Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng potx

TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
Realtime PCR
Nguyên tắc và ứng dụng
PCR
PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR
PCR và phát hiện sản phẩm bằng
điện di trên gel agarose
1. Phát hiện điểm cuối
(End-Point Detection)
2. Độ đặc hiệu kém
3. Độ nhạy thấp
4. Độ phân giải kém
4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR
5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm
6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)
REALTIME PCR
→ Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình
nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy
luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt.
Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi
chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR
tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time).
Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau
mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh
quang.
REALTIME PCR
HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR
Kính lọc kích thích
Kính lọc phát sáng
Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen
Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)

1 10 10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
1 10 10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39

Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1
10 10
2
10

3
10
4
10
5
10
6
C.41
C.39
C.36
C.33
C.31
C.29
C.34
Mẫu chưa biết [C]
Standard curve
PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU
Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh
quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm
PCR > tín hiệu nền.
- Ct (Threshold cycle):
là số chu kỳ mà tại đó
tín hiệu huỳnh quang
của sản phẩm khuếch
đại vượt qua ngưỡng.
-
Động học RealtimePCR
Phân tích tiến trình phản
ứng trong mỗi chu kỳ
nhiệt nhờ computer

THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU
REALTIME PCR
REALTIME PCR
Rael time PCR định
lượng số copies trong
giai đoạn tăng lũy thừa
Log view
Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer
MgCl
2
Real-time
PCR MIX
Target DNA (Template)
Real-time PCR mix
Chất phát huỳnh quang
1. Chất nhuộm khi chèn vào sợi
đôi DNA sẽ phát huỳnh quang:
♦
Ethidium bromide
Ethidium bromide
♦
SYBR green 1
SYBR green 1
2. Probe đặc hiệu có gắn chất
phát huỳnh quang
♦
Taqman probe.

♦
Molecular Beacon
♦
Hybridization probe…
TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG
REAL TIME PCR
SYBR GREEN I
không
SYBR
GREEN I
Không phát
huỳnh quang
SYBR
GREEN I
Huỳnh quang
SYBR GREEN I
DNA cần tìm
DNA không
cần tìm
Không phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu

Tính đặc hiệu không cao.

Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe
đặc hiệu

Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có
primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu
SYBR GREEN I
PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU

(Melting Curve)
Mục đích:
phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại
Melting temperature (Tm) của dsDNA:
–T
o
tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn
–Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide
Thực hiện:
tăng T
o
, DNA tách nhau ra,
Đưa T
o
về 55
o
C. Tăng dần
nhiệt độ, chụp hình tín hiệu
huỳnh quang mỗi 0,5
o
C.
Melting Curve
PHÂN BIỆT
SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU
(Melting Curve)
REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE
1. ƯU ĐIỂM
Probe đặc hiệu
Multiplex PCR
2. NHƯỢC ĐIỂM

Giá thành cao
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease
5’
5’
3’
3’
dNTPs
DNA Polymerase
beàn nhieät
Primers
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’

3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
Tube phản ứng
5’
3’
R
Q
Probe
1. Biến tính 94
o
C
5
’
3
’
5
’
3

’
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
5
’
3
’
2. Bắt cặp và kéo dài 60
o
C
Taq
l
5’
3’
R
Q
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
5’
3’

5’
3’
3’
5’
R
Q
5’
3’
3’
Q
Taq
R
5’
2. Phân cắt
3. Hoàn tất tổng hợp
5’
3’
Q
Taq
R
3’
5’
4. Phát hiện
5’
3’
3’
Q
Taq
R
5’

5’
3’
1. Kéo dài mạch
Taq
R
5’
R
3’
Q
Primers có nhiệt độ bắt cặp ở 60
o
C và Taqman probe ở 70
o
C
F
DNA probe
C
G
C
A
A
A
G
T
A
T
C
A
T
C

C
C
T
C
C
A
G
G
G
C
G
G
C
C
A
A T
T
Q
DNA đích
F
GC A AA
GT
A T C A T C
C
C T C CA G
C
G
C
C
A

A
G
G
C
G
T
T
Q
C GT T T C A T A GT A GGGA GGT A
Stem
Loop
Reporter Dye
Q
u
e
n
c
h
e
r

D
y
e
REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE
Giai đoạn biến tính
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG