Tóm tắt luận án: Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Nguyễn Thị Minh Diệp

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH
THUỘC NHÓM FLUROQUINOLON TRONG MẪU
HUYẾT TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU

Ngành: Hóa học
Mã số: 9440112

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC

Hà Nội - 2022


Cơng trình được hồn thành tại
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường
2. GS.TS. Trần Tứ Hiếu

Phản biện 1:………………………………………
Phản biện 2: ………………………………………..
Phản biện 3: ………………………………………..

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án
tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Trường Đại học Bách
khoa Hà Nội.

vào hồi.......giờ.......phút, ngày.......tháng.......năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội.
- Thư viện Quốc gia Việt Nam.


A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Fluoroquinolon (FQL) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp có
hiệu lực kháng khuẩn mạnh, phổ rộng, chống lại nhiều vi sinh vật gây
bệnh nguy hiểm. Chúng có tác dụng tốt với nhiều bệnh nhiễm khuẩn
như: nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hơ hấp, tình dục, da
và mơ mềm. Các kháng sinh này được sử dụng phổ biến nhất trong
điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng
da, xương, nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn và các bệnh do các
chủng vi sinh vật đã kháng penicillin và macrolid, dự phòng trong
bệnh bạch cầu trung tính. Tác dụng kháng khuẩn của nhóm kháng sinh
này do ức chế ADN gyrase, ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn.
Ngồi ra, chúng cịn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp
protein vi khuẩn. Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic, nhóm kháng
sinh này được cho là cơ nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai cho
người và động vật mang thai khi sử dụng.
Các FQL được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiễm trùng
đường tiết niệu tại Hòa Kỳ và Châu Âu là ciproflxacin, levofloxacin,
moxifloxacin và norfloxacin. Mức liều sử dụng được quy định đối với
từng kháng sinh trên, giúp phân bố thuốc đạt nồng độ tại vị trí nhiễm
trùng để thể hiện tác dụng. Tuy nhiên khi sử dụng liều chuẩn, có thể
dẫn tới phơi nhiễm quá mức ở một số cá thể, thể hiện nhiều tác dụng
không mong muốn làm cho bệnh nhân không tuân thủ hoặc ngừng

dùng thuốc. Hoặc, một số bệnh nhân bị thiếu hàm lượng thuốc tại vị trí
tác dụng, dẫn đến thất bại trong điều trị. Các yếu tố ảnh hưởng tới
nồng độ tối ưu tại đích tác dụng như đặc điểm sinh lý bệnh nhân, vi
khuẩn gây bệnh, vị trí nhiễm trùng, dược động học, dược lực học của
thuốc.
Trong phân tích FQL, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) với các kỹ thuật phát hiện khác nhau đã được áp dụng.
Phổ biến nhất là HPLC ghép nối với detector UV hay PDA, huỳnh
quang (FLD) và khối phổ (MS). Để phân tích các FQL trong các chế
phẩm bào chế thường đơn giản, chỉ cần hịa tan dược chất, pha lỗng
nếu cần sau đó phân tích trên hệ thống HPLC. Đối với các mẫu dịch
sinh học như huyết tương, dịch mật, nước tiểu, nước bọt sẽ phức tạp
1


hơn do lẫn nhiều tạp và có nồng độ thấp khó phát hiện. Do đó, cần có
phương pháp thích hợp để chiết xuất chất phân tích ra khỏi mẫu, đồng
thời loại các tạp gây nhiễu.
Phương pháp phân tích đồng thời các FQL được xây dựng với
ưu điểm dùng một phương pháp, trong cùng một điều kiện có thể áp
dụng để định lượng các FQL khác nhau. Tuy nhiên, việc lựa chọn tối
ưu các điều kiện phân tích cho các FQL khác nhau sẽ gặp khó khăn
hơn do tính chất khác nhau của chúng.
Việc theo dõi đánh giá dược động học của các kháng sinh FQL
sẽ là cơng cụ hữu ích để tránh các thất bại trong sử dụng thuốc điều trị
các bệnh nhiễm khuẩn. Do đó, xây dựng các phương pháp phân tích
xác định hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học người bệnh là cần
thiết. Các phương pháp được đề xuất phù hợp với điều kiện kỹ thuật
sẵn có của các cơ sở y tế, sẽ góp phần ứng dụng thành công trong điều
trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh FQL.

Căn cứ trên điều kiện thực tế của các phịng thí nghiệm, kiểm
nghiệm, phịng nghiên cứu tại Việt Nam và vai trị của việc phân tích
hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học, chúng tôi đã đề xuất và
thực hiện đề tài luận án tiến sỹ có tên: “Nghiên cứu phân tích một số
kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và
nước tiểu ”.
3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
Phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh
fluoroquinolon trong dịch sinh học bằng hai phương pháp khác nhau
đó là phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp
sắc ký hỏng hiệu năng cao (HPLC), cụ thể như sau:
1. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong
mẫu huyết tương bằng phương pháp HPLC –PDA
2. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong
huyết tương bằng phương pháp FLS.
3. Xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời bốn
fluoroquinolon (norfloxacin, ciprocaxin, levofloxacin, moxifloxaxin)
trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD.
4. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2


Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm
fluoroquinolon thế hệ 2, 3 và 4 gồm norfloxacin, ciprofloxacin,
levofloxacin và moxifloxacin trong nền mẫu huyết tương và nước
tiểu. Các loại kháng sinh này, trong đó mới nhất là moxifloxacin (thế
hệ 4), đang được sử dụng phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn nặng đến rất nặng.
Phạm vi nghiên cứu: khảo sát xây dựng và đánh giá các quy trình
phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương

và phân tích đồng thời 4 kháng sinh (norfloxacin, ciprofloxacin,
levofloxacin và moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và nước
tiểu; áp dụng thử nghiệm các quy trình phân tích đã xây dựng với
đơn kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương.
5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
 Về giá trị khoa học
- Moxiflocaxin là kháng sinh fluoroquinolon thế hệ mới chưa
có phương pháp phân tích trong Dược điển Việt Nam. Moxifloxacin
hiện nay được sử dụng rộng rãi trong điều trị do đặc tính ít độc hơn so
với các FQL khác. Phương pháp xác định moxifloxacin trong dược
phẩm và dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) cũng đã có khơng ít
cơng trình đã cơng bố. Tuy nhiên tại Việt Nam hiện nay chưa có cơng
trình nghiên cứu nào về việc định lượng moxiflocaxin trong huyết
tương, đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng kháng sinh này
bằng hai phương pháp đó là phương pháp HPLC- PDA và phương
pháp FLS. Phương pháp để xác định đối tượng nghiên cứu này chưa
được công bố trong bất kỳ đề tài nào. Đối với phương pháp quang phổ
huỳnh quang việc sử dụng chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl
benzen sulfonat (SDBS) làm tăng cường độ huỳnh quang, tăng độ
nhạy và giới hạn phát hiện cũng là một điểm mới trong việc nghiên
cứu phân tích xác định moxiflocaxin trong huyết tương cho tới thời
điểm này tại Việt Nam.
- Khả năng phát huỳnh quang là đặc trưng điển hình cho cấu
trúc của kháng sinh họ FQL và đó cũng là cơ sở để định lượng FQL
trong dược phẩm và dịch sinh học. Ngoài việc phát triển phương pháp
quang phổ huỳnh quang để định lượng moxifloxacin trong huyết
tương, trong luận án này chúng tơi cịn phát triển thành công phương
3

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector huỳnh quang hai
kênh. Ưu điểm của HPLC-FLD cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Phương pháp HPLC-FLD hai kênh đã được khảo sát và lựa chọn hai
cặp bước sóng kích thích/phát xạ phù hợp với hai nhóm chất sao cho
đạt được tín hiệu chất phân tích là lớn nhất, tăng độ đặc hiệu và giới
hạn phát hiện của phương pháp.
 Ý nghĩa thực tiễn:
- Đề tài đã nghiên cứu xây dựng thành cơng hai quy trình định
lượng đơn kháng sinh moxifloxacin bằng HPLC-PDA và FLS trong
nền mẫu huyết tương. Việc áp dụng thử nghiệm các quy trình phân
tích này trên một số mẫu thử huyết tương cho kết quả tốt. Bên cạnh đó,
đề tài đã xây dựng thành cơng quy trình định lượng đồng thời 4 FQL
(norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), đại diện cho
3 thế hệ FQL 2, 3 và 4, trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các
FQL này đang được sử dụng rất phổ biến trong phác đồ điều trị của
các y bác sỹ cho các bệnh nhiễm khuẩn nặng. Các quy trình này có thể
áp dụng trong trường hợp nhiều bệnh nhân đang sử dụng các kháng
sinh khác nhau trong 4 kháng sinh trên, chỉ cần một quy trình xử lý
mẫu, cùng một điều kiện sắc ký có thể định lượng đồng thời giúp rút
ngắn thời gian mà vẫn cho kết quả chính xác. Từ đó gợi ý cho việc
nghiên cứu ứng phương pháp phân tích này trong hỗ trợ giám sát nồng
độ thuốc, điều chỉnh phác đồ trong điều trị hoặc nghiên cứu dược động
học của thuốc kháng sinh.
- Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án tương đối đơn
giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện thực tiễn trong các phòng thí
nghiệm ở Việt Nam, máy móc thiết bị, dung mơi, hóa chất tương đối
phổ biến.
6. CẤU TRÚC LUẬN ÁN
Luận án gồm : phần mở đầu (3 trang), tổng quan (39 trang) , thực
nghiệm (19 trang), kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang)

danh mục các cơng trình đã công bố của luận án (1 trang), tài liệu
tham khảo (7 trang), phụ lục (42 trang).
B. NỘI DUNG LUẬN ÁN
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
Chƣơng này đề cập đến các nội dung sau:
4


Tổng quan về kháng sinh fluoroquinolon là đối tượng nghiên cứu
của đề tài, gồm nguồn gốc, cơ chế tác dụng, dược động học và tính
chất quang.
Tổng quan về phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích
HPLC và phương pháp quang phổ huỳnh quang.
Xử lý mẫu dịch sinh học trong phân tích bằng HPLC và các vấn
đề gặp phải khi phân tích mẫu chứa fluoroquinolon.
Một số cơng trình nghiên cứu đã được cơng bố trong và ngồi nước
liên quan đến đối tượng và phương pháp nghiên cứu của luận án.
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Kháng sinh fluoroquinolon
Đối tượng nghiên cứu gồm bốn kháng sinh nhóm fluoroquinolon:
norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin.
2.1.2. Đối tƣợng phân tích
Mẫu huyết tương, nước tiểu: Là các mẫu lưu được thu thập tại
bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội và bệnh viện Quân Y 108 Hà Nội.
Mẫu trắng không chứa FQL được thu thập từ người khỏe mạnh,
không bị bệnh suy thận, không sử dụng thuốc kháng sinh trong thời
gian lấy mẫu.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.2.1. Hóa chất, thuốc thử

Các hóa chất được dùng trong nghiên cứu đạt mức độ yêu cầu,
cung cấp bởi các hãng Merk, Fisher, Sigma.
2.2.2. Chất chuẩn
Norfloxacin (99,54%), ciprofloxacin (98,3%), levofloxacin
(98,2%), moxifloxacin hydrochlorid (97,0%) cung cấp bởi Viện
Kiểm Nghiệm thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc MOXI 500 µg/ml.
Hỗn hợp dung dịch FQL chuẩn 1000 µg/ml.
Các dung dịch này được pha lỗng bằng MeOH thành các dung
dịch chuẩn trung gian có nồng độ 100, 10, 1,0 µg/ml thích hợp trước
khi sử dụng.
5


2.2.3. Thiết bị
Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu
SPD-M10vp (Shimadzu, Nhật Bản ). Cột sắc ký MRC-ODS C18 250×
4,6 mm, 5 μm. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)- Auto
sample Sil-20AC XR, detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO10AS.VP, CBM-20A (Shimazu – Nhật Bản). Cột C18 YMC-pack
ODS-A (150ì4,6mm, 5àm), SUPELCO (250ì4,6mm, 5àm). Mỏy o
quang ph Nanolog (Horiba, Hoa Kỳ) được trang bị đèn hồ quang Xe
450 W và bộ đơn sắc kích thích/phát xạ kép. Máy quang phổ huỳnh
quang Brolight 6102. Máy li tâm Mrc Scientific Instrument (Israel);
Máy đo pH hãng HANNA Instruments (Romani); Cân phân tích
Shimadzu AUW220D – 0,00001g (Nhật Bản); Cân phân tích Precia
XB 220 A, độ chính xác 0,0001g; Máy lắc Vortex ZX-Classic (Velp –
Italy); Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC (Mỹ);
Máy trộn Vortex Mixer của hãng Labnet (Mỹ); Máy đo quang UV-Vis
Agilent 8453 (Mỹ); Thiết bị cô quay chân không (B.U.CHI –Thụy Sỹ);

