Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 12: 1581-1590

Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(12): 1581-1590
www.vnua.edu.vn

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG PROBIOTIC TỪ GỪNG
Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy*
Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*

Tác giả liên hệ:

Ngày nhận bài: 28.09.2022

Ngày chấp nhận đăng: 20.12.2022
TĨM TẮT

Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất thực phẩm lên men. Mục đích của nghiên cứu là phân lập và
tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng. Kết quả
phân lập trên môi trường MRS được 46 chủng vi khuẩn với kích thước 1-1,5mm, khuẩn lạc trịn, bóng, màu trắng đục
hoặc trắng sữa, mơ nổi. Sáu chủng được sơ tuyển dựa trên đặc điểm Gram dương, catalase âm và đặc điểm hình thái
tế bào hình que hoặc hình cầu. Định danh bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF xác định được các chủng trên
thuộc 4 loài Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Lactobacillus fermentum và Lactobacillus plantarum.
Thử nghiệm hoạt tính probiotic, tuyển chọn được chủng L. plantarum SM1.3 có khả chịu được pH 1,0-3,0, chịu muối
mật 0,3% tốt, có khả năng sinh enzyme amylase, protease, cellulase và kháng hai chủng vi sinh vật kiểm định E. coli và
Salmonella sp. Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng SM1.2 thuộc loài Limosilactobacillus fermentum và chủng
SM1.3 thuộc loài Lactiplantibacillus plantarum. Bước đầu sử dụng chủng vi khuẩn L. plantarum SM 1.3 cho sản xuất đồ
uống probiotic từ gừng thu được sản phẩm có chất lượng cảm quan xếp loại tốt, mật độ vi khuẩn L. plantarum SM1.3
đạt yêu cầu đối với sản phẩm lên men sau 5 ngày bảo quản ở điều kiện 4C.
Từ khoá: Củ gừng, đồ uống probiotic, vi khuẩn lactic, L. plantarum SM1.3.

Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria
for Probiotic Beverage Production from Ginger
ABSTRACT
Lactic acid bacteria play an important role in the production of fermented foods. This study aimed to isolate and
select lactic acid bacteria strains from fermented products for application in the production of ginger-based probiotic
drinks. Fourty six strains of bacteria were isolated. The isolates produced colonies with 1.0 to 1.5mm in diameter,
mainly round, glossy, milky white, and floating pellicle in liquid culture. Six gram-positive, catalase-negative strains
with rod or spherical shaped cells were pre-selected. Identification by MALDI-TOF revealed that they belong to 4
species of Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum.
Further study was conducted for the strain L. plantarum SM1.3. It was tolerant to acid (pH 1.0-3.0) and 0.3% bile
salts, and able to produce amylase, protease, and cellulase. This strain inhibited two tested bacteria, E. coli and
Salmonella sp. Gene alignment results indicated that the strain SM1.2 belonged to Limosilactobacillus fermentum
species and strain SM1.3 named Lactiplantibacillus plantarum. Ginger-based probiotic drink using L. plantarum
SM1.3 has good sensory quality and bacterial density and can be stored up to 5 days at 4C.
Keywords: Ginger, probiotic drink, lactic acid bacteria, L. plantarum SM1.3.

1. T VN
Gng (Zingiber officinale Rosc) ỵc trồng
và sā dýng phổ biến täi Việt Nam. Trong thăc
phèm, cỷ gng ỵc s dýng nhỵ mt loọi gia v

do cò mùi thĄm, vð cay (Mahomoodally & cs.,
2019). Trong y học, cû gÿng có tác dýng kháng
khuèn, chống ký sinh trựng, chng oxy húa,
chng viờm, giõm au, chng ung thỵ, bâo vệ
gan, hỗ trĉ tiêu hóa, kích thích miễn dðch (Bag,

1581

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

2018). Thành phæn dinh dỵng chớnh cỷa cỷ
gng bao gm carbohydrat, lipid, nỵc, chỗt x,
protein v khoỏng chỗt. Ngoi ra, trong gng
cũn cha nhiu hp chỗt phenol khỏc nhau bao
gm gingerols, paradols, shogoals v zingerones
(Srinivasan, 2017). Ngoi s dýng gng tỵi,
khụ, gng củn ỵc ch bin thnh cỏc sõn
phốm tin dýng khỏc nhỵ sauce, paste, các sân
phèm đồ uống lên men.
Quá trình lên men lactic ỵc thc hin bi
vi khuốn lactic, cú th bći vi khuèn lên men tă
nhiên hoặc chûng vi khuèn lactic thuổn.
Phỵng phỏp lờn men bi chỷng thuổn thỵng
ỵc ỏp dýng trong công nghệ thăc phèm nhą
khâ nëng lên men nhanh, kiểm soát tốt.
Sân phèm lên men truyền thống cûa Việt
Nam chû yếu dăa trên hệ vi sinh vêt tă nhiờn.
Vi khuốn lactic nhỵ L. plantarum, Pediococcus
pentosaceus, L. fermentum, Lactobacillus
pentosus, Lactobacillus brevis ó ỵc tỡm thỗy
trong nhiu loọi sõn phốm lờn men nhỵ nem
chua, dỵa mui, c mui, tụm chua (Cao & cs.,
2013; Nguyen, 2015; Rhee & cs., 2011).
Probiotic là nhng vi sinh vờt cũn sng khi
ỵa vo c th mt lỵng ổy ỷ s cú li cho
sc khúe cỷa vêt chû. Chúng đòng một vai trò
quan trọng trong việc bâo vệ vêt chû chống läi

các vi sinh vêt có họi ng thi giỳp tởng cỵng
h thng min dch. Sõn phèm chĀa probiotic
chû yếu là thuộc nhóm vi khuèn lactic.
Mýc tiêu cûa nghiên cĀu là phân lêp, tuyển
chọn các chûng vi khuèn lactic có tiềm nëng
probiotic cao tÿ các nguồn thăc phèm lên men
tă nhiên có chĀa gÿng và thā nghim sõn xuỗt
ung lờn men, gúp phổn a dọng húa sõn
phốm, tờn dýng ỵc ngun nguyờn liu di do
v nồng cao ỵc giỏ tr cho cỷ gng.

2. PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. Vt liu
Gng mui nguyờn cỷ, nỵc ộp gng muối
lên men và sung muối tă làm và thu mua tọi cỏc
ch tọi Gia Lõm, H Ni ỵc s dýng làm
nguồn phân lêp vi sinh vêt. Chûng vi khuèn
kiểm đðnh ỵc s dýng trong nghiờn cu bao
gm Salmonella sp., Escherichia coli cung cỗp

1582

bi B mụn Vi sinh vờt, Khoa Ti nguyờn v Mụi
trỵng, Hc vin Nụng nghip Vit Nam. Mụi
trỵng MRS ỵc dựng nuụi cỗy v phõn lờp
vi khuốn lactic vĆi thành phæn (g/l) là
glucose (20), pepton (10), cao tht (10), cao nỗm
men (5), CaCO3 (5), Tween (1), Diamoniumcitrat
(2), MgSO4. 7H2O (0,58), MnSO2.4H2O (0,28),
K2HPO4 (2), thọch (15), nỵc cỗt. Bờn cọnh ũ,

mụi trỵng PCA ỵc dựng xỏc nh vi sinh
vêt hiếu khí tổng số có thành phỉn (g/l) gm
pepton t casein (5), cao nỗm men (2,5), glucose
dọng khan (1,0), agar 15-20, nỵc cỗt.
Gng trõu (Zingiber officinale Rosc.) ỵc
thu hộch täi huyện Hà Qng, Cao Bìng làm
ngun liệu cho sân phèm đồ uống lên men
lactic tÿ gÿng. Gÿng nguyên liệu sā dýng cho
lên men là loäi gÿng non thu hoọch sau khi
trng t 6-7 thỏng, ó ỵc gt vú, lm sọch v
cỗp ụng, cung cỗp bi Cụng Ty TNHH Phỏt
trin Nụng nghip v Tỵ vỗn Mụi trỵng (Dace).
2.2. Phng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ
các mẫu thực phẩm chứa gừng
Dðch méu lên men (ml) ỵc b sung trong
nỵc cỗt vụ trựng theo tợ l 10:90 và pha loãng
theo dãy tĆi hän. Dung dðch đã pha loóng
(0,1ml) ỵc nhú vo ùa thọch cha mụi trỵng
MRS và trang đều bề mặt đến khi khô. Nhiệt độ
nuôi cỗy gi 37C trong 24-48 gi. Vi khuốn
ỵc cỗy chuyn tip nhiu lổn cho n khi thu
ỵc mi ùa petri l dủng khuốn lọc ng
nhỗt (Bựi Xuồn ng, 2018).
2.2.2. Xác định các đặc điểm hình thái, sinh
lý và sinh húa
Khuốn lọc vi khuốn ỵc quan sỏt bỡng
mớt thỵng v t bo vi khuốn ỵc xỏc nh
bỡng cỏch quan sỏt dỵi kớnh hin vi vờt kớnh
100X. c im sinh lý và sinh hóa bìng nhuộm

Gram, thā nghiệm catalase.
2.2.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt
tính probiotic
Khâ nëng chðu axit dọ dy ỵc thc hin
theo nghiờn cu cỷa Nguyn Th Hồng Nhung &
cs. (2019). Cý thể, bổ sung dðch giống vi khuèn


Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy

đã nuụi cỗy qua 24 gi vo mụi trỵng MRS lúng
cú pH khác nhau (1, 2, 3), nuôi vi khuèn ć 30C
trong 3 gią và đo các giá trð OD täi thi im
0 gi v 3 gi bỵc súng 620nm.
Khõ nởng chu mui mờt ỵc thc hin
bỡng cỏch chuốn b cỏc ng nghim cha mụi
trỵng MRS b sung 0,3% mui mờt, nhú 10%
dch ging vi khuốn ó nuụi cỗy dch thể qua 24
gią vào các ống nghiệm trên, sau đò mang nuụi
30C. Mờt t bo trong mộu ỵc xỏc nh
bỡng cỏch xỏc nh mờt quang bỵc súng
620nm. Mc chu mui mờt ỵc xỏc nh
bỡng thi gian để tëng OD620nm sau khi nuôi 4
gią so vĆi ban đỉu (Gilliland & Walker, 1990).
Khâ nëng sinh enzyme ngội bo ỵc
thc hin bỡng phỵng phỏp ýc l thọch trờn
mụi trỵng cú b sung c chỗt tinh bt, casein
v CMC Nguyn Lồn Dỹng & cs. (1976).
Chỷng vi khuốn lactic ỵc hoọt húa trong mụi
trỵng MRS lúng. Sau 48 gi nuụi 37C, dch

