI MỞ ĐẦU
Trong thời đại ngày nay, hóa học phân tích đóng vai trò rất quan
trọng đối với sự phát triển của các ngành công nghệ kỹ thuật. Bất cứ một
ngành khoa học kỹ thuật cơng nghệ nào cũng cần đến hóa học phân tích.
Tuy nhiên để phân tích một đối tượng ta có thể dùng nhiều phương pháp
khác nhau để đạt được độ chính xác cao. Một trong những phương pháp
phân tích được sử dụng khá rộng rãi để xác định vết tạp chất khác nhau
trong hợp chất vô cơ và hữu cơ hiện nay là phương pháp quang phổ huỳnh
quang. Đây là phương pháp đã được biết đến từ rất lâu nhưng việc xây
dựng lý thuyết cũng như ứng dụng vào thực tế chỉ mới được thực hiện gần
đây.
Chính vì thế, dưới sự hướng dẫn của thầy Lê Nhất Tâm cùng với
những kiến thức đã học trên ghế nhà trường, chúng em quyết định tìm hiểu
sâu hơn về phương pháp quang phổ huỳnh quang và ứng dụng trong thực
phẩm. Trong q trình tìm hiểu khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, vì vậy
nhóm chúng em mong nhận được ý kiến quý báo từ thầy và các bạn.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 1


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG
Một chất khi hấp thụ một năng lượng nào đó thì hệ electron trong
phân tử bị kích thích, ta nói phân tử ở trạng thái kích thích. Trạng thái kích
thích là trạng thái khơng bền, nó chỉ tồn tại trong khoảng 10-8 giây; có xu
hướng trở về trạng thái ban đầu; khi trở về trạng thái ban đầu nó lại phải tỏa
ra phần năng lượng đã hấp thụ. Năng lượng giải tỏa đó dưới dạng ánh
sáng nên được gọi là hiện tượng huỳnh quang.
Hiện tượng huỳnh quang đã biết từ lâu. Song việc xây dựng lý thuyết
của hiện tượng và ứng dụng nó vào thực tiễn thì mới chỉ bắt đầu từ khi phát
hiện ra tính chất lượng tử của ánh sáng.
Sự phát quang xảy ra trong dung dịch và trong các chất khí là sự
phát quang do những trung tâm rời rạc, nhưng sự phát quang xảy ra ở các
chất rắn (tinh thể) là sự phát quang do toàn bộ chất tham gia vào sự biến
đổi năng lượng hấp thụ được thành ánh sáng.
Phương pháp huỳnh quang có những nét đặc trưng quan trọng sau:
Một phần năng lượng hấp thụ (gọi là năng lượng kích thích) tất yếu phải
chuyển thành dạng nhiệt, do đó phần năng lượng còn lại giải tỏa ra dưới
dạng ánh sáng (Epq) phải nhỏ hơn năng lượng hấp thụ (Eht). Như vậy trong
phát quang thường có hệ thức:
Eht > Epq
Hνht > hνpq
c

h λ
ht

> h c

λpq

với c là tốc độ ánh sáng.

Suy ra λht < λpq
Vậy phổ phát quang bao giờ cũng chuyển dịch về phía bước sóng dài
hơn so với phổ hấp thụ của chất đó.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 2


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Để đo cường độ của dòng ánh sáng huỳnh quang (I pq) ta chỉ đo ở
phương tạo với tia tới (tia kích thích) một góc 45 o hay 90o hoặc 135o … Để
tránh ảnh hưởng của các tia truyền qua.
Cường độ của dòng sáng phát quang bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
sau:
1. Ảnh hưởng của bước sóng ánh sáng kích thích
Bức xạ huỳnh quang chỉ phát ra khi chất hấp thụ một năng lượng (hν)

đủ lớn (thường là các tia sáng trong vùng tử ngoại) để chuyển hệ electron
trong phân tử lên trạng thái kích thích. Nếu dùng ánh sáng kích thích có
năng lượng lớn (λ ngắn) thì cũng chuyển hệ electron của phân tử lên trạng
thái kích thích, năng lượng biến thành bức xạ huỳnh quang sẽ không đổi,
năng lượng còn dư sẽ biến thành nhiệt. Nếu tăng λ của ánh sáng kích thích
lên mà cường độ dịng huỳnh quang không đổi tức là hiệu suất huỳnh
quang (B = Epq / Eht) sẽ tăng lên. Song nếu tăng λht đến giới hạn vừa đủ để
chuyển hệ electron trong phân tử lên trạng thái kích thích mà tăng lên nữa
thì năng lượng của ánh sáng hấp thụ sẽ không đủ để kích thích phân tử
nên sự phát quang sẽ tắt.
Hiện tượng trên đã được Vavilop nghiên cứu và phát biểu thành định
luật sau: Khi tăng bước sóng của ánh sáng kích thích thì hiệu suất huỳnh
quang sẽ tăng lên, nhưng tăng đến một giới hạn nào đó thì nó giảm xuống
rất nhanh và bằng khơng khi bước sóng ánh sáng kích thích tiếp tục tăng.
2. Ảnh hưởng của nồng độ
Cường độ của bức xạ huỳnh quang tỷ lệ với lượng chất huỳnh quang
và cường độ của dịng sáng kích thích.
Ipq = K Io Cb
Trong đó Ipq – cường độ dịng bức xạ huỳnh quang
Io – cường độ dịng sáng kích thích
K – hệ số, phụ thuộc vào bản chất phát quang và độ dài
sóng kích thích
C – nồng độ chất phát quang trong dung dịch (mol/l)
b – bề dày lớp dung dịch
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 3

Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Biểu thức trên cho thấy Ipq tăng tỉ lệ thuận với nồng độ chất phát
quang (C). Song sự tỷ lệ đó chỉ tuân theo trong một giới hạn nồng độ nhỏ
(10-7 – 10-4 mol/l)
Nếu nồng độ C tăng vượt quá giới hạn đó, thì cường độ phát quang
tăng rất ít và dần dần tắt hẳn, sự tắt bức xạ huỳnh quang do sự tăng nồng
độ gọi là sự tắt huỳnh quang nồng độ. Điều đó có thể do khi nồng độ lớn có
sự hình thành các tập hợp phần tử là những trung tâm khơng hấp thụ ánh
sáng kích thích nên khơng phát quang. Cũng có thể do ở nồng độ lớn
khoảng cách giữa các trung tâm phát quang trong dung dịch giảm dẫn tới
các phần tử hấp thụ ánh sáng kích thích và truyền một phần năng lượng
hấp thụ được cho các phần tử khác có trong dung dịch chứ khơng chuyển
lên trạng thái kích thích nên khơng phát quang được.
Như vậy phương pháp phân tích huỳnh quang chỉ dùng để phân tích
những hàm lượng rất nhỏ.
3. Ảnh hưởng của nồng độ ion H+ và dung môi
Dung môi và pH của dung dịch có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng
phát huỳnh quang của các chất huỳnh quang, đặc biệt là các hợp chất nội
phức tạo nên từ các ion kim loại với các phối tử hữu cơ bởi vì thay đổi dung
mơi có thể dẫn tới sự thay đổi độ bền liên kết của phức hoặc tạo thành các
hợp chất phức sonvat. Thay đổi pH dung dịch có thể dẫn tới sự phá hủy
phức hay tạo thành phức có thành phần khác khơng phát quang.
Vì vậy khi phân tích bằng phương pháp huỳnh quang cần phải nghiên
cứu để chọn dung mơi và giá trị pH tối ưu cho q trình xác định.
4. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thông thường khi nhiệt độ tăng thì khả năng phát huỳnh quang của
các chất phát quang giảm.
Khi tăng nhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch giảm dẫn tới làm tăng độ
dao động nội phân tử do đó làm yếu liên kết trong phân tử, có thể làm biến
dạng phân tử hay phân li phân tử. Những biến chuyển đó sẽ làm thay đổi
tính chất huỳnh quang của phân tử. Ngược lại ở nhiệt độ thấp thì dao động
trong phân tử giảm và thực tế khơng có sự chuyển hóa dao động nhiệt, do
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 4


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

đó hiệu suất và cường độ huỳnh quang của chất tăng lên, đặc biệt là các
chất hữu cơ và phức của kim loại với phối tử hữu cơ thì sự phát quang tăng
lên rất nhiều khi giảm nhiệt độ. Có nhiều chất ở nhiệt độ thường thì khơng
phát huỳnh quang, nhưng ở nhiệt độ thấp lại phát huỳnh quang mạnh.
5. Ảnh hưởng của ion lạ
Các chất lạ có mặt trong dung dịch gây ảnh hưởng lớn đến việc phân
tích huỳnh quang. Nhiều chất lạ làm tắt huỳnh quang; chẳng hạn Na 2SO3,
Na2S2O3, KMnO4…, làm tắt huỳnh quang của rezorafin. Song lại có chất lạ
làm tăng khả năng huỳnh quang, chẳng hạn ion SO 42- làm tăng tình huỳnh
quang của quinine…
Các chất lạ có thể gây những ảnh hưởng hóa học hay vật lý khác

nhau đối với chất huỳnh quang.
Do đó khi nghiên cứu hiện tượng huỳnh quang, nhất là nghiên cứu
phân tích định lượng cần phải nghiên cứu chặt chẽ ảnh hưởng của các ion
lạ có trong dung dịch phân tích, đối với ion lạ có tác dụng làm tăng khả
năng phát quang thì cần tìm điều kiện lợi dụng tính chất này của nó để tăng
độ nhạy của phép phân tích. Cịn với các ion lạ có tác dụng làm giảm khả
năng phát huỳnh quang của chất phát quang thì cần tìm cách loại trừ
chúng.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 5


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

CHƯƠNG 2
PHỔ HUỲNH QUANG VÀ SỰ PHÁT QUANG HĨA
HỌC
Nhiều hợp chất vơ cơ và hữu cơ ở trạng thái lỏng hoặc ở trạng thái
rắn, ở dạng phân tử hay dạng ion, dạng nguyên chất hay dung dịch đều
phát ra ánh sáng khi chúng bị kích thích bởi những photon nằm trong vùng
khả kiến hoặc trong vùng tử ngoại gần. Ứng dụng phân tích cho hiện tượng
này là sự phát huỳnh quang. Đây là phương pháp có sự chọn lọc và độ
nhạy cao cho nhiều đại lượng đo. Cường độ huỳnh quang tỉ lệ với nồng độ

của chất cần phân tích. Thiết bị đo huỳnh quang là quang phổ kế hay huỳnh
quang kế. Cường độ ánh sáng suy giảm rất nhanh khi dừng kích thích lên
đối tượng phân tích nhưng ngược lại hiện tượng tượng lân quang thì giảm
từ từ theo thời gian. Huỳnh quang được sử dùng cùng với detector đã được
ứng dụng trong phương pháp sắc ký lỏng.
Mặt dù khác nhau về nguồn gốc, nhưng phát quang hóa học, bao
gồm sự phát xạ của ánh sáng trong các phản ứng hóa học, củng đã có
nhiều ứng dụng trong hóa học phân tích.
2.1 Huỳnh quang và hiện tượng lân quang
Nhiều hợp chất khi đã kích thích bởi một nguồn ánh sáng trong vùng
khả kiến hoặc trong vùng tử ngoại gần sẽ hấp thu năng lượng ngay lập tức
nhưng không phát ra theo hình thức tia bức xạ. Căn cứ vào định luật
Stokes, dãy phát xạ phổ lớn nhất được đặt tại chổ có chiều dài bước sống
dài hơn chiều dài bước sống của ánh sáng kích thích ban đầu. Hình 2.1 và
2.2 là những hợp chất huỳnh quang. Sau kích thích, cường độ ánh sáng
phân rã cực kỳ nhanh theo theo định luật hàm mũ:
It =I0 . exp[-kt]
Trong đó :

(2.1)

It : Cường độ huỳnh quang

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 6


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM

Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

e

Fluorescence

t : Thời gian trơi qua tính từ lúc kích thích

Absorbance

Fluorescence

Wavelength(nm)

235 diễn chiều dài bước
285 sống của phổ thu335
Hình 2.1 Biểu
bức xạ và phổ

huỳnh quang của hợp chất ethylen
Phát xạ này có thể được phân loại thành huỳnh quang có cường độ
giảm rất nhanh và lân quang có sự phân rã bức xạ chậm hơn nhiều. Sự
khác biệt này được đặc trưng bởi hằng số k. Hằng số k của huỳnh quang
lớn hơn nhiều so với hằng số k của lân quang. Thời gian phát huỳnh quang
t0 thì được xác định thơng qua biểu thức:

t0 =1/k

Tại thời điểm t0 , cường độ I1 sẽ tăng lên dựa vào biểu thức (2.1) tăng
36,8% so với cường độ ban đầu I0 . Từ những hợp chất huỳnh quang tương
ứng có thể rất nhỏ phải nhìn trên kính hiển vi đến tổng thể những loại khác
nhau thì có 63,2% đã suy yếu đến trạng thái không phát xạ sau một thời
gian ngắn.
Thời gian sống huỳnh quang t0 chỉ khoảng vài nano giây thôi. Để đo
huỳnh quang dễ dàng người ta dùng dụng cụ đo cường độ có tác dụng
trong việc đo chế độ dừng. Nếu là nguồn kích thích thì nó sẽ duy trì được
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 7


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

độ sáng mặt dù có sự phân biệt giữa ánh sáng do nguồn phát ra và ánh
sáng do huỳnh quang. Hình 2.1 minh họa cho ví dụ, biểu hiện của hấp thu
bức xạ qua gương và phổ huỳnh quang là duy nhất đối với nhiều hợp chất.
2.2 Nguồn gốc của huỳnh quang
Đối tượng để kích thích là ánh sáng, một phân tử (phân tử ,ban đầu
ở trạng thái cơ bản S0 ), thì ngay lập tức nhảy lên trạng thái kích thích điện
tử đầu tiên của nó S1 (hình 2.2).Những điện tử và những phân tử của chất
hòa tan lân cận bị mất cân bằng rất nhanh, tuy nhiên chổ nhân nguyên tử
vẩn đồng nhất để giữ chúng ở trạng thái cơ bản (Điều này tuân theo
nguyên tắc Franck-Condon). Hệ thống khung cấu tạo của dung môi khi mất

cân bằng sẽ nhận được hình thể ổn định hơn liên quan đến trạng thái kích
thích điện tử S1 . Sau đó bằng phương pháp biến đổi bên trong phân tử sẽ
nối lại (10-12s) mà không cần phát ra photon để chuyển từ trạng thái V 0 lên
trạng thái S1 . Nếu trạng thái này thích hợp với trạng thái cơ bản thì khung
dung môi sẽ yếu dần thông qua bậc huỳnh quang (10-11 đến 10-8s) . Ngay
sau đó phân tử trở lại một trong những trạng thái dao động và trạng thái
điện tử cơ bản S0 cùng với sự phát ra photon được gọi là huỳnh quang.