Tủ sấy chân không (Alab Tech – Hàn Quốc).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thu thập, xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu
Mẫu huyết tương là phần chất lỏng của máu toàn phần sau khi
tiến hành làm đông tụ bằng EDTA. Cục máu đông được loại bỏ bằng
cách ly tâm, thu lấy dịch nổi phía trên bằng micropipet, chuyển vào
một ống polypropylen sạch. Các mẫu được duy trì ở 2-8°C trong khi
xử lý. Nếu mẫu huyết tương khơng được phân tích ngay lập tức, phải
được bảo quản bằng cách cấp đông ở -20°C. Trước khi xử lý thử
nghiệm, các mẫu này được rã đông đến nhiệt độ phòng.
Mẫu thử: Mẫu huyết tương của bệnh nhân sau 1, 2 và 3 giờ sử
dụng thuốc có chứa kháng sinh MOXI.
Mẫu trắng: Mẫu thu thập từ người khỏe mạnh, không sử dụng
thuốc chứa kháng sinh FQL trong thời gian lấy mẫu.
Mẫu thử tự tạo: Lấy một thể tích dung dịch gốc FQL đã biết nồng
độ, làm bay hơi dung mơi thu cặn (nhiệt độ 40oC, khí N2). Hịa tan
cặn trong một thể tích chính xác mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu),
lắc xoáy trong 2 phút để thu được mẫu thử tự tạo có nồng độ FQL
biết trước.
6


2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích
2.3.2.1. Xây dựng quy trình phân tích MOXI trong huyết tương
bằng phương pháp HPLC-PDA
- Khảo sát bước sóng hấp thụ, sau đó tiến hành khảo sát các điều
kiện sắc ký: thành phần và tỷ lệ pha động, pH đệm.
- Khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương bằng tác nhân kết
tủa là dung dịch TCA (trichloroacetic acid): nồng độ, thể tích dung
dịch TCA, tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm.

- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: độ đặc hiệu, LOD, LOQ,
khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ đúng, độ chính xác.
2.3.2.2. Xây dựng quy trình phân tích MOXI trong huyết tương
bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang
- Khảo sát các điều kiện phân tích: sự tạo phức của MOXI với
3+
Eu , thời gian ổn định phức, pH, lượng Eu(III), lượng chất hoạt
đồng bề mặt SBDS tới cường độ phát xạ huỳnh quang, xây dựng
đường chuẩn.
- Quy trình xử lý huyết tương: Lấy 1,0 ml mẫu huyết tương, kết
tủa protein bằng cách thêm 5 ml methanol, lắc xốy 2500 vịng/phút
trong vịng 10 phút, ly tâm trong 15 phút ở 8000 vòng/phút. Lấy 4 ml
dịch nổi, bốc hơi dung mơi, hịa tan cắn thu được trong 1 ml nước cất
2 lần. Lọc mẫu qua màng 0,45µm.
- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: Độ đặc hiệu, khoảng
tuyến tính, đường chuẩn, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ đúng, độ chính
xác.
2.3.2.3. Xây dựng quy trình tách và định lượng đồng thời bốn
FQL trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLCFLD
- Khảo sát điều kiện sắc ký: xác định cặp bước sóng kích thíchphát xạ, dung mơi pha động, pH của pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ
lò cột.
- Xử lý mẫu phân tích:
+ Đối với mẫu huyết tương: khảo sát tác nhân kết tủa protein
bằng MeOH và TCA, tỷ lệ thể tích mẫu/tác nhân kết tủa, thời gian ly
tâm, nồng độ tác nhân, hiệu suất thu hồi.
+ Đối với mẫu nước tiểu:
7


o

Xử lý mẫu bằng chiết lỏng-lỏng: khảo sát dung môi chiết,
thể tích, thời gian lắc, hiệu suất thu hồi.
o Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn: cột chiết, thành phần dung
môi rửa tạp, thành phần dung môi rửa giải, thể tích rửa giải.
- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích: Độ đặc hiệu,
LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ lặp lại, độ đúng.
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích và định lượng được xử lý theo phần mềm
của thiết bị phân tích: phần mềm Analyst của thiết bị LC-UV và LCFLD.
Xử lý số liệu bằng phần mềm Origin® và Microsolf Excel®.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG
MOXICFLOXACIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG
PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA
3.1.1. Điều kiện phân tích
3.1.1.1. Bước sóng hấp thụ
Bước sóng hấp thụ cực đại tại 295 nm, tránh được sự hấp thụ
quang của dung môi hoặc tạp khác nên được lựa chọn.
3.1.1.2. Điều kiện sắc ký
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng gồm thành phần pha động, tỷ lệ
pha động pH của dung dịch đệm phosphat, tốc độ dòng. Điều kiến
sắc ký: cột C18 MRC-ODS (25 cm ì 4,6 mm, 5àm); detector PDA;
bc súng λmax = 295 nm; pha động ACN– đệm phosphat pH 4,0;
nồng độ đệm 20 mM (60:40); rửa giải đẳng dòng tốc độ 0,8 ml/phút;
thời gian lưu (7,40 ± 0,05) phút; thể tích tiêm 10 µl.
3.1.2. Xử lý mẫu huyết tƣơng
Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương trên mẫu thử tự tạo.
Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu dựa trên các điều kiện đã khảo sát.

Quy trình thu được như sau: mẫu huyết tương (1,0 mL), kết tủa
protein bằng cách thêm 1,0 mL dung dịch TCA 20%, sau đó lắc
votex 2000 vịng/phút, trong 15 phút. Tiếp theo thu tồn bộ dịch nổi,
lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm vào hệ thống HPLC.
3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
8


Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích 2 mẫu, mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết
tương tự tạo (thêm chuẩn nồng độ MOXI là 3,0 µg/mL), theo quy
trình đã xây dựng. Kết quả cho thấy mẫu tự tạo nồng độ MOXI 3,0
µg/mL Hình 3.1b xuất hiện pic tại thời gian lưu 7,4 phút, trùng với
thời gian lưu của MOXI chuẩn trên nền pha động Hình 3.9a, đối với
mẫu trắng khơng xuất hiện píc tạp tại thời gian lưu của MOXI trên
sắc ký đồ. Do vậy, phương pháp có độ đặc hiệu cao đối với MOXI..

