BÁO CÁO "PHẢN ỨNG TRUNG HÒA VIRUT PRRS TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ ỨNG DỤNG " pot

24/6
PHN NG TRUNG HA VIRUT PRRS TRÊN NUÔI CẤ Y TẾ BÀ O VÀ Ƣ́ NG DỤ NG

Trầ n Thị Thanh Hà
1
, Ken Inui
2
, Phm Th Nga
1
, Đng Xuân Sinh
1
,
Trnh Quang Đi
1
, Trương Anh Đứ c
1
v Nguyn Vit Không
1
.

TM TT.
Trung hò a virut vớ i huyế t thanh trên nuôi cấ y tế bà o cho phé p đá nh giá được mứ c huyế t
thanh lợ n miễ n dịch trung hò a đượ c virut PRRS có nguồ n gố c khá c nhau , sơ bộ đá nh giá khả
năng miễ n dịch dịch thể bả o hộ .
Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi đã thiế t lậ p phương php trung ha virut (VNT) PRRS trên
tế bà o Marc145, bướ c đầ u sử dụ ng đá nh giá hiệ u giá trung hò a củ a lợ n là nh bệ nh triệ u chứ ng tạ i
thự c địa có so sá nh vớ i phương phá p chẩ n đoá n ELISA và IPMA . Khc vi kt qu ELISA v
IPMA, VNT cho thấ y huyế t thanh lợ n nhiễ m PRRS chủ ng Việ t Nam chỉ trung hò a virut phân lậ p
nộ i địa, không trung hò a cá c virut c ngun gc Châu Âu v Bc M. VNT tỏ ra là phương phá p
chiế m ưu thế hơn ELISA và IPMA trong đá nh giá đá p ng min dch ca lợ n khá ng chủ ng địa
phương.

Từ khóa: Virut PRRS, Trung hòa, T bo Marc145, Huyt thanh.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Hội chng ri loạn sinh sn v hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Resiratory
Syndrome - PRRS) gây thiệt hại ln đi vi ngnh chăn nuôi lợn ở Việt nam v trên th gii .
Hng năm, tại M ưc tính thiệt hại do bệnh PRRS gây ra ở mc 720 triệu đô la Mỹ . Ở Việt
nam, thiệt hại kinh t do PRRS gây ra chưa được ưc tính, tuy nhiên trong những năm gần đây
hng loạt cc trại lợn đã phi tiêu huỷ do hội chng ri loạn sinh sn v hô hấp. Bệnh được xp
vào nhóm cc bệnh nguy hiểm trong danh mục cc bệnh ca Tổ chc thú y th gii (OIE).
Cho đn nay, lợn l động vật duy nhất mc hội chng ri loạn hô hấp v sinh sn
[7,8,9,11]. Việc khng ch dch bệnh đang gặp nhiều kh khăn do chưa c loại vacxin no c thể
bo hộ đn lợn hon ton phng chng được hội chng ri loạn hô hấp v sinh sn. Để khẳng
đnh c hay không khng thể trung ha sau khi tiêm phng vacxin hoặc sau khi con vật nhim
bệnh, chúng tôi s dụng phương php trung ha huyt thanh.
1
Phương php ny được
Morrison v cs mô t năm 1992, so vi phương php IPMA khng thể, phương php trung ho
khng thể đi vi vi rút PRRS l phương php tiê u chuẩn dùng để pht hiện sự xuất hiện khng
thể chậm. Phương php ny được Yoon v cs ci tin năm 1994 bằng cch pha loãng vi rú t trong
huyt thanh thường , lm tăng độ nhạ y ca phn ng , cho phép pht hiện khng thể trung ho
sm khong 11 ngy sau khi gây nhim ; đng thời, c thể thấy sự khc biệt khi sử dụng cc
chng vi rú t c độ tương đng khc nhau . Sự khc nhau ny không quan st được khi dùng
phương php IFAT. Phương php trung ha virut thường chỉ p dụng được ở những phng thí
nghiệm c đ điều kiện nuôi cấy t bo, ít được sử dụng thường quy trong chẩn đon . Tuy nhiên,
phương php ny c thể dùng cho những vi rú t PRRS phân lập được c tính khng nguyên khc
nhau, đng thời l phương php ti ưu xc đnh độ di min dch ca cơ thể lợn đi vi vi rú t
PRRS [7]. Ở Việt Nam, do điều kiện cơ sở vật chất phng thí nghiệm chưa cho phép thực hiện
việc công cường độc vì th n c thể được thay th bằng phương php trung ha virut trên t
bào.
II. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CU