E
S1

( Vibrational
relaxation)
Non-radiative
deactivation

V4
V3
V2
V1
V0

V4
V3
V2
V1
V0

S0

Absorption

Fluorescence

T1

S0

Phosphorescence

Hình
: Biểu
đồ so sánh mức năng lượng của huỳnh quang
và 8
GVHD:
Lê2.2
Nhất
Tâm
Trang
lân
quang
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Những dãy huỳnh quang sau sẽ trở lại trạng thái ban đầu , phân tử
có thể giữ lại một phần năng lượng đã hấp thu được trong trạng thái năng
lượng dao động . Năng lượng dao động thừa này bị tán xạ thông qua sự va
đập hoặc bằng một cách thức khác mà không sinh ra bức xạ như thiết bị
làm giảm dao động. Sự phát xạ của photon có mức năng lượng thấp có thể
sẽ bị kéo dài hoặc trở về huỳnh quang ban đầu trong vùng giữa hồng ngoại.
Lân quang tương ứng với phương pháp làm giảm năng lượng khác.
Sau giai đoạn hấp thu, tương ứng với sự chuyển một điện tử lên mức S 1
(trạng thái đơn) ,một spin điện tử đảo ngược có thể xảy ra nếu sự giảm dao
động này đủ thấp dẫn đến trạng thái T 1. Từ trạng thái này, chúng trở về
trạng thái điện tử cơ bản là chậm hơn khi nó địi hịi một spin đảo ngược
mới cho điện tử này.Thời gian tồn tại của bức xạ này có thể tăng lên
khoảng thời gian vài phút.
Độ nhạy của huỳnh quang thường cao hơn 1000 lần so với phổ hấp
thu của vùng UV/Vis. Tuy nhiên muốn sử dụng đúng những kĩ thuật này đòi
hòi người sử dụng phải có những kiến thức vững chắc về hiện tượng này
để tránh sai số có thể xảy ra.

Biphenyl(0.2)

Fluorene (1)

Naphthalene (0.55)

COOH

NH2

OH
N

OH
Aniline (0.6)

O

O

Fluorescein (0.92 in NaOH 0.1 M
and 0.65 to pH=7)

8-Hydroxyquinoline

Hình 2.3: Những hợp chất thơm chức huỳnh quang tiêu biểu

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 9


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Huỳnh quang được mạnh thêm bởi sự hiện diện của các nhóm dono
điện tử khi chúng đang bị khử bởi nhóm rút điên tử (hình 2.3) nhưng có sự
lệ thuộc vào pH của dung môi. Ngược lại những phân tử không bền sẽ mất

dần năng lượng đã hấp thu của chúng thông qua sự phân rã và sự giảm
dao động.
Tương tự, hiện tượng này có thể được so sánh với những ảnh
hưởng đã gây ra khi một cái búa đập vào một khối cao su chẳng hạn hoặc
ngược lại trên môt thứ gì đó cứng chẳng hạn một cái đe. Với cao su, năng
lượng bị tán xạ thành những khối như nhiệt và âm thanh khơng được phát
ra. Trên đe thì một phần năng lượng cơ học truyền đi ra bên ngoài như
sóng âm thanh và điều này có thể được so sánh với hiện tượng huỳnh
quang của những phân tử bền hoặc không bền.
2.3 Mối quan hệ giữa huỳnh quang và nồng độ
Tại mỗi điểm của dung môi cường độ huỳnh quang là khác nhau vì
một phần bức xạ kích thích được hấp thụ trước khi tương tác với điểm
được xem xét và vì một phần ánh sáng bức xạ phát ra tìm thấy trong bản
thân nó bị tắt trước khi nó có thể ra khỏi tế bào. Tổng thể huỳnh quang
nhận được bởi detector tương ứng tới tổng của huỳnh quang xuất hiện từ
tồn bộ những thể tích nhỏ riêng lẻ cấu thành khoảng trống được giới hạn
bởi khe vào và khe ra (hình 2.4). Đây là sự tính tốn cường độ huỳnh
quang tuyệt đối (sự phát xạ If) cho mẫu khó.
Hiện tượng của bức xạ tắt dần gọi là sự dập tắt bên trong là sự che
khuất một phần của phổ hấp thụ và phổ phát xạ (sự dập tắt màu), và được
làm tăng bởi những dịch chuyển năng lượng từ những trạng thái kích thích
đến phân tử khác thơng qua trao đổi năng lượng hình thành phức chất (sự
dập tắt hóa chất). Đó là lý do tại sao sự có mặt của oxi có thể gây ra sự
phát quang khơng đúng mức.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 10

Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Những dung môi, hiệu suất lượng tử của huỳnh quang

(từ 0 đến

1), nó khơng phụ thuộc vào cường độ được truyền đi bởi nguồn ánh sáng,
nó được xác định bởi tỷ lệ của số lượng phôtôn được phát ra đến số lượng
các phơtơn được hấp thụ, nó tồn tại tương đương với tỷ lệ của số lượng
phôtôn phát ra If trên số lượng phôtôn hấp thụ Ia (biểu thức 2.2).
=

số lượng phôtôn phát ra =
số lượng phôtôn hấp
thụ

(2.2)

Chấp nhận Ia= I0 – It (It đại diện cho cường độ ánh sáng truyền đi), lý
luận sau đây cho phép mối liên quan giữ If tới nồng độ C của hỗn hợp :
đó là

(2.3)

Phụ thuộc vào vị trí nơi mà huỳnh quang được phát ra, một cường độ

biến thiên của ánh sáng tác động trở lại detector. Bởi sự đặc thù điều chỉnh
của khe vào và khe ra, nó có thể hấp thụ lại một lượng ánh sáng của huỳnh
quang (sự so sánh giữa a và c) và sự hấp thụ của ánh sáng tới (sự so sánh
giữa a và b). Trong thực tế, sự có mặt của một màn chắn ánh sáng nghĩa là
chỉ có ánh sáng đến từ vùng trung tâm của tế bào được tập trung.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 11


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Hình 2.5 Cường độ của huỳnh quang và nồng độ. Mơ hình hóa của
biểu thức 2.7 ảnh hưởng lên cường độ huỳnh quang. Một cực đại của
huỳnh quang không thể quan sát được ở xa, với việc tiếp tục tăng nồng độ
cường độ huỳnh quang nhỏ lại. Sau khi nồng độ dung mơi được tăng cực
đại thì cường độ huỳnh quang yếu hơn. Được minh hoạ tương ứng với ba
bản ghi cùng quy mô của biacetyl tetrachloromethane. Đường cong ghi ánh
sáng được tập hợp từ một thể tích nhỏ được đặt ở tại trung tâm của dung
môi như được chỉ thị trên hình 2.4 ( những tham số và l lựa chọn tùy ý).
Khả năng hấp thụ A sẽ bằng với log Io/I, biểu thức 2.3 trở thành

với

(2.4)
Nếu dung mơi là lỗng, giới hạn A gần 0 và giới hạn 10-A thành ra là

gần 1 – 2.3A. Biểu thức (2.4) có thể được đơn giản hóa
như vậy
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

(2.5)
Trang 12


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

với I0 cường độ của sự bức xạ kích thích
C nồng độ mol của hợp chất
ε hệ số mol hấp thụ
l là bề dày tế bào
hiệu suất lượng tử huỳnh quang.
Biểu thức cuối cùng này là cường độ của huỳnh quang phụ thuộc vào
nồng độ C, những điều kiện thí nghiệm (l, I0) của hỗn hợp. Nếu tất cả các
tham số đúng với máy đo, đúng với hợp chất và hằng số khơng đổi K,
phương trình sau đây có thể được sử dụng cho nồng độ (A < 0,01):
(2.6)
Những phép đo xác định hàm lượng flo dùng một vài phương pháp
cổ điển thường dùng cho một hoặc nhiều mẫu (điểm lấy mẫu riêng rẽ hay

đường cong mẫu, hay những phương pháp bức xả), nhưng để thu được
kết quả tốt nhất thì những dung dịch phải pha loãng. Ở trên một giới hạn đã
cho, huỳnh quang khơng cịn cân đối với nồng. Cái này xuất hiện bởi vì
khơng tuyến tính theo định luật Lambert-Beer.
Sự kích thích là yếu hơn và sự liên kết phức chất xuất hiện giữa kích
thích những phân tử và trạng thái nền. Những hướng dẫn này rõ ràng là kết
quả nghịch lý mà huỳnh quang có thể làm giảm bớt mặc dù nồng độ tăng
lên. Đường cong trong hình 2.5 là đồ thị của biểu thức 2.7 theo sau lời giới
thiệu của những giá trị hợp lý của các tham số khác nhau.
(2.7)
2.4 Hiện tượng tán xạ Rayleigh và những băng Raman
Khi chiều dài bước sóng kích thích và phát xạ là gần nhau thì một
hỗn loạn hình thành giữa sự phát huỳnh quang và hai kết quả thu được do
bởi dung môi: hiện tượng tán xạ Rayleigh và quá trình khuếch tán phân tử
Raman.
Những giới hạn khám phá trong sự phát huỳnh quang thường được
điều chỉnh bởi khả năng phân biệt trong phân tích huỳnh quang từ tổng hợp
các giao thoa này.
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 13


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

2.4.1 Hiện tượng tán xạ Rayleigh rải rác
Hiện tượng tán xạ Rayleigh là sự phát xạ lặp lại, bởi dung môi trong
các hợp chất được hoà tan, một phần nhỏ của ánh sáng bị kích thích trong
tất cả các chiều dài bước sóng (hình 2.6). Hiện tượng tán xạ Rayleigh có
cường độ phụ thuộc ở trên tính phân cực của những phân tử hồ tan.
2.4.2 Q trình khuếch tán phân tử Raman
Hiện tượng tán xạ Raman, nó yếu hơn từ 100 tới 1000 lần so với
hiện tượng tán xạ Rayleigh, được sinh ra bởi quá trình chuyển đổi một
phần năng lượng của bức xạ kích thích đến.