nuụi vi khuốn lactic ỵc ly tõm vi tốc độ
6.000 vòng/phút trong 30 phút ć 4C, thu dðch
ly tõm. Dựng nỳt khoan cũ ỵng kớnh 5mm,
ýc l thọch trờn ùa petri cỷa mụi trỵng cú
cha 1% c chỗt tinh bột, casein hoặc CMC. VĆi
mỗi chûng vi khuèn lactic tiến hành nhó 0,1 ml
dðch ly tåm đã thu vào lỗ thäch và đặt đïa thäch
trong tû länh ć 4C không 2 gią nhìm để dðch
ly tâm khuếch tán đều vo trong thọch v tip
týc ỵc ỷ 37C trong 48 gi lỵng dch
trong l thọch thỷy phồn c chỗt. Hoọt tớnh cỷa
enzyme ỵc o bỡng ỵng kớnh vũng phõn
giõi c chỗt xung quanh l thọch, tc D d.
Trong ũ: D l ỵng kớnh vũng phõn giõi (mm),
d l ỵng kớnh l thọch (5mm).
Khõ nởng i khỏng vi vi khuốn gõy bnh
kim nh ỵc thc hin bỡng phỵng pháp
khuếch tán thäch cûa Herreros & cs. (2005).
Chûng nghiên cĀu ỵc nuụi trong mụi trỵng

MRS lúng 30C, t 18-20 gi, dch ni thu
ỵc nh ly tõm v chợnh pH v trung tớnh
(6,7-6,8). Chỷng kim nh ỵc nuụi qua ờm
trong mụi trỵng LB (Luria - Bertani) lúng
30C Nhú 30l dch vi khuốn gõy bnh mờt
108 CFU/ml (tỵng ng vi McFarland 0,5)
(CLSI, 2012) lờn ùa thọch ri cỗy chang v
khoan l thọch. Nhú dch ly tồm ỵc chợnh pH
vo các lỗ thäch và giĂ ć nhiệt độ 4C/4 gią, sau
đò û ć 30C/24 gią. Cën cĀ vào vòng Āc chế vi

sinh vêt kiểm đðnh để xác đðnh chûng có khâ
nëng kháng vi sinh vêt (Schillinger & Lucke,
1989). Hột tính khỏng khuốn cỷa cỏc vi sinh
vờt tuyn chn ỵc tớnh bỡng ỵng kớnh vũng
khỏng khuốn D: D = D d (mm), trong ũ: D
l ỵng kớnh vũng khỏng khuốn (mm); d l
ỵng kớnh l thọch (mm).
2.2.4. nh danh chng vi khuẩn lactic
bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF
và xác định trình tự gen 16S rRNA
a. Định danh chủng vi khuẩn lactic bằng phương
pháp khối phổ MALDI-TOF (Matrix assisted
laser desorption ionization - time of flight)
Phỵng phỏp nh danh vi khuốn s dýng
h thng MALDI Biotyper - Bruker. Khuốn lọc
ỵc pht lờn ùa target, tọo lp pht múng v
ng nhỗt, ri lm khơ ć nhiệt độ phịng. Dung
dðch HCCA matrix (-Cyano-4-hydroxycinnamic
acid) (1ml) ỵc t lờn trờn mộu, khụ nhit
phũng rồi sā dýng hệ thống MALDI Biotyper
- Bruker để đo.
Phân tích phân tā ion hóa nhą matrix và tia
lazer, sau ũ o thi gian bay da trờn khi
lỵng. nh danh vi sinh vờt bỡng dỗu ỗn phõn
t, so sỏnh s tỵng ng cỷa ph protein t
mộu vi sinh vờt mýc tiêu vĆi cĄ sć dĂ liệu các
chûng vi sinh vêt khác nhau (Doan & cs., 2012).

Bảng 1. Độ tin cậy của kết quả định danh theo phương pháp khối phổ MALDI-TOF
Khoảng

Diễn giải

2.000-3.000

Xác định ở độ tin cậy cao

1.700-1.999
0.000-1.699

Ký hiệu

Màu sắc

(+++)

Xanh

Xác định ở mức độ tin cậy thấp

(+)

Vàng

Không xác định được vi sinh vật

(-)

Đỏ

1583


Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

Báo cáo bao gm danh sỏch cỏc loi phự hp
nhỗt ỵc phõn loọi theo tỵng ng cỷa dỗu
võn protein, kốm theo giỏ trð cho biết mĀc độ
xác đðnh loài hoặc chi vi sinh vờt. Mc tin
cờy cỷa kt quõ ỵc trỡnh bày ć bâng 1.
b. Định danh phương pháp xác định trình tự
gen 16S rRNA
Các gen 16S rRNA cûa các chûng vi khuốn
lactic ỵc khuch ọi bỡng cỏch s dýng cp
mi phổ quát 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCT
CAG-3’ và 1492R 5’-GGCTACCTTGTTACGAC
TT-3’ (Barman & cs., 2018). Sõn phốm PCR
ỵc tinh sọch bỡng b dýng cý lm sọch PCR
GenElute (Sigma, Hoa K) v ỵc giõi trỡnh t
theo cõ hỵng thuờn v nghch. Cỏc trỡnh t sau
ũ ỵc x lý v so sỏnh s dýng cụng cý tìm
kiếm BLASTn tÿ cĄ sć dĂ liệu GenBank theo
mơ tâ cûa Chen & cs. (2008).
2.2.4. Thử nghiệm sân xuất đồ ung
probiotic t gng
Chỷng vi khuốn lactic ó tuyn chn ỵc
nhõn ging qua hai cỗp. giai oọn nhõn ging
cỗp 1, vi khuốn lactic ỵc nhõn ging trong 10ml
mụi trỵng MRS trong thąi gian 24 gią ć 37C. Ở
giai đoän nhân ging cỗp 2, 10ml dch nhõn