Hình 3.9. Sắc ký đồ của MOXI (a) mẫu trắng, (b) mẫu huyết tương tự
tạo với nồng độ MOXI 3,0 µg/mL
Đường chuẩn: Khoảng nồng độ thực hiện 0,3-25,0 µg/mL.
Phương trình đường chuẩn được thiết lập: y= 93241x-33414. Trong
đó: x là nồng độ MOXI, y là đáp ứng diện tích pic.
9


LOD và LOQ: Giá trị LOD, LOQ xác định được lần lượt là 0,15
và 0,50 µg/mL.
Độ đúng, độ chính xác: Tiến hành với các mẫu thử tự tạo, nồng
độ FQL: 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL. Mỗi nồng độ được thực hiện 5 lần.
Kết quả thu được hiệu suất thu hồi ở cả 3 nồng độ đạt từ 89,20 % đến

97,32%, RSD% đạt từ 1,18-10,22% đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn
AOAC.
3.1.4. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích một số mẫu thực
Áp dụng quy trình để phân tích MOXI trong mẫu huyết tương của
các bệnh nhân tiêm truyền thuốc Avelox với liều 450mg/250ml sau
1–3h. Các mẫu được thu nhận từ Viện Quân y trung ương 108. Kết
quả thu được: các bệnh nhân Trần Văn A, Nguyễn Văn B và Cao Thị
C sau thời gian tiêm lần lượt là 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ thu được kết quả
hàm lượng MOXI trong huyết tương, tương ứng của từng bệnh nhân
là: 1,52 ±0,05; 2,61 0,2; 2,070,14 àg/mL. Sc ký Hỡnh 3.11.
mAUì1000
PDA Ch1 (295nm)ì1.00

MOXI
min

Hỡnh 3.11. Sắc ký đồ của MOXI trong mẫu huyết tương người
bệnh sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox
So sánh với các nghiên cứu công bố trước đây, nồng độ của
MOXI trong huyết tương xác định được sau thời gian tiêm 1h, lượng
sử dụng 400 mg có giá trị là 4,81 µg/mL. Jian Lu và cộng sự xác
định khoảng nồng độ từ 2,60 – 3,79 µg/mL có thể đạt được trong
khoảng 1 – 3h sau liều uống 400 mg. Kết quả phân tích của phương
10


pháp trong luận án này thu được nồng độ MOXI từ 1,52-2,61 µg/mL.
Giá trị nồng độ MOXI có sự khác biệt nhất định, do có nhiều yếu tố
ảnh hưởng tới nồng độ MOXI trong huyết tương như cân nặng, độ
tuổi, sức khỏe, chức năng gan, chức năng thận. Tuy nhiên, kết quả

thu được này tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đã cơng bố.
Phương pháp phân tích định lượng MOXI trong huyết tương xây
dựng được có thể ứng dụng trong đánh giá điều trị sử dụng thuốc
trên lâm sàng và cũng như trong nghiên cứu về dược động học của
thuốc.
3.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG MOXIFLOXACIN TRONG
HUYẾT TƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ
HUỲNH QUANG
3.2.1. Khảo sát xây dựng phƣơng pháp phân tích
Phương pháp được thiết lập dựa trên phản ứng tạo thành phức
chất giữa MOXI với ion Eu(III) với sự có mặt của chất hoạt động bề
mặt SDBS. Kết quả cường độ tín hiệu phát xạ của phức Eu(III)MOX-SBDS tăng gấp xấp xỉ 3 lần so phức Eu(III)-MOXI (Hình
3.12). Như vậy, sự có mặt của SBDS có vai trị làm tăng độ nhạy khi
xác định MOXI bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang.
2500

1

EuEu

Eu
Eu
MOXI
MOX

2000

0.8

MOXI

MOX

A

SBDS
SDBS

Eu-MOXI
Eu-MOX

1500
I

Eu-MOX
Eu-MOXI

0.6

Eu-MOX-SBDS
Eu-MOXI - SDBS

Eu-MOXI-SDBS

Eu-MOX-SBDS
0.4

1000

0.2

500

0
200

250

300

350

400

450

500

0

500

Bước sóng / nm

550

600

650

700

750

Bước sóng / nm

Hình 3.12. Phổ
-VIS (a) và phổ phát xạ (b) của dung dịch
3+
Eu , MOXI, Eu3+-MOXI, Eu3+-MOXI-SBDS
Khảo sát điều kiện phân tích gồm thời gian phản ứng tạo phức, sự
ảnh hưởng của pH, sự ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của nồng độ
Eu(III), ảnh hưởng của nồng độ Eu(III), ảnh hưởng của nồng độ
11


SBDS. Kết quả thu được điều kiện phân tích để định lượng MOXI
trong huyết tương như sau (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Điều kiện phân tích MOXI bằng phương pháp phổ
huỳnh quang
T
Điều kiện phản ứng
Giá trị
T
1 Bước sóng kích thích
405 nm
2 Bước sóng phát xạ huỳnh quang
616 nm
3 Thời gian ổn định phức
30 phút
4 Đệm Tris-HCl

pH 9,3
5 Nồng độ Eu(III)
3,0×10-5M
6 Nồng độ SBDS
3,5×10-5M
3.2.2. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
3.2.2.1. Độ đặc hiệu
Tiến hành với mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn MOXI. Kết quả cho
thấy đối với mẫu trắng khơng chứa chất phân tích khơng có tín hiệu
huỳnh quang đặc trưng tại các vị trí tương ứng của mẫu thêm chuẩn
MOXI. Như vậy có thể khẳng định rằng phương pháp có tính đặc
hiệu cao.
3.2.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính
Pha dãy mười nồng độ MOXI có giá trị từ 0 – 2,8×10-5 M, sau đó
tiến hành đo cường độ huỳnh quang. Kết quả cho thấy cường độ tín
hiệu huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS tăng khi tăng dần
nồng độ MOXI. Khoảng tuyến tính phân tích MOXI được xác định
nằm trong khoảng từ 5,010-7  2,210-5 M.
3.2.2.3. Đường chuẩn
Tiến hành đo cường độ huỳnh quang của các mẫu chuẩn ứng với
nồng độ MOXI trong mẫu từ 0,05×10-5 - 1,6 ×10-5M. Thiết lập đường
chuẩn tương quan giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của mẫu,
phương trình hồi quy được xác định là y = 8020,5x + 150,35 với hệ
số tương quan là R2 = 0,9950.
3.2.2.3. Giá trị LOD, LOQ và độ lặp lại
Tiến hành lặp lại 10 thí nghiệm của cùng một mẫu, tính được giá
trị trung bình nồng độ MOXI : 0,155310-5M. Giá trị độ lệch chuẩn
SD 0,0068 ×10-5M. LOD, LOQ của phương pháp được xác định là:
12