Hình 2.6 Những thành phần khác nhau của phổ huỳnh quang. Vị trí
Raman đỉnh phụ thuộc vào chiều dài bước sóng của chùm ánh sáng kích
thích và của dung môi. Độ nhạy được kiểm bởi huỳnh quang kế.
Những phân tử có khả năng hồ tan dưới dạng năng lượng dao
động. Những phân tử có khả năng hồ tan phát ra nhiều lần các phơtơn có
ít năng lượng hơn để kích thích chúng. So sánh tới hiện tượng tán xạ
Rayleigh, băng phát xạ Raman được dịch chuyển về phía những bước
sóng dài hơn.
Mỗi dung mơi có năng lượng khác nhau giữa hấp thụ và phát lại
những phôtôn là không đổi. Bởi vậy, bằng việc điều chỉnh chiều dài bước
sóng kích thích, thế chuyển dịch bằng nano-mét giữa vị trí của Raman và
những băng Reyleigh (Bảng 2.1 và Hình 2.6).
Hiện tượng tán xạ Raman của nước phục vụ kiểm tra độ nhạy cho
huỳnh quang kế. Điều này gồm có đo tín hiệu / hệ số nhiễu của đỉnh Raman
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 14

Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

với một tế bào được hoàn thành với nước, chẳng hạn tại 397 nm nếu cố
định bước sóng kích thích ứng với 350 nm, thì kết quả của dịch chuyển
riêng là 3380 cm-1 của dung mơi này, và so sánh với tín hiệu nền.
Bảng 2.1 Vị trí của băng tán xạ Raman, được tính tốn thơng
thường dùng bốn dung mơi và năm bước sóng kích thích từ một cái đèn
thủy ngân.
Sự kích

Chuyển dịch

254

313

365

405

436

Nước

278

350

416

469

511

3380

Ethanol

274

344

405

459

500

2920

Cyclohexane

274

344

408

458

499

2880

Chloroform

275

346

410

461

502

3020

thích (nm)

(cm-1)

Hiện tượng huỳnh quang khơng phải chỉ được sử dụng cho phân tích
hóa học Nhưng là bằng nhau được ứng dụng trong thực tế như xà phòng
giặt nơi mà chất phát xạ huỳnh quang được thêm nó dính bám vào cấu trúc
sợi vải.các loại của hợp chất hấp thụ bức xạ mặt trời nằm trong phần phổ

khơng nhìn thấy và phát xạ lại ở bước song dài hơn trong miền phổ màu
xanh của hàm phổ, mắt có thể thấy rõ ràng, làm quần áo xuất hiện ‘trắng
hơn’.

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 15


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

CHƯƠNG 3
MÁY MĨC THIẾT BỊ
3.1 Ngun lý
Những phân tử có các trạng thái khác nhau được tham chiếu đến
như những mức năng lượng. Quang phổ huỳnh quang trước hết liên quan
đến trạng thái điện tử và trạng thái dao động. Nói chung, những kiểu được
khảo sát có trạng thái điện tử nền (một trạng thái năng lượng thấp) quan
tâm, và bị kích thích một trạng thái điện tử năng lượng cao hơn. Trong mỗi
trạng thái điện tử này là những trạng thái dao động khác nhau.
Trong quang phổ huỳnh quang, những kiểu bị kích thích đầu tiên, hấp
thụ một phơtơn, từ trạng thái điện tử nền đến một trong những trạng thái
dao động khác nhau trong trạng thái điện tử bị kích thích. Sự va đập những
phân tử với nhau gây ra phân tử bị kích thích để mất năng lượng dao động
đến khi nó đạt đến trạng thái có dao động thấp nhất của trạng thái điện tử bị

kích thích.
Phân tử giảm xuống một trong những mức có dao động khác nhau
của trạng thái điện tử nền lần nữa, phát ra phơtơn trong q trình. Khi đó,
những phân tử có thể giảm xuống bất kỳ mức dao động nào trong trạng thái
nền, các phơton phát xạ sẽ có những năng lượng khác nhau và tần số
tương ứng. Bởi vậy, bằng việc phân tích những tần số khác nhau của ánh
sáng phát ra trong quang phổ huỳnh quang, với những cường độ tương đối
của chúng, cấu trúc các mức dao động khác nhau có thể được xác định.
Trong một thí nghiệm điển hình, những tần số khác nhau của ánh
sáng huỳnh quang phát ra bởi một mẫu được đo, duy trì ánh sáng kích
thích tại một bước sóng khơng đổi. Đây được gọi là một phổ phát xạ. Một
phổ kích thích được đo bằng việc ghi một số hình ảnh phát xạ sử dụng
những bước sóng khác nhau của ánh sáng kích thích.
3.2 Trang thiết bị
Một hợp chất huỳnh quang vận hành như một nguồn phát ra ánh
sáng theo mọi phương hướng. Ánh sáng phát ra này thường được ghi nhận
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 16