ging cỗp 1 vo 100ml mụi trỵng MRS, nuụi
37C trong 24 gi. Trỵc khi b sung vi khuốn vo
sõn phốm, dch ging ỵc ly tõm lọnh 4C vi
6.000 vũng trong 10 phỳt. Phổn dch bờn trờn
ỵc gọn thu phổn cn vi khuốn phớa dỵi.
Gng nguyờn liu ỵc ộp thu dch.
Thụng s k thuờt chuốn b dch trỵc khi lờn
men l: tợ l dch ộp gng - nỵc l 1/20, tợ l
mui l 0,7%, ỵng l 2,8%. Hn hp dch ỵc
thanh trựng 80C/5 phỳt v lm ngui nhanh
xung 30C. Vi khuốn ó nuụi cỗy ỵc tip

ging l 2% (ọt ỵc mờt vi khuốn ỵa lờn
men l 105 CFU/ml, đêy níp và tiến hành lên
men ć 30C cho tĆi khi pH ọt 4,2 0,2, cỏc tớnh
chỗt cõm quan ọt t khỏ tr lờn.
Sõn phốm ỵc xỏc nh mt số chỵ tiêu vi
sinh vêt và đánh giá câm quan theo TCVN
3215-79. Phỵng phỏp ỏnh giỏ cõm quan cho
im chỗt lỵng tng hp v cỏc tiờu chớ mu
sớc, mựi, v, trọng thỏi. Cỏc chợ tiờu ỵc ỏnh
giỏ theo thang im t 0-5 ỏnh giỏ chỗt
lỵng sõn phốm (H Duyờn Tỵ, 2010).
2.3. X lý s liu
Cỏc s liu thu thờp ỵc x lý thng kờ
bỡng phổn mm Minitab 16 v Excel 2013. Kt
quõ ỵc phõn tớch bỡng phỵng phỏp ANOVA
mt chiu. S khỏc bit cỷa giỏ tr trung bỡnh
ỵc ỏnh giá nhą phép so sánh Tukey vĆi mĀc
tin cêy 95%.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng vi khuẩn lactic
Tng s 46 khuốn lọc ó ỵc phõn lờp trờn
mụi trỵng MRS t cỏc mộu gng mui v mộu
sung mui. Các khn läc có däng hình trịn,
bóng, lồi, màu síc khuốn lọc trớng ýc, hoc
trớng sa. Kớch thỵc khuốn lọc tỵng i nhú
thỵng dao ng 1,0-1,5mm.
Chỷng vi khuốn mang c im sinh húa
(Gram dỵng v catalase ồm) v c im hỡnh
thỏi t bo (hỡnh que hoc hỡnh cổu) ỵc la
chn do cị đặc điểm cûa vi khn lactic theo mơ
tâ cûa Salminen & cs. (2004). Đặc điểm hình
thái tế bào v c im sinh húa cỷa 6 chỷng
la chn ỵc trình bày trong bâng 2.

Bảng 2. Đặc điểm hình thái và sinh lý,
sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập được

1584

Kí hiệu chủng

Hình thái tế bào

Gram

Catalase

GM2.10

Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-

GM2.11

Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-

GM2.17

Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-

SM1.2

Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-

SM1.3

Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-

SM1.5

Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn

+

-


Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy

Bảng 3. Kết quả định danh bằng hệ thống khối phổ MALDI - TOF
Kí hiệu chủng

Lồi được phát hiện

Điểm

GM2.10

Enterococcus faecium

2,27

Cao

GM2.11

Enterococcus faecium

2,28

Cao

GM2.17

Enterocuccus casseliflavus

2,21

Cao

SM1.2

Lactobacillus fermentum

1,75

Thấp

SM1.3

Lactobacillus plantarum

2,05

Cao

SM1.5

Lactobacillus plantarum

2,04

Cao

Chûng vi khuèn GM2.10, GM2.11 và
GM2.17 có hình thái tế bào hình cỉu, đĀng
riêng rẽ hoặc thành chuỗi ngín. Chûng SM1.2,
SM1.3 và SM1.5 tế bào däng hình que (trăc
khuèn), đĀng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi do
đang trong q trình phân cít tế bào. Kết q
đðnh danh bìng khối phổ MALDI-TOF cho 6
chûng vi khuèn lăa chọn ỵc trỡnh by trong
bõng 3.
Kt quõ khi so sỏnh khi ph cho thỗy hai
vi khuốn GM2.11 (GM2.10) v GM2.17 ỵc xỏc
nh lổn lỵt l Enterococcus faecium v
Enterococcus casseliflavus vi tin cêy cao
(2,28 và 2,71) thuộc chi Enterococcus. Thành