LOD = 3SD = 0,02.10-5M; LOQ = 10SD = 0,06810-5M. Độ lặp
lại của phương pháp phân tích với RSD% = 4,38%. Như vậy phương
pháp có LOD, LOQ thấp và độ lặp lại cao, đáp ứng theo tiêu chuẩn
AOAC, ICH.
3.2.2.5. Độ thu hồi
Mẫu huyết tương được xử lý theo quy trình Mục 2.3.1. Sau đó
tiến hành phân tích theo điều kiện đã khảo sát, độ thu hồi thu được
nằm trong khoảng 94,83-101,34% với độ lệch chuẩn tương đối từ
1,48-4,27% đạt yêu cầu theo hướng dẫn.
3.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích MOXI trong mẫu
thực
Mẫu được phân tích là mẫu huyết tương người bệnh truyền dịch
Avelox 450mg/250ml; mẫu lấy sau 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ truyền, thí
nghiệm lặp lại (n=5). Kết quả xác định MOXI trong huyết tương
được xác định có độ lặp lại tốt với RSD < 7%. Tùy thuộc vào thời
gian lấy mẫu sau khi truyền, hàm lượng MOXI trong huyết tương
của bệnh nhân là khác nhau, dao động từ 1,773 – 2,884 g/ml sau 1
đến 3 giờ truyền. So sánh kết quả này với hàm lượng MOXI (1,522,07 g/ml) trong mẫu huyết tương của 3 bệnh nhân được xác định
bằng phương pháp HPLC-PDA đã xây dựng được ở mục 3.1 cho
thấy hai phương pháp phân tích cho kết quả tương đối tương đồng.
3.3. QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI BỐN
FLUOROQUINOLON TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ NƢỚC
TIỂU BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-FLD
3.3.1. Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong
huyết tƣơng bằng phƣơng pháp HPLC-FLD
3.3.1.1. Điều kiện sắc ký:
Qua khảo sát các điều kiện sắc ký Mục 2.3.2.3. Kết quả, điều kiện
tối ưu cho phương pháp như sau: ct Supelco - C18, 25cmì4,6mm,
5àm, detector hunh quang - cp bước sóng kích thích/phát xạ λEx

/λEm 290/500nm (LEVO và MOXI), λEx /λEm 280/445nm (NOR và CIP).
Dung môi pha động: MeOH:H3PO4 0,025M, pH 3, gradient nồng độ
Nồng độ MeOH từ 15% (0-2 phút), 15-35% (2-17 phút), 15-80 %
(17-22 phút), và 80 % (22-27 phút). Thể tích tiêm 10µl, nhiệt độ lị
cột 30oC.
13


3.3.1.2. Xử lý mẫu huyết tương
Trong mục 3.1. đề tài đã sử dụng dung dịch TCA 20% làm tác
nhân kết tủa protein, phương pháp kết tủa đẳng điện nàyđạt hiệu suất
thu hồi MOXI từ 89,20 % đến 97,32%. Tuy nhiên trong phần nghiên
cứu này đề tài tiến hành khảo sát một tác nhân kết tủa protein khác là
MeOH. Mục đích để phát triển, mở rộng thêm phương pháp, mặt
khác để so sánh khả năng kết tủa của hai tác nhân dựa trên hiệu suất
thu hồi của phương pháp sau khi đã tối ưu hóa các điều kiện xử lý
mẫu: thể tích, nồng độ dung dịch/dung mơi kết tủa, thời gian kết tủa,
thời gian ly tâm, tốc độ ly tâm. Kết quả hai tác nhân này đều cho
hiệu suất thu hồi khá cao, tuy nhiên với việc sử dụng MeOH cho kết
quả hiệu suất cao hơn so (92,6-102,0%) với TCA (83,2-89,8%). Điều
này được giải thích là do MeOH có thể làm giảm sự phân hủy thuốc,
cho nên kết quả độ thu hồi cao. Trong khi đó sử dụng tác nhân kết
tủa là acid mạnh như TCA có thể làm kết tủa đồng thời hoặc phân
hủy một phần chất phân tích.
Như vậy, quy trình phân tích đồng thời bốn FQL trong huyết
tương bằng phương pháp HPLC-FLD kết hợp kỹ thuật xử lý mẫu lựa
chọn dung môi MeOH làm tác nhân kết tủa protein. Quy trình phân
tích như sau: mẫu huyết tương được kết tủa protein bằng MeOH với
tỷ lệ thể tích 1:4, tiến hành lắc xốy votex 2500 vịng/phút trong 5
phút. Sau đó ly tâm 6000 vịng/phút trong 20 phút. Hút dịch nổi, lọc

qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC.
3.3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Độ đặc hiệu: Kết quả trên sắc ký đồ Hình 3.32 cho thấy mẫu
trắng khơng có pic tạp xuất hiện tại vị trí thời gian lưu của các FQL
chuẩn. Đối với mẫu thử tự tạo, sắc ký đồ cho các pic tương ứng tại vị
trí thời gian lưu của FQL chuẩn (± 0,05 phút) trong dung môi pha
động, các pic được tách hồn tồn, sắc nhọn và khơng trùng vào vị
trí của các pic tạp trong mẫu huyết tương. Như vậy, có thể kết luận
phương pháp phân tích đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu.