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

theo phương thẳng góc với chùm tia đến từ nguồn kích thích sơ cấp. Để
tăng sự hấp thu của dung dịch, huỳnh quang được chiếu từ bề mặt mẫu

dựa trên sự kích thích bức xạ đập vào, trong khi với những mẫu đục hoặc
nửa đục thì cách đo mặt trước được ưu tiên.
Nguồn kích thích thường là một đèn hồ quang xenon với công suất từ
150 đến 800W. Phép đo cường độ ánh sáng được thực hiện bằng việc sử
dụng một ống nhân quang và một diot quang. Dung môi, nhiệt độ, pH và
nồng độ là những thông số chủ yếu ảnh hưởng đến cường độ dòng huỳnh
quang. Với mẫu dung dịch, cuvet sử dụng từ kính hình chữ nhật 1cm hoặc
silic oxit nóng chảy.
Trong số nhiều ứng dụng của kỹ thuật LIDARS (sự phát hiện sóng
sáng và sự đo khoảng cách) chúng được dùng để định lượng khí, ở dạng
vệt trong bầu khí quyển Trái Đất. Những khí được lượng tử hóa bởi huỳnh
quang retro tán xạ của chúng được cảm ứng kích thích tiếp bởi một xung
rất ngắn (micro giây) từ một laser đơn sắc mạnh mẽ. Sự kích thích có thể
được điều chỉnh với một bước sóng đặc biệt thích hợp cho dung dịch đang
nghiên cứu.
Hai loại mở rộng của công cụ thương mại hiện tại được đề xuất bởi
những nhà chế tạo: hệ số huỳnh quang kế và quang phổ kế

Hình 3.1 Sơ đồ huỳnh quang kế với góc 90° dùng nguồn sáng Xenon

GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 17


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP

PP Phân Tích Huỳnh Quang

Source: nguồn
Emission:sự phát xạ
Monochromator:quang kế đơn sắc
Excitation Sample:mẫu kích thích
Monochromator:quang kế đơn sắc
Observation through:quan sát qua
an acute angle or of 90°:một gốc nhọn hay của 90 độ
Detector:máy dị tìm
Hình 3.2 Sơ đồ khối của một quang phổ kế với một đèn hồ quang
xenon. Dưới những điều kiện trạng thái ổn định bằng sự duy trì nguồn kích
thích sơ cấp thì huỳnh quang được đo trái ngược với những nghiên cứu
động lực học huỳnh quang. Dưới phải biểu đồ là một đèn hồ quang xenon.
Áp lực của đèn xenon khoảng 1MPa. Những đèn này được làm từ một lớp
thạch anh, khơng có dây tóc là nguồn của ánh sáng trắng. Cực âm là lò tinh
luyện của hai điện cực
Hai dạng chung của các dụng cụ đo hiện có.


Những bộ lọc huỳnh quang kế sử dụng các bộ lọc để tách ánh

sáng tới và ánh sáng huỳnh quang.


Phổ huỳnh quang kế dùng lưới nhiễu xạ đơn sắc để tách ánh

sáng tới và ánh sáng huỳnh quang.
Cả hai kiểu sơ đồ trên: Ánh sáng từ một nguồn kích thích đi xuyên
qua một lọc hay quang kế đơn sắc và đập vào mẫu. Một tỉ lệ ánh sáng tới

được hấp thu bởi mẫu, và một vài phân tử trong mẫu phát huỳnh quang.
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 18


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

Ánh sáng huỳnh quang được phát ra tất cả các phương hướng. Một vài ánh
sáng huỳnh quang này đi qua bộ lọc thứ hai hay quang kế đơn sắc và tới
bộ cảm biến, nó thường được đặt 90° với chùm ánh sáng tới để giảm thiểu
rủi ro của ánh sáng truyền đi hay phản chiếu ánh sáng tới đến bộ cảm biến.
Nguồn ánh sáng khác nhau có thể được dùng như là nguồn kích
thích, bao gồm tia laser, diot quang, và đèn,đặc biệt là đèn hồ quang xeton
và đèn hơi thủy ngân. Tia laser chỉ phát ra ánh sáng với bức xạ mạnh ở một
khoảng bước sóng hẹp, điển hình dưới 0,01 nm, mà khơng cần thiết kích
thích các đơn sắc và máy lọc ánh sáng. Nhược điểm của phương pháp này
là các bước song của tia laser không đổi nhiều. Đèn hơi thủy ngân là một
đèn dây, nghĩa là nó phát ra ánh sáng gần đỉnh của bước sóng. Ngược lại,
đèn hồ quang xeton là một phổ phát xạ liên tục với cường độ không đổi
khoảng 300-800 nm và bức xạ cho phép đo trên dưới 200 nm. Máy đơn sắc
truyền ánh sáng nhằm điều chỉnh bước sóng với độ sai lệch cho phép. Hầu
hết các máy đơn sắc thông thường dùng làm cách tử nhiễu xạ, nguồn ánh
sáng chuẩn trực rọi sáng cách tử và tồn tại với một góc bước sóng. Máy
đơn sắc có thể điều chỉnh chọn lọc các ánh sáng phát đi, cần thiết cho tính