viên cûa chi Enterococcus đĀng thĀ ba sau
Lactobacilli và Streptococcus trong danh sỏch
cỏc nhúm ln nhỗt cỷa LAB. Chỳng cú khõ nởng
chu độ mặn cao, thêm chí 6,5% NaCl, muối mêt
lên đến 40%, vĆi các điều kiện axit khác nhau
và có thể tồn täi trong 30 phút ć 60C (Ogier,
2008). Một số Enterococcus cho thỗy cỏc c
tớnh tim nởng cỷa probiotic v khõ nởng tởng
cỵng sc khúe (Tachibana & cs., 2020). Do ũ
cỏc chỷng vi khuốn Enterococcus ỵc s dýng
nhỵ ch phốm sinh hc v ng dýng cho cỏc
ngnh bao gm dỵc phốm, thuc cha bnh cho
ngỵi v thỳ y, ngnh cụng nghip thc phốm
nhỵ sõn phốm sa hoc thc phốm lờn men,
chỗt b sung thc ởn chởn nuụi.
Chỷng SM1.2 v SM1.3 (SM1.5) lổn lỵt
ỵc xỏc nh l Lactobacillus fermentum v
Lactobacillus plantarum. Cỏc vi khuốn ny
thuc chi Lactobacillus. Chỳng ỵc ng dýng
trong lên men sĂa, thðt và nhiều loäi rau cû
khác (Behera & cs., 2018). VĆi tiềm nëng
probiotic cao, câ 2 loäi vi khuốn ny khụng chợ
ỵc ng dýng trong ngnh cụng nghip thc

tin cy

phốm m củn ỵc ng dýng trong vic ngởn
nga v iu tr vỗn sc khúe khỏc nhau
(Mikelsaar & cs., 2009). VĆi 6 chûng trên, dăa
trên mĀc tỵng ng cỷa chỷng GM2.10,

GM2.11 v chỷng SM1.3, SM1.5, chỷng cũ
tin cờy cao hn s ỵc la chn. 4 chỷng s
ỵc tip týc nghiờn cu l GM2.11, GM2.17,
SM1.2, SM1.3.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có
hoạt tính probiotic
Bốn chỷng vi khuốn ỵc tin hnh khõo
sỏt cỏc c tớnh probiotic bao gồm khâ nëng
chðu axit dä dày, khâ nëng chðu muối mêt, khâ
nëng sinh enzyme ngoäi bào và khâ nởng khỏng
khuốn. Kt quõ ỵc th hin trong cỏc hỡnh 1,
2, 3 v bõng 3, 4.
Hỡnh 1 cho thỗy tỗt cõ cỏc chỷng vi khuốn
u cú khõ nởng chu ỵc nng pH thỗp.
c bit 2 chỷng E. casseliflavus GM2.17 v
L. plantarum SM1.3 cú khõ nởng chu ỵc pH
rỗt thỗp (pH 1). Kt quõ ny tỵng ng vi cỏc
kt quõ nghiờn cu cỷa Chevalier & cs. (2022)
v Hunh Phỵng Trang (2018) cỹng cho thỗy
khõ nởng chu axit dọ dy cỷa E. casseliflavus
và L. plantarum.
Đối vĆi khâ nëng chðu muối mêt, các chûng
vi khuèn này đều có khâ nëng chðu muối mêt ć
nhĂng mĀc độ khác nhau. Trong đò cò 3 chỷng
sau 4 gi cú OD o bỵc súng 620nm trên 0,3
đò là các chûng GM2.17, SM1.2 và SM1.3. Kết
quâ nghiờn cu cỷa Mohamed & cs. (2022) hoc
cỷa Hunh Phỵng Trang (2018) cỹng cho thỗy
khõ nởng chu axit dọ dy cûa E. casseliflavus
GM2.17, L. fementum SM1.2 và L. plantarum

SM1.5. Chûng GM2.11 ∆OD sau 4 gią chỵ đät

1585


Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sn xut ung probiotic t gng

0,105 thỗp hn so vi cỏc chỷng cũn lọi nhỵng
vộn cú khõ nởng phỏt trin trong mụi trỵng cú
nng mui mờt cao.

nởng khỏng lọi cỏc chỷng vi khuốn gõy bnh,
ngỵc lọi l khõ nởng khỏng vi khuốn kim
nh rỗt mọnh n t 2 chûng cûa chi
Lactobacillus. Nghiên cĀu cûa Nguyễn Thð
Hồng Nhung & cs. (2019) vĆi các chûng vi
khuèn Lactobacillus có khâ nởng khỏng cỏc vi
khuốn gõy bnh rỗt tt, cỏc vũng kháng khuèn
dao động tÿ 16-22mm.

Kết quâ trong bâng 4 và hỡnh 2 cho thỗy
khõ nởng sinh enzyme cỷa cỏc chỷng vi khuèn
có să khác nhau. Chûng vi khuèn L. fermentum
SM1.2, SM1.3 và E. casseliflavus GM3.17 có
khâ nëng phån giâi câ ba enzyme mänh. Kết
quâ này phù hĉp vĆi kết quâ nghiên cĀu cûa
Nguyễn Thð Hồng Nhung & cs. (2019) khi
nghiên cĀu phân lêp vi khuèn lactic tÿ các méu
thăc phèm lờn men cỹng thu ỵc kt quõ
ỵng kớnh vũng phõn giõi c chỗt cỷa cellulase

v protease ln hn amylase. Trong khi ũ, vi
khuốn E. faecium chợ phõn giõi ỵc c chỗt
sinh ra enzyme cellulase v protease.