14


mV
500
450

a)

400
350
300
250
200
150
100
50
0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

min

mV
18..3

1500
19.4

b)

1250
17.3
22.4

1000

750

500

250

0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

min

Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu trắng (a) và mẫu huyết tương tự tạo
chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml kết tủa bằng MeOH (b)
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành trên mẫu dịch nổi thu được sau khi xử lý mẫu, thêm các
chuẩn FQL có nồng độ bắt đầu bằng 0,02 µg/ml, tiêm vào hệ thống
HPLC. Từ sắc ký đồ thu được, lấy chiều cao pic chất trung bình của
3 lần đo của 4 FQL (S) và chiều cao trung bình ở 3 vị trí của nhiễu
nền (N). Nồng độ giảm dần cho tới khi đạt kết quả S/N = 3. Xác định
các giá trị MDL = 5×LOD; MQL = 5×LOQ. Kết quả trong Bảng
3.24.
Khoảng tuyến tính
Mẫu huyết tương khơng chứa FQL, xử lý mẫu theo quy trình đã

khảo sát. Dung dịch thu được sau xử lý mẫu được thêm vào các thể
tích dung dịch FQL chuẩn nồng độ 100,0 µg/ml và 1,0 µg/ml đã tính
tốn và pha lỗng tới nồng độ thích hợp bằng MeOH sao cho tạo
thành một dãy nồng độ như sau: 0,02; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2.5; 5,0;
10,0; 15,0 và 20,0 µg/ml. Kết quả thu được ở Bảng 3.24.
Bảng 3.24. Phương trình đường chuẩn, hệ số hồi quy, khoảng
tuyến tính, LOD, LOQ, MDL và MQL của các FQL
15


H s
FQL

NOR
CIP
LEVO
MOXI

Phng trỡnh

tng

ng chun

quan
(R2)

y = 1,09ì107x

0,9991

+ 1,50ì10

MDL
(àg/ml)

MQL
(àg/ml)

0,05-15

0,0071

0,0234

0,0355

0,1170

0,9992

0,05-10

0,0080

0,0264

0,0400

0,1320

0,9990

0,05-15

0,0074

0,0244

0,0370

0,1220

0,9995

0,10-10

0,0171

0,0564

0,0855

0,2820

5

y = 7,30ì106x
+ 1,25ì10

LOQ
(àg/ml)

6

y = 7,62ì106x
+ 9,70ì10

LOD
(àg/ml)

tuyn tớnh
(àg/ml)

6

y = 1,13ì107x
+ 1,40ì10

Khong

6

Chỳ thớch: y din tích pic; x nồng độ FQL trong huyết tương; R2: hệ
số hồi quy tuyến tính.
Độ lặp lại và độ thu hồi
Các thử nghiệm được tiến hành trên mẫu thử tự tạo, ở 3 nồng độ:
1,0; 5,0; 10,0 µg/ml, mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần, mỗi mẫu bơm 3
lần, lấy diện tích trung bình của 3 lần bơm và trung bình của 6 lần
lặp lại của 1 nồng độ. Kết quả thu được giá trị RSD% của các FQL

nằm trong khoảng từ 0,7 đến 5,43%, độ thu hồi đạt từ 98,8–103,5%
đối với NOR và 95,0–105,4% với CIP, 99,6–105,4 % với LEVO và
92,5–99,8 % đối với MOXI, các giá trị này đều chấp nhận được theo
hướng dẫn của AOAC.
Phương pháp này được phát triển phù hợp để xác định đồng thời
bốn FQL trong huyết tương do nồng độ pic khoảng từ 1,60–2,87
µg/ml cho một liều uống norfloxacin 400 mg, 1,3–2,0 µg/ml cho một
liều uống ciprofloxacin (10 mg/kg thể trọng), sau 12 h ở trẻ suy dinh
dưỡng nặng, 2,8 và 5,2 µg/ml cho 250 và 500 mg levofloxacin uống
và 2,60–3,79 µg/ml khi uống moxifloxacin 400 mg.
3.3.2. Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong
nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp HPLC-FLD
3.3.2.1. Điều kiện sắc ký
Trong nghiên cứu định lượng đồng thời 4 FQL trong mẫu huyết
tương đã sử dụng cột sắc ký C18 MRC-ODS (250×4,6 mm, 5 μm),
phương pháp đã xây dựng được có nhiều ưu điểm như đã trình bày ở
16


mục 3.3.1. Tuy nhiên thời gian cho một mẫu sắc ký cịn khá dài trên
22 phút cho chất phân tích cuối cùng ra khỏi cột. Trong phần nghiên
cứu này, đề ti s dng ct C18 (YMC-pack ODS-A, 150ì4,6mm,
5àm) cú kớch thước chiều dài cột ngắn hơn tăng sự đa dạng, phù hợp
với nhiều điều kiện thực tế và hơn nữa có thể rút ngắn hơn được thời
gian sắc ký. Đặc biệt là các điều kiện sắc ký đã khảo sát ở Mục
3.3.1.1 vẫn được giữ nguyên. Pha động gồm MeOH, H3PO4 0,025 M,
pH 3 (điều chỉnh bằng trietyl amin), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt
độ lò cột 30oC. Cặp bước sóng kích thích và phát xạ (λex/λem) tương
ứng: 280/445 nm đối với NOR, CIP; 290/500 nm đối với LEV,
MOXI.

3.3.1.2. Xử lý mẫu nước tiểu
Dựa vào diện tích píc thu được với từng yếu tố khảo sát, lựa chọn
điều kiện tối ưu cho quy trình xử lý mẫu, khảo sát bằng phương pháp
đơn biến. Từ các kết quả khảo sát, xác định được quy trình phân tích
mẫu nước tiểu xác định các FQL bằng hai phương pháp có sơ đồ tiến
hành như sau:
a)Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Lấy chính xác 0,5 ml mẫu nước tiểu
↓
Thêm 5,0 ml dung môi diclometan/MeOH (8:2)
↓
Lắc xốy bằng votex 2000 vịng/phút, 3 phút
↓
Ly tâm 15 phút
↓
Hút chính xác 2,0 ml dịch nổi
↓
Cơ đuổi bằng thiết bị cơ quay chân khơng, 45oC
↓
Hịa tan bằng 2,0 ml dung mơi MeOH:HCl 0,1M (1:1)
↓
HPLC

Hình 3.39. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử
lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng

17


b) Phương pháp chiết pha rắn

Cột Oasis HLB, 500mg 6mL
Hoạt hóa cột: 3,0 mL MeOH,
3,0 mL nước, 6,0 mL đệm
phosphat pH 3

1,0 mL nước tiểu

5,0 mL nước

Rửa giải bằng 5,0 mL
Diclometan
Làm bay hơi dung môi của dung
dịch thu được ở 40 - 45 oC

Hịa tan bằng 2,0 ml dung mơi
MeOH :HCl 0.1M (1 :1), lọc
qua màng lọc 0.45µm
HPLC

Hình 3.40. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý
mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn
3.3.2.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
a) Phương pháp chiết lỏng –lỏng
Độ đặc hiệu: Kết quả trên sắc ký đồ mẫu nước tiểu trắng Hình
3.39 khơng xuất hiện pic lạ trùng vào vị trí thời gian lưu của mẫu
thử có nồng độ FQL là 1,0 µg/ml (b).