khơng đẳng hướng để đo sự phân cực của máy lọc ánh sáng. Sau đó kích
thích các đơn sắc và lọc ánh sáng, và trước sự phát ra của các máy đơn
sắc và máy lọc ánh sáng.
Như đề cặp ở phần trước, sự phát huỳnh quang thường được đo ở
góc 900 có liên quan đến sự kích thích ánh sáng. Hình này được dùng thây
cho sự đặt bộ cảm biến đễ kích thích ánh sáng ở góc 180 0 nhằm tránh sự
giao thoa của sự phát đi ánh sáng kích thích. Khơng có đơn sắc nào hồn
hảo và nó sẽ phát đi phân tán, các bước sóng ánh sáng đó đúng đích. Đơn
sắc lý tưởng chỉ phát đi ánh sáng trong dãy thiết lập và có bước sóng cao
khơng phụ thuộc vào sự phát đi khi đo ở góc 90 0, ví dụ như đèn phân tán.
Kết quả này tỉ lệ với tính hiệu nhiễu, vả lại sự phát huỳnh quang có thể đo
được từ mặt trước,đục và chắn sáng
Detector có thể là kênh đơn hay nhiều kênh. Detector đơn kênh có
thể dị cường độ một bước sóng ở một thời gian,cịn detector nhiều kênh
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 19


Trường Đại Học Công Nghiệp TP. HCM
Viện CN Sinh Học – Thực Phẩm

Tiểu luận PTTP
PP Phân Tích Huỳnh Quang

dị cường độ tất cả các bước sóng tương thích, khơng cần thiết phát ra đơn
sắc và lọc ánh sáng. Kiểu khác của dectector này có những ưu điểm và
nhược điểm.
Hầu hết dụng cụ huỳnh quang kế đa năng với đơn sắc đối ngẫu và

nguồn ánh sáng kích thích có thể ghi tín hiệu kích thích quang phổ và sự
phát huỳnh quang phổ. Khi đo quang phổ huỳnh quang, đơn sắc của ánh
sáng kích thích được giữ khơng đổi, tốt nhất là bước sóng có độ hấp thụ
cao, và phát ra đơn sắc phổ. Để đo phổ kích thích, bước sóng được phát ra
máy lọc ánh sáng và máy đơn sắc thì khơng đổi và sự kích thích các đơn
sắc thì qt những chùm tia điện tử. nói chung các phổ kích thích thì có độ
hấp thụ phổ như nhau như cường độ tỷ lệ với độ hấp thu.
3.3 Hệ số huỳnh quang của huỳnh quang kế
Ánh sáng được phát ra bởi nguồn sơ cấp ban đầu đi qua quang kế
đơn sắc kích thích, cho phép một băng hẹp của những bước sóng đươc
chọn (15nm), tạo ra lợi ích của huỳnh quang phân tử trong mẫu dung dịch.
Một phần của huỳnh quang phát ra bởi hỗn hợp được tập hợp theo môt
phương vng góc hoặc song song (phụ thuộc vào mơ hình) với hướng
đến của chùm tia. Trước khi ánh sáng đi đến bộ cảm biến nó đi qua máy
phát xạ đơn sắc cho phép chọn một băng hẹp của bước sóng. Những máy
đo cơ bản chứa bộ phận điều chỉnh cho dung dịch chuẩn, mẫu thử và hợp
chất được dùng như chuẩn huỳnh quang. Bằng sự xen kẽ trong cùng quá
trình quang học (mẫu chùm đơn) dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và mẫu
chuẩn huỳnh quang (quinine sulfate, rhodamine B hoặc 2-aminopyridine),
hệ số huỳnh quang có thể được đo cho phép tìm được kết quả dự tính so
với đồ thị điều chỉnh. Trong phương pháp này có thể biến thiên từ nguồn và
một số lớn tham số điều chỉnh của dụng cụ bị xóa bỏ.
Việc dùng một đèn hồ quang xenon như nguồn kích hoạt việc nghiên
cứu huỳnh quang sau khi nguồn đã được tắt. Phương pháp này được sử
dụng trong miễn dịch học, trong đó những phức lantan huỳnh quang được
tìm thấy có thời gian sống huỳnh quang khoảng 1ms, đủ cho những phép
đo rất chính xác (ở khoảng nồng độ 10-12 mol).
GVHD: Lê Nhất Tâm
SVTH: Nhóm 18 – ĐHTP5LT

Trang 20