Hai chỷng cú hoọt tớnh probiotic cao SM1.2
v SM1.3 ỵc tip týc nh danh bỡng phỵng
phỏp xỏc nh trỡnh t gen 16S rRNA khợng
nh loài, kiểm tra mĀc độ an toàn cho Āng
dýng trong đồ uống lên men tÿ gÿng, đồng thąi
so sánh să tỵng ng gia hai phỵng phỏp
khi ph v xỏc nh trỡnh t gen.
Phõn ng PCR ó ỵc thc hin s dýng
cặp mồi 27F và 1492R để nhân toàn bộ vùng
gen mó hoỏ tiu phổn 16S rRNA. Kt quõ PCR
ỵc th hiện ć hình 4.

Đối vĆi khâ nëng kháng hai chûng vi sinh
vờt kim nh (Bõng 5, Hỡnh 3), nhờn thỗy rìng
câ 2 chûng thuộc chi Enterococcus khơng có khâ
Khả năng chịu pH dạ dày

0,5

0,3

Khả năng chịu muối mật

0,4

0,2

pH 1
pH 2
pH3

0,4
0,3

∆OD620nm

∆OD620nm

0,2

0,1

0,3
0,2
0,2
0,1

0,1

0,1
0,0
GM2.11

GM2.17

0,0

SM1.2
SM1.3
Kí hiệu chủng

GM2.11

GM2.17

SM1.2
SM1.3
Kí hiệu chủng

Ghi chú: GM2.11 (Enterococcus faecium GM2.11), GM3.17 (Enterococcus casseliflavus GM3.17),
SM1.2 (Lactobacillus fementum SM1.2), SM1.3 (Lactobacillus plantarum SM1.3).

Hình 1. Khả năng chịu pH dạ dày và muối mật của bốn chủng vi khuẩn
Bảng 4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của bốn chủng vi khuẩn
Kí hiệu chủng

Đường kính vòng phân giải cơ chất D – d (mm)
Amylase

Protease
d

Celllulase

GM2.11

0

3,3 ± 0,6

4,4b ± 0,4

GM2.17

5,5b ± 0,1

5, 5a ± 0,5

2,5d ± 0,5

SM1.2

7,2a ± 0,3

5,0c ± 0,0

5,0a ± 0,5

SM1.3

5,2c ± 0,3

5,3b ± 0,6

3,5c ± 0,5

Ghi chú: Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau là có ý nghĩa
ở mức  = 0,05.

1586


Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy

Amylase

Protease

Celllulase

Ghi chú: GM2.11 (Enterococcus faecium GM2.11), GM3.17 (Enterococcus casseliflavus GM3.17), SM1.2
(Lactobacillus fementum SM1.2), SM1.3 (Lactobacillus plantarum SM1.3).

Hình 2. Hình ảnh vịng phân giải enzyme của bốn chủng vi khuẩn
Bảng 5. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm đinh
Kí hiệu chủng

Đường kính vịng kháng khuẩn ∆D (mm)
E. coli

Salmonella sp.

GM2.11

c

0

0c

GM2.17

0c

0c

b

SM1.2

12,50 ± 0,50

14,57b ± 0,29

SM1.3

16,00a ± 0,00

17,33a ± 0,29

Ghi chú: Trong cùng một cột các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác
nhau là có ý nghĩa ở mức  = 0,05..

Hình 3. Hình ảnh vịng kháng khuẩn của hai chủng vi khuẩn SM1.2 và SM1.3
Sau khi giâi mã gen, trình tă thu ỵc t
vựng gen mó hoỏ 16S rRNA cũ kớch thỵc 1500bp

có tín hiệu rõ, sau khi so sánh trên ngân hng
gen s dýng BLAST, kt quõ cho thỗy chỷng
SM1.2 thuc loi Limosilactobacillus fermentum
(
tỵng
ng
99,78%
vi
chỷng
Limosilactobacillus fermentum SCB0035) v
chỷng SM1.3 thuc loi Lactiplantibacillus
plantarum ( tỵng ng 100% vi cỏc chỷng
Lactiplantibacillus
plantarum
KUMS-C39,

LpYC41,
HBUAS51526,
HBUAS51458,
HBUAS51444). Limosilactobacillus fermentum
v Lactiplantibacillus plantarum là các tên latin
cêp nhêt cûa Lactobacillus fermentum và
Lactobacillus plantarum. Nhỵ vờy, kt quõ cỷa
hai phỵng phỏp nh danh bìng khối phổ
MALDI-TOF và giâi trình tă gen cị độ chính xác
cao. Kết quâ này cüng phù hĉp vĆi kết luên cûa
Doan & cs. (2012), khi sā dýng MALDI‐TOF MS
để phân loäi và xác đðnh nhanh vi khuèn lactic.

1587

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

ĐC

SM1.2

SM1.3

∼1.500bp

Ghi chú: Giếng số 1: Đối chứng dương 1500bp, Giếng số 2: Sân phẩm PCR của
chủng SM1.2, Giếng số 3: Sân phẩm PCR của chủng SM1.3.