18

mV
3500 Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm
Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm
3000
2500
2000
1500
1000
500

(a)

0
5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

mV
Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm
2500 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm

11.0

12.0

13.0

LEVO

15.0

16.0

17.0

min

MOXI

CIP

2000

14.0

NOR

1500
1000
500

(b)

0
5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

17.0

min

Hình 3.41. Sắc ký đồ mẫu nước tiểu (a) khơng chứa FQL, (b)

mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml - xử lý mẫu bằng
phương pháp chiết lỏng- lỏng
Khoảng tuyến tính
Sau khi tiến hành theo quy trình đã xây dựng (Hình 3.40) các mẫu
thử tự tạo có nồng độ FQL từ 0,02 – 20,0 µg/ml được khảo sát để xác
định khoảng tuyến tính và thiết lập phương trình đường chuẩn. Kết
quả thu được hệ số tương quan R2 của bốn FQL đều > 0,999; khoảng
tuyến tính của các FQL nằm trong khoảng 0,02-10,0 µg/ml.
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Thí nghiệm được thực hiện với nồng độ các FQL trong mẫu thử
tự tạo là 0,02 µg/ml và xác định được LOD của NOR, CIP, LEVO,
MOXI tương ứng lần lượt là 0,008; 0,010; 0,007; 0,006 µg/ml và
LOQ tương ứng lần lượt là 0,027; 0,034; 0,024; 0,020 µg/ml. MDL
và MQL lần lượt đối với NOR, CIP, LEVO, MOXI là: 0,032; 0,041;
0,029; 0,024 và 0,108; 0,136; 0,096; 0,080.
Đường chuẩn: Kết quả đường chuẩn được xác lập tương quan
giữa nồng độ và diện tích, phương trình đường chuẩn của NOR, CIP,
LEVO, MOXI lần lượt như sau: y = 15313397x – 332379; y =
10452676x – 82095; y = 14307738x – 356669; y = 7752335x +
25104, hệ số tương quan R2 nằm trong khoảng 0,9997-0,9999 và độ
đúng tính lại từ đường chuẩn đã được đánh giá.
19


mV
Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm
900 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm
800

Độ đúng và độ lặp lại: Kết quả độ thu hồi nằm trong khoảng yêu

cầu
từ 97,7-102,0%, giá trị độ lặp lại từ 1,3 – 1,9 % chấp nhận được
500
theo
hướng dẫn của AOAC.
400
300 b) Phƣơng pháp chiết pha rắn
200
Độ đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu trắng và mẫu trắng thêm
100
chuẩn
FQL nồng độ 1,0 µg/mL theo quy trình đã xây dựng và sơ đồ
0
hình
quả thu
được
sắc10.0ký đồ
5.0 3.40
6.0 kết 7.0
8.0
9.0
11.0 Hình
12.0 3.43.
13.0
14.0
15.0
16.0
min
700
600

mV
Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm
900 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm
800
700
600
500
400
300
200

(a)

100
0
5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

mV
Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm

Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm

11.0

12.0

Nor
Levo
Cip

6000
5000

13.0

14.0

15.0

16.0

min

Moxi

4000
3000
2000

(b)

1000
0
5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

min

Hình 3.43. Mẫu nước tiểu khơng chứa FQL (a), mẫu nước tiểu
chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml (b)- xử lý mẫu bằng phương pháp chiết

pha rắn
Từ sắc ký đồ cho thấy mẫu trắng không thấy xuất hiện các pic
tạp trùng với vị trí của các chất phân tích. Đường nền tại vị trí pic
FQL cho tín hiệu thấp. Như vậy, phương pháp nghiên cứu có độ
đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu.
Khoảng tuyến tính: Kết quả diện tích pic thu được tương ứng với
các nồng độ FQL khảo sát (0,02, 0,025, 0,10, 0,50, 1,0, 2,50, 5,0,
10,0, 20,0 và 25,0 µg/mL), PL 3.16, Bảng 3.36.
Giá trị LOD, LOQ, MDL và MQL
Tiến hành trên mẫu dịch nổi thu được sau khi xử lý mẫu, thêm các
chuẩn riêng lẻ từng FQL có nồng độ bắt đầu bằng 0,02 µg/ml, tiêm vào
20


hệ thống HPLC. Nồng độ giảm dần cho tới khi đạt tỷ lệ tín hiệu/nhiễu
nền bằng 3 và 10. Kết quả thu được trình bày trong Bảng 3.36,
Bảng 3.36. Giá trị LOD và LOQ, MDL, MQL của FQL
Tên FQL

Khoảng tuyến
tính
(µg/ml)

NOR
CIP
LEVO
MOXI

0,02-25,0

LOD
(µg/ml)

LOQ
(µg/ml)

MDL
(µg/ml)

MQL
(µg/ml)

0,009

0,028

0,017

0,057

0,010

0,033

0,020

0,065

0,007
0,006

0,024
0,020

0,014
0,012

0,047
0,039

Các giá trị MDL của phương pháp định lượng cho bốn FQL trên
trong mẫu nước tiểu mà nồng độ của chúng khoảng 50 µg/ml được
thỏa mãn, ngay cả khi pha lỗng chúng 500 đến 1000 lần. Theo các
nghiên cứu trước, các FQL này được thải trừ trong nước tiểu ở dạng
không thay đổi là 30% đối với NOR, 40–60% đối với CIP, 80–85%
đối với LEVO và 20% đối với MOXI. Do đó, có thể thực hiện đánh
giá dược động học của các FQL này dựa trên phương pháp đề xuất.
Đường chuẩn
Dãy nồng độ các FQL nằm trong khoảng (0,025 -10,0) µg/ml
được chuẩn bị như trình bày trong mục 2.3.5.3 của luận án. Từ diện
tích pic thu được xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa
nồng độ và diện tích pic cho bốn FQL. Phương trình đường chuẩn
được thiết lập của NOR, CIP, LEVO và MOXI lần lượt : y =
11842918,06x + 853994,31; y = 11573367,29x + 354372,18; y =
12082493,02x – 255541,28; y = 10080269,14x + 680658,66 và hệ số
tương qua R2 của 4 FQL từ 0,996 – 0,998.
Độ đúng
Tiến hành thực hiện trên mẫu thử tự tạo ở 3 mức nồng độ 0,1;
1,0 và 5,0 µg/ml. Dựa trên diện tích tương ứng thu được và phương
trình đường chuẩn của các FQL đã xác lập, tính nồng độ tìm lại và

hiệu suất thu hồi để đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích.
Kết quả thu được độ đúng của 4 FQL nằm trong khoảng từ 98101,2%, kết quả này đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ICH.
Độ lặp lại
21