2.1. Nội dung.
- Nuôi cấy t boMarc145
- Chuẩn độ virut PRRS
- Thit lập phương php trung ha virut PRRS trên môi trường t bo Marc145
- Áp dụng phương php trung ha virut đi vi một s mẫu từ thực đa
2.2. Nguyên liệu.


1
Viện Thú y, 2. Chuyên gia FAO tại Việt nam
25/6
- T bo Marc145 c ngun gc từ c
- Môi trường MEM, Huyt thanh bo thai bê củ a hã ng Gibco
- 3 chng Virut PRRS: 0196 (chng phân lập tại thực đa ); Chng Châu âu phân lập lại từ
vacxin Amervac do bộ môn Hó a sinh - Miễ n dịch- Bệ nh lý và chủ ng Bắ c Mỹ (chng MLV) do
chuyên gia FAO cung cấ p.
- Chai nuôi cấy, đĩa nuôi cấy củ a hã ng Corning.
- Huyt thanh âm chuẩ n và dương chuẩ n do chuyên gia FAO cung cấ p Má y li tâm , t lạnh,
safety cabinate và má y mó c khá c trong phò ng thí nghiệ m.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu :
2.3.1.Nuôi cấy t bo Marc145
Phương phá p nuôi cấ y tế bà o đượ c thự c hiệ n theo quy trình ca CSIRO , Úc (The
commonwealth Scientific and Industrial Reseach Organisation)
2.3.2. Gây nhim virut PRRS trên t bo Marc145 (được thực hiện theo hưng dẫn ca OIE
trong chương 2.08.07)
2.3.3. Xác đnh sự có mt của virut PRRS bằng phản ứng RT-PCR
Đây l phương php thường quy tại bộ môn Ha sinh- Min dch -Bệnh lý, Viện thú y, phn
ng được tin hnh theo cc bưc như sau:
(1) Tch chit RNA bằng phương php Trizol
(2) Tổng hợp cDNA bằng phương php sử dụng Random primer

(3) PCR sử dụng cặp mi đặc hiệu được thit k để pht hiện vi rú t PRRS
2.3.4. Chuẩn độ virut
Phương phá p nà y đượ c thự c hiệ n theo quy trình ca OIE , và tính TCID50 theo phương php
Read Muench [1]
Âm tính: Nu ở độ pha loãng đ t bo pht triển bình thường, không c bệnh tích t bo
(Ging đi chng t bo)
Dương tính: Nu ở độ pha loãng đ xuất hiện bệnh tích trên t bo (ging đi chng virut)
2.3.4. Thit lập phương pháp trung hòa virut trên môi trường t bo (theo hướng dẫn của OIE
trong chương 2.08.07 và Virology methods manual) [1,2,3,7,8]