Hình 4. Phổ điện di sản phẩm PCR khuch i on gen 16S rRNA
ca chng SM1.2 v SM1.3
Rỗt nhiều nghiên cĀu đã cơng bố nhiều
chûng L. plantarum cị c tớnh probiotic cao. Hn
na, L. plantarum ỵc cụng nhờn l vi khuốn an
ton cho sc khúe con ngỵi, ỵc Āng dýng nhiều
trong thăc phèm (Da Silva Sabo & cs., 2014). Nhỵ
vờy, chỷng vi khuốn L. plantarum SM1.3 s ỵc
chn là vi khn chính cho q trình lên men đồ
uống lactic tÿ gÿng.
3.3. Thử nghiệm sản xuất đồ uống
probiotic từ gng s dng chng vi khun
L. plantarum
Dch nỵc gng ó b sung nỵc ỵng,
mui nhỵ ó mụ tõ trong phổn 2.2.5, tiếp giống

2% vĆi chûng L. plantarum SM1.3. Sau khi lờn
men 30C trong 48 gi, sõn phốm ỵc bõo
quõn nhit 4C v ỵc phõn tớch chợ tiờu v
pH, acid tng s, chỗt lỵng vi sinh v ỏnh giỏ
chỗt lỵng cõm quan trong cỏc khoõng thi gian
t 3 ngy trć đi, cách 2 ngày phån tích một lỉn.
Kết q ỵc trỡnh by trong bõng 6.
T kt quõ trờn bõng 6, giá trð pH và axit
tổng số cûa sân phèm có să thay đổi tÿ ngày sau
khi kết thúc lên men đến ngày thĀ 3 bâo quân.
Mặc dù điều kiện nhit thỗp nhỵng hoọt
ng lờn men vộn din ra. Tÿ ngày 3 đến ngày 7

1588

bâo quân pH cûa sân phốm giõm nhỵng tc
chờm v u v nng acid tởng nh. Xột v
chỗt lỵng cõm quan nhờn thỗy rỡng cõ hai sõn
phốm vộn gi ỵc chỗt lỵng cõm quan tt n
ngy bõo quõn th 5, chỗt lỵng sõn phèm đät
loäi khá. Ngày thĀ 7 bâo quân, sân phèm bít
đỉu có nhĂng biến đổi về màu síc (sém màu
hĄn), phỉn líng cặn nhiều và sêm màu hĄn, mùi
chua hĄn, khụng õm bõo yờu cổu chỗt lỵng.
Nhỵ vờy, sõn phốm đến ngày thĀ 5 vén đät yêu
cæu về pH và giá trð câm quan.
Mêt độ chûng vi khuèn L. plantarum SM1.3
ọt yờu cổu n trỵc ngy th 7, bớt ổu tÿ
ngày bâo quân thĀ 7, mêt độ vi khuèn bít đỉu
giâm và khơng đät theo giĆi hän tiêu chn.

Điều này có thể giâi thích mặc dù vi khn
lactic có thể lờn men ỵc trờn cỏc c chỗt cú
cha gng, tuy nhiờn lỵng hoọt chỗt sinh hc
trong gng v axit sinh ra cüng một phỉn Āc chế
să hột động cûa chúng so vi cỏc c chỗt lờn
men khỏc. Sõn phốm ung lờn men lactic t
gng nờn s dýng trỵc 7 ngy cú th õm
bõo ỵc chỗt lỵng tt nhỗt cỷa sõn phốm. Vic
xỏc nh cỏc iu kin ti ỵu chỷng SM1.3
phỏt trin tt hn, kộo di ỵc thi gian bõo
quõn cổn ỵc thc hin sõu thờm nhng
nghiờn cĀu tiếp theo.


Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy

Bảng 6. Chất lượng của đồ uống probitic từ gừng trong quá trình bảo quản
Chất lượng cảm quan

Chỉ tiêu vi sinh vật

Thời gian
bảo quản
(ngày)

pH

Axit

Điểm

cảm quan

Xếp loại

Mật độ
L. plantarum SM1.3 (CFU/g)

Giới hạn
tiêu chuẩn

0

4,36

0,54

18,84

Tốt

1,01 × 106

≥ 106

Khá

6

Đạt

6

Đạt

3
5
7

3,52
3,37
3,28

0,72
0,86
0,99

17,60
15,76
7,72

1,12 × 10

Khá

1,62 × 10

Kém

4

4. KẾT LUẬN
Tÿ 46 chûng phân lêp tÿ các méu gÿng và
sung muối, chỷng L. plantarum SM1.3 cú hoọt
tớnh probiotic cao ó ỵc tuyển chọn để sā
dýng cho quá trình lên men đồ uống lactic tÿ
gÿng . Đồ uống probiotic tÿ gÿng thành phốm cú
chỗt lỵng cõm quan ọt loọi tt v ọt yêu cæu
về mêt độ vi khuèn L. plantarum SM1.3 trong 5
ngày bâo quân. Kết quâ cûa nghiên cĀu täo tiền
đề cho việc phát triển các lội đồ uống lên men
nịi chung và đồ uống probiotic tÿ gÿng nói riêng
để đáp ng nhu cổu cỷa ngỵi tiờu dựng.

TI LIU THAM KHO
Bag B.B. (2018). Ginger processing in India (Zingiber
officinale): A review. International Journal of
Current Microbiology and Applied Sciences.
7(04): 1639-1651
Barman S. Ghosh R. & Mandal N.C. (2018).
Production optimization of broad spectrum
bacteriocin of three strains of Lactococcus lactis
isolated from homemade buttermilk. Annals of
Agrarian
Science.
16(3):
286-296.
/>Behera S.S., Ray R.C. & Zdolec N. (2018).
Lactobacillus
plantarum
with

functional
properties: an approach to increase safety and
shelf-life of fermented foods. BioMed Research
International.
Bùi Xuân Đồng (2018). Công nghệ enzyme. Trường
Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
Cao H.L., Son C.K., Ha H.P., Florence H., Binh L.T.,
Mai L.T., Tram N.T.H., Khanh T.T.M. Viet P.T.,
Dominique V. & Yves W. (2013). Tropical
traditional fermented food, a field full of promise.
Examples from the tropical bioresources and
biotechnology programme and other related
French–Vietnamese programmes on fermented