Để đánh giá độ chụm của phương pháp, tiến hành lặp lại 6 lần
trên mẫu thử tự tạo với nồng độ thêm chuẩn FQL lần lượt là 1,0 ; 5,0
và 10,0 µg/ml theo phương pháp phân tích đã xây dựng. Kết quả giá
trị độ lặp lại RSD% của cả 4 FQL ở cả 3 mức nồng độ đạt từ 0,7 –
2,7 %. Như vậy, quy trình đã xây dựng để phân tích đồng thời 4 FQL
trong nước tiểu, xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn
có độ lặp lại đạt yêu cầu.
Trong phần nghiên cứu này, đề tài thực hiện các nghiên cứu ban
đầu cho nghiên cứu lâm sàng, sử dụng huyết tương và nước tiểu
người. Nghiên cứu lâm sàng này đơn giản và được thẩm định theo
hướng dẫn ICH.
Trước tiên, đề tài tham khảo các nghiên cứu trước đây về các điều
kiện sắc ký, bước sóng kích thích/phát xạ, phương pháp xử lý mẫu,
khoảng tuyến tính. Cmax trung bình đối với người sử dụng LEVO ở
liều 250 và 500 mg được báo cáo là 2,8 và 5,7 µg/ml. Cmax trung bình
đối với người sử dụng CIP đường tiêm truyền ở liều 200, 300 và 400
mg được báo cáo là 2,5, 3,2 và 4,0 µg/ml và đường uống liều 200,
400, 600 mg là 1,21, 2,45 và 3,33 µg/ml. Cmax của MOXI và NOR
đường uống với liều 600 và 400 mg lần lượt là 4,1 và 0,7 µg/mL. Do
đó, khoảng tuyến tính được khảo sát từ 0,02 tới 20,0 µg/ml.
Tỉ lệ diện tích dưới đường cong so với nồng độ ức chế tối thiểu
trong huyết tương của thuốc (AUC/MIC và Cmax/MIC) là các thông
số dược lực học được sử dụng để tối ưu hóa hiệu quả của các kháng
sinh FQL. Do đó, để theo dõi, đánh giá dược động học của FQL cần

được thực hiện liên tục để tránh thất bại trong điều trị, ngăn ngừa vi
khuẩn kháng thuốc và chọn tác nhân, liều lượng và thời gian điều trị
tối ưu. Sử dụng phương pháp HPLC ngày nay tại Việt Nam phổ biến
ở hầu hết phịng thí nghiệm cho phân tích định tính, định lượng thuốc.
Do đó, thiết lập phương pháp có thể ghi lại dược động học của các
FQL trong dịch sinh học với quy trình đơn giản, ổn định, thời gian
ngắn sẽ là công cụ hỗ trợ hiệu quả cho phác đồ điều trị bệnh. Phương
pháp định lượng đồng thời 4 FQL gồm MOXI, LEVO, NOR, CIP
trong mẫu nước tiểu và huyết tương sẽ góp phần hỗ trợ các cơ sở y tế
sử dụng để theo dõi được dược động học các kháng sinh này cho
bệnh nhân, giúp phác đồ điều trị hiệu quả hơn. Mặc dù, khơng có bất
22


kỳ phác đồ điều trị bệnh sử dụng đồng thời cả 4 kháng sinh này. Tuy
nhiên, phương pháp này là quy trình chung có thể áp dụng cho phân
tích từng kháng sinh đơn lẻ trong dịch sinh học nước tiểu và huyết
tương. Ví dụ nếu 4 bệnh nhân sử dụng 4 kháng sinh FQL (CIP, NOR,
LEVO, MOXI) khác nhau, 4 mẫu thu được sẽ xử lý và phân tích theo
chung một quy trình, như vậy sẽ thuận tiện, đơn giản hóa cho q
trình phân tích.
Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC-FLD được xây dựng
và thẩm định để xác định đồng thời MOXI, LEVO, NOR, CIP trong
huyết tương và nước tiểu. Các quy trình xử lý mẫu sinh học huyết
tương và nước tiểu được khảo sát đánh giá hiệu quả chiết, loại tạp.
KẾT LUẬN
1. Đã khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký nhằm xác định
moxifloxacin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên hệ
thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPDM10vp (Shimadzu, Nhật Bản) gồm: ct C18 MRC-ODS
(25cmì4,6mm, 5àm), bc súng hp th 295nm, pha động ACN–

đệm phosphat; pH = 4,0, nồng độ đệm 20mM (60:40), chế độ đẳng
dịng, 0,8ml/phút, thể tích tiêm 20µl, thời gian lưu thu được là 7,4±
0,05 phút.
- Đã tối ưu hóa được quy trình xử lý mẫu khi xác định
MOXI trong mẫu huyết tương. Kết quả cho giá trị LOD, LOQ lần
lượt là 0,15 và 0,5 µg/ml, độ thu hồi trung bình đạt từ 89,2-97,32%
và độ lặp lại 1,18–10,22%.
- Đã áp dụng thử nghiệm quy trình để phân tích xác định
hàm lượng MOXI trong mẫu huyết tương của 3 bệnh nhân đang điều
trị thuốc kháng sinh, lấy mẫu sau 1-3 giờ tiêm truyền.
2. Đã khảo sát và tối ưu hóa điều kiện xác định moxifloxacin bằng
phương pháp quang phổ huỳnh quang, dựa trên nguyên tắc đo cường
độ huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SDBS với bước sóng kích
thích/bước sóng phạt xạ tương ứng 405/616nm, với nồng độ Eu3+
3,0×10-5M, chất hoạt động bề mặt SDBS được thêm vào với nồng độ
3,5×10-5 M, dung dịch đệm Tris-HCl pH 9,3, thời gian phản ứng (ổn
định phức) là 30 phút.
23