III. KẾT QU NGHIÊN CU
3.1. Kết quả nuôi cấy tế bào
Để c t bo ở trạng thi đang pht triển v ph đy 100% sau 1; 2 ngy thì lượng t bo khi
cấy chuyển cần 5x10
5
t bo /ml; 2x10
5
t bo/ml. Vi mật độ v tình trạng pht triển ca t bo
như trên, cc thí nghiệm về gây nhim vi rú t , nhân ging vi rú t, chuẩn độ v phn ng trung ha
đều đạt kt qu tt.
3.2. Kết quả gây nhiễm virut PRRS trên tế bào Marc145
Qua gây nhim virut PRRS trên t bo Marc145 cho thấy tùy từng chng m thời gian xuất
hiện bệnh tích t bo khc nhau v biểu hiện bệnh bin ca t bo cũng khc nhau. Bệnh tích
điển hình l t bo co cụm hình chùm nho hoặc t bo b ph hy hon ton
3.3. Xác định sự có mặt của virut PRRS bằng phản ứng RT-PCR
Sau khi nhân ging 03 chng vi rú t sẽ sử dụng trong nghiên cu , để khẳng đnh lại sự c
mặt ca cc chng vi rú t ny, chúng tôi đã sử dụng phương php RT-PCR. vớ i cặ p mồ i F2R2 c
trình tự:
Fwd: 5’ATGTTGGGGAAATGCTTGACC3’
v Rev: 5’GTTCCGCTGAAACTCTGGTTA3’

Kt qu cho thấ y c 3 chng vi rú t PRRS sau khi được nhân lên trên t bo Marc 145 đều
cho kt qu PCR dương tính . Chng tỏ việc gây nhim vi rú t P RRS v nhân ging vi rú t thnh
công.
3.4. Kết quả chuẩn độ các chủng virut PRRS
26/6
Trong nghiên cu ny chúng tôi tiế n hà nh chuẩn độ 3 chng virut: (1)chng 0196, (2) chng
Châu Âu; (3) chng MLV. Mỗ i chủ ng vi rú t PRRS đượ c thự c hiệ n chuẩ n độ lặ p lạ i 3 lầ n, kế t quả
cc lần thực hiện đều ging nhau.
Bảng 1. Kt quả chuẩn độ các chủng virut PRRS
TT
Chủng virut PRRS
TCID50
1
0196
10
6.5
/ml
2
Châu Âu
10
5.5
/ml
3
MLV
10
6.7
/ml

3.5. Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa virút PRRS trên môi trƣờng tế bào Marc145.
Để thit lập phương php trung ha trên môi trường t bo Marc 145 đi vi vi rú t PRRS ,

chúng tôi đã sử dụng chng vi rú t cường độc phân lập tại thực đa v mẫu huyt thanh dương v
âm đi vi phương php ELISA v IPMA
Mẫ u huyế t thanh dương là mẫ u huyế t thanh thu đượ c từ lợ n đượ c gây nhiễ m vi rú t PRRS
nhân tạ o và mẫu huyt thanh âm l mẫu huyt thanh thu thập từ lợn ca những vùng không b
nhiễ m bệ nh PRRS, đã đượ c sà ng lọ c bằ ng phả n ứ ng ELISA và IPMA
Phn ng trung hò a vir ut PRRS trên môi trường t bo Marc145 đượ c thiế t lậ p trên cơ sở
phn ng trung ha vi rút theo hưng dẫn ca Virology methods manual [1]
Trong quá trình thiế t lậ p phương phá p t rung hò a virut PRRS tạ i bộ môn HSMDBL , thí
nghiệ m đã đượ c thự c hiệ n lặ p lạ i nhiề u lầ n , v sau mi lần thí nghiệm , cc điều kiện như nng
độ CO2, thờ i gian ủ virut v huyt thanh, nhiệ t độ thích hợ p cho việ c trung hò a virut…đều được
tố i ưu hó a sau từ ng thí nghiệ m.
Kế t quả : Phương phá p trung hò a đã đượ c thiế t lậ p gm cc bưc như sau:
Bướ c 1: Chuẩ n bị tế bà o
Bưc 2 : Chuẩn b virut
Bướ c 3: Trung hò a huyt thanh
Bưc 5: Đnh gi kt qu
Âm tí nh: Nế u ở độ pha loã ng huyế t thanh đó có bệ nh biế n tế bà o (huyế t thanh không trung
ha được vi rút).
Dương tính: Nế u tạ i giế ng đó lớ p tế bà o vẫ n phá t triể n tố t , bm đy v không c bệnh tích
tế bà o.
Đi vi c c mẫ u thí nghiệ m : Ở cc ging c nng độ huyt thanh cao : Lớ p tế bà o mọ c
đều, mn v pht triển tt, không có tế bà o chế t, không có bệ nh biế n tế bà o . Ở cc ging c nng
độ huyế t thanh thấ p, xuấ t hiệ n cá c đá m tế b o cụm lại, sau 5 ngy cc đm t bo b bong ra v
chế t, khi nhuộ m không cò n hoặ c rấ t í t tế bà o bá m đá y.
Kế t quả cho thấ y phn ng trung ha đã được thit lập trên mẫu huyt thanh dương tính v
âm tính chuẩn (theo phương php ELISA và IPMA) vi chủ ng vi rú t thực đa cường độc.
3.6. Kế t quả á p dụ ng phả n ứ ng trung hò a đố i vớ i mộ t số mẫ u huyế t thanh dương, âm tính đố i
vớ i ELISA
Sau khi thiế t lậ p đượ c phương phá p đề tà i đã thự c hiệ n phả n ứ ng trung hò a đố i vớ i 20 mẫ u
huyế t thanh củ a lợ n sau khi bị bệ nh PRRS tạ i Quả ng Nam dương tính vớ i ELISA và 5 mẫ u huyế t