5,0 × 10

Đánh giá
Đạt

Không đạt

food. International journal of food science &
technology. 48(6): 1115-1126.
Chen W., Chen H., Xia Y., Zhao J., Tian F. & Zhang
H. (2008). Production, purification, and
characterization
of
potential
thermostable
galactosidase for milk lactose hydrolysis from

Bacillus stearothermophilus. Journal of Dairy
Science. 91(5): 1751-58.
CLSI (2012). Performance Standards for Antimicrobial
Disk Susceptibility Tests, Approved Standard, 7th
ed., CLSI document M02-A11. Clinical and
Laboratory Standards Institute, 950 West
Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania
19087, USA.
Doan N.T.L., Van Hoorde K., Cnockaert M., De Brandt
E., Aerts M., Le Thanh B. & Vandamme P. (2012).
Validation of MALDI‐TOF MS for rapid
classification and identification of lactic acid
bacteria, with a focus on isolates from traditional
fermented foods in Northern Vietnam. Letters in
applied microbiology. 55(4): 265-273.
Da Silva Sabo S., Vitolo M., González J.M.D. & de
Souza Oliveira R.P. (2014). Overview of
Lactobacillus plantarum as a promising
bacteriocin producer among lactic acid bacteria.
Food Research International. 64: 527-536.
Gilliland S.E. & Walker D.K. (1990). Factors to
consider when selecting a culture of Lactobacillus
acidophilus as a dietary adjunct to produce a
hypercholesterolemic effect in humans. Journal of
Dairy Science. 73(4): 905-909
Herreros M.A., Sandoval H., Gonzalez L., Castro J.M.,
Fresno J.M. & Tornadijo M.E. (2005).
Antimicrobial activity and antibiotic resistance of
lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a
Spanish goats’ milk cheese). Food Microbiol.

22 (5): 455-459.
Huỳnh Phan Phương Trang (2018). Thử nghiệm nước
chanh dây độ cồn thấp bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus plantarum LY-78. Tạp chí khoa học
Cơng nghệ và Thực phẩm. 16(1): 56-66.
Hà Dun Tư (2010). Kỹ thuật phân tích cảm quan
thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.

1589


Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

Mahomoodally M.F., Aumeeruddy M.Z., Rengasamy
K.R.R., Roshan S., Hammad S., Pandohee J., Hu
X. & Zengin G. (2019). Ginger and its active
compounds in cancer therapy: From folk uses to
nano therapeutic applications. Seminars in Cancer
Biology. 69: 140-149.
Mohamed Z., Sylvie C., Marc G.J.F. & Nathalie C.
(2022). Special Issue “Enterococci for Probiotic
Use: Safety and Risk”: Editorial. Microorganisms.
10: 604.
Mikelsaar M. & Zilmer M. (2009). Lactobacillus
fermentum ME-3 - an antimicrobial and
antioxidative probiotic. Microbial Ecology in
Health and Disease. 21(1): 1-27.
Nguyen L.A. (2015). Health-promoting microbes in
traditional Vietnamese fermented foods: A review.
Food Science and Human Wellness. 4(4): 147-161.

/>Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng
Tiến, Đặng Đức Trạch & Phạm Văn Ty (1976).
Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học
(Tập 2). Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Nguyễn Thị Hồng Nhung, Lê Thị Thương, Nguyễn Thị
Thu Hằng & Nguyễn Thị Huyền (2019). Tuyển
chọn các chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng ứng
dụng tạo chế phẩm sinh học probiotic bổ sung vào
thức ăn chăn ni. Tạp chí Khoa học và Công nghệ
Lâm nghiệp. 2: 18-27.
Ogier J.C. & Serror P. (2008). Safety assessment of
dairy microorganisms: The Enterococcus genus.

1590

International Journal of Food Microbiol.
126: 291-301.
Rhee S.J., Lee J.E. & Lee C.H. (2011, December).
Importance of lactic acid bacteria in Asian
fermented foods. In Microbial Cell Factories.
10(1): 1-13. BioMed Central.
Salminen S., Wright A.V. & Ouwehand A. (2004).
Lactic acid bacteria Microbiologycal and
Functional Aspect. Third edition, Revised and
Expanded by Marcel Dekker, In.
Schillinger U. & Lücke F.K. (1989). Antibacterial
activity of Lactobacillus sakei isolated from meat.
Applied and Environmental Microbiology.
55(8): 1901-1906.
Srinivasan K. (2017). Ginger rhizomes (Zingiber

officinale): A spice with multiple health beneficial
potentials. PharmaNutrition. 5: 18-28.
Tachibana L., Telli G.S., de Carla Dias D., Gonỗalves
G.S., Ishikawa C.M., Cavalcante R.B., Natori M.
M., BenHamed S. & Ranzani-Paiva M.J.T. (2020).
Effect of feeding strategy of probiotic
Enterococcus faecium on growth performance,
hematologic, biochemical parameters and nonspecific immune response of Nile tilapia.
Aquaculture Reports. 16: 100277.
Zielinska D. & Kolozyn-Krajewska D. (2018). Foodorigin lactic acid bacteria may exhibit probiotic
properties. Bio Med rRes Int. pp. 1-15.