thanh âm tính vớ i ELISA . Kế t quả bướ c đầ u cho thấ y đố i vớ i cá c mẫ u huyế t thanh âm tính
ELISA thì đồ ng thờ i cho kế t quả âm tính đi vi phn ng trung ha . Cn cc mẫu dương tính
ELISA cao cũ ng cho hiệ u giá đố i vớ i VNT.
Chúng tôi cũng đã sử dụ ng cá c mẫ u huyt thanh trên đố i vớ i 2 chng vi rút Châu Âu v Bc
M, nhưng kế t quả đề u âm tính đố i vớ i tấ t cả cá c mẫ u dương tính ELISA.





27/6
Bảng 2: Kế t quả thự c hiệ n phả n ứ ng VNT đố i vớ i mầ u huyế t thanh từ thự c địa

TT
Ký hiệu
mẫu
Gia súc
Tuổi
Kết quả
ELISA S/P
Kết quả VNT
(log2, chủng
VN)
Kết quả VNT
(log2, chủng
EU)
Kết quả VNT
(log2, chủngNA)
1
243

Lợn
5 tháng
3.96
8.00
0.00
0.00
2
257
Lợn
4 tháng
3.86
3.00
0.00
0.00
3
248
Lợn
4 tháng
3.78
7.00
0.00
1.00
4
246
Lợn
5 tháng
3.70
7.00
0.00
0.00

5
273
Lợn
5 tháng
3.67
7.00
0.00
0.00
6
269
Lợn
5 tháng
2.99
7.00
2.00
0.00
7
252
Lợn
4 tháng
2.97
6.00
0.00
0.00
8
253
Lợn
4 tháng
2.94
5.00

0.00
0.00
9
275
Lợn
5 tháng
2.92
6.00
1.00
0.00
10
256
Lợn
4 tháng
2.80
6.00
0.00
0.00
11
278
Lợn
4 tháng
2.35
4.00
2.00
1.00
12
259
Lợn
4 tháng

2.28
4.00
0.00
0.00
13
7
Lợn ni
36 thng
2.15
4.00
0.00
0.00
14
5
Lợn
4.5 tháng
1.99
5.00
0.00
0.00
15
242
Lợn
5 tháng
1.97
2.00
0.00
0.00
16
245

Lợn
4 tháng
1.33
6.00
0.00
0.00
17
260
Lợn
4 tháng
0.97
3.00
0.00
0.00
18
261
Lợn
4 tháng
0.65
5.00
1.00
1.00
19
224
Lợn
3.5 tháng
0.50
3.00
0.00
0.00

20
222
Lợn
3.5 tháng
0.45
3.00
0.00
0.00
21
211
Lợn
5 tháng
0.00
1.00
0.00
0.00
22
212
Lợn
5 tháng
0.02
1.00
0.00
0.00
23
214
Lợn
5 tháng
0.01
1.00

0.00
0.00
24
215
Lợn
5 tháng
0.03
1.00
0.00
0.00
25
216
Lợn
5 tháng
0.04
1.00
0.00
0.00
Trong nghiên cứ u nà y để so sá nh kế t quả củ a 2 phương phá p chú ng tôi sử dụ ng công thứ c
tính hệ s tương quan:
  
   
 
yx
n
i
n
i
n
i

ii
n
i
n
i
i
n
i
i
ssn
yx
n
yx
yyxx
yyxx
r
1
1
1
11
1 1
2
1
2
1
1



















 
 


 


Bảng 3: Hệ số tương quan giữ a kế t quả ELISA và kế t quả phả n ứ ng trung hò a
Chủng virut
Hệ số tƣơng quan
Chng thực đa
0.883102
Chng Bc M
0.276098
Chng Châu Âu
0.143956

28/6
Qua bả ng trên cho thấ y có sự tương quan giữ a kế t quả ELISA vớ i kế t quả VNT củ a chủ ng
thự c địa, v không c sự tương quan giữa kt qu ELISA vi kt qu VNT củ a cá c chủ ng Châu
Âu và Bắ c Mỹ .
3.7. Kế t quả thự c hiệ n phương phá p IPMA đố i vớ i mẫ u huyế t thanh thự c địa
Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi cũ ng đồ ng thờ i thự c hiệ n phả n ứ ng IPMA đố i vớ i cá c mẫ u
huyế t thanh từ thự c đị a. Phn ng IPMA c độ nhạy v độ đặc hiệu cao , phương phá p nà y
thườ ng chỉ đượ c sử dụ ng trong cá c phò ng thí nghiệ m có điề u kiệ n nuôi cấ y tế bà o và gây nhiễ m
virut.
Bảng 4: Kt quả thực hin phản ứng IPMA đi vi mu huyế t thanh thự c địa
TT
Ký hiệu
mẫu
Gia súc
Tuổi
Kết quả
ELISA S/P
ratio
Kết quả
IPMA
(chủng
VN)
Kết quả
IPMA
(chủng
EU)
Kết quả IPMA
(chủng NA)
1
243

Lợn
5 tháng
3.96
4.00
3.00
3.00
2
257
Lợn
4 tháng
3.86
4.00
3.00
2.00
3
248
Lợn
4 tháng
3.78
4.00
3.00
3.00
4
246
Lợn
5 tháng
3.70
4.00
3.00
3.00

5
273
Lợn
5 tháng
3.67
4.00
3.00
3.00
6
269
Lợn
5 tháng
2.99
4.00
3.00
4.00
7
252
Lợn
4 tháng
2.97
4.00
3.00
3.00
10
256
Lợn
4 tháng
2.80
3.00

3.00
2.00
12
259
Lợn
4 tháng
2.28
3.00
2.00
2.00
14
5
Lợn
4.5 tháng
1.99
4.00
2.00
3.00
15
242
Lợn
5 tháng
1.97
3.00
2.00
2.00
21
211
Lợn
5 tháng

0.00
0.00
0.00
0.00
22
212
Lợn
5 tháng
0.02
0.00
0.00
0.00
23
214
Lợn
5 tháng
0.01
0.00
0.00
0.00
24
215
Lợn
5 tháng
0.03
0.00
0.00
0.00
25
216

Lợn
5 tháng
0.04
0.00
0.00
0.00
Kế t quả bướ c đầ u cho thấ y khi thự c hiệ n đố i vớ i cả 3 chng virut đều cho kt qu âm tính
v dương tính r.
Bảng 5: Hệ số tương quan giữ a kế t quả ELISA và kế t quả phả n ứ ng IPMA
Chủng virut
Hệ số tương quan
Chng thực đa
0.951706
Chng Bc M
0.894025
Chng Châu Âu
0.977332
Qua bả ng kế t quả về hệ số tương quan cho thấ y kế t quả thự c hiệ n phả n ứ ng IPMA trên cả 3
chng đều c tương quan đi vi kt qu ca phn ng ELISA.
Bảng 6: Hệ số tương quan giữ a kế t quả trung hò a và kế t quả phả n ứ ng IPMA
Chủng virut
Chủng thc đa
Chủng Bc M
Chủng Châu Âu
Chng thực đa
0.866012
0.210092
0.210092
Chng Bc M
0.210092

0.213021
0.402374
Chng Châu Âu
0.210092
0.402374
0.220564
Chỉ c sự tương quan giữa kt qu ca phn ng trung ha v IPMA ca chng virut thự c
địa. Cn kt qu ca cc chng khc không c sự tương quan.
29/6

IV. Kết luận:
Trong nghiên cứ u nà y chú ng tôi có nhữ ng kế t luậ n như sau:
- Phn ng trung ha t bo đi vi vi rút PRRS đã được thit lập tại bộ môn Ha sinh -
Miễ n dị ch - Bệ nh lý , Việ n thú y.
- Phương phá p đượ c thiế t lậ p gồ m cá c công đoạ n : (a)Chuẩ n bị tế bà o ; (b)Chuẩ n bị vi rú t ;
(c)Trung hò a huyế t thanh; (d)Đọ c kế t quả phả n ứ ng
- Bướ c đầ u á p dụ ng phương phá p trung hò a đố i vớ i mẫ u thự c địa và có sự so sá nh kế t quả
vớ i 2 phương phá p ELISA và IPMA.
- Kế t quả trung hò a củ a cá c mẫ u huyế t thanh củ a gia sú c bị bệ nh từ thự c địa đề u âm tính đố i
vớ i cá c chủ ng Châu Âu và Bắ c Mỹ .
- Đi vi chng vi rút Châu Âu v Bc M kt qu ca phn ng ELISA không tương đng
vớ i kế t quả củ a phả n ứ ng trung hò a vi rú t.

TÀI LIỆU THAM KHO:
1. Brian WJ Mahy and Hillar O Kangro (1996) Virology methods manual, Chapter 6- P108;
P195-199
2. Enuh Rahario JUSA, yuji INABA, Michihiro KOUNO, Omasu HIRUE, Hisao YASUHARA
(2005), Slow reacting and complement requiring neutralizing antibody in swine infected with
PRRS virut - Journal of General Virology 86, P1943–1951
3. E. Albina (1998) Immune responses in pigs infected with PRRS- Veterinary Immunology and

Immuno-pathology P49-66
4. I. Dı´az,1,2 L. Darwich,1,2 G. Pappaterra,3 J. Pujols1,3 and E. Mateu1,2 Immune responses of
pigs after experimental infection with a European strain of Porcine reproductive and
respiratory syndrome virus, Journal of General Virology (2005), 86, P1943–1951
5. Gonnie Nodelijk (1996) comparison of commercila ELISA and immune peroxidase
monolayer assay to detect antibodies directed against PRRS, Veterinary Microbiology P285-
295
6. MichaelO’Connor_Irish (2002), Detection of antibody to PRRS virus by ELISA and IPMA,
Veterinary Journal, P73 -75
7. Nettebotner (1997), Diagnosis of PRRS, Veterinary Microbiology, P295-301.
8. OIE Terrestrial Manual (2008) Porcine reproductive and respiratory syndrome Manual of
Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, P1116-1127.
9. J.Plana-Duran (1997) Efficacy of inactivated vaccine for prevention of reproductive failure
induced by PRRS, Veterinary Microbiology, P361-370
10. R.W.Wills (1997), PRRS a persistent infection.pdf, Veterinary Microbiology P231-240
11. Zygmunt Pejsak (1997) Clinical signs and economic losses caused by porcine reproductive
and resiratory syndrome virus in a large breeding farm, Veterinary Microbiology P317-322