Khảo Sát Điều Kiện Nuôi Cấy Và Sinh Bào Tử Vi Khuẩn Bacillus Subtilis 8903824.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


NGUYỄN DUY KHÁNH

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO
TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO
TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

NGUYỄN DUY KHÁNH
KHĨA: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


EXAMINE CULTURE CONDITION AND
SPORULATION OF Bacillus subtilis

GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor

Student

Dr.NGUYEN NGOC HAI

NGUYEN DUY KHANH
TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lịng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh
học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy
dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận.
Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt q trình hồn thành khố luận.
Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã cho
phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phịng.
Tơi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong
thời gian học cũng như hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Duy Khánh

i


TĨM TẮT
NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO
SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”.
Hội đồng hướng dẫn:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Việt nam là một nước nơng nghiệp có nghành chăn ni rất phát triển và có đóng
góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất,
chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta

hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm
của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp và xử lí bào tử để
sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều
kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học
cung cấp cho nghành chăn ni.
Qua q trình thực hiện đề tài chúng tơi đã có những ghi nhận sau:
Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và ni cấy lắc (15 phút lắc, 45
phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose,
TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì mơi trường TSB
cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 mơi trường cịn lại là những mơi trường phù hợp
cho Bacillus subtilis phát triển.
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ)
và nhiệt độ ni cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ
nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7
giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng
đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis.

ii


MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ ........................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh sách chữ viết tắt ...................................................................................... iv
Danh sách các hình ............................................................................................ v
Danh sách các bảng .......................................................................................... vi

Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................... 1
Phần 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis ........................................... 2
2.1.1. Lịch sử phát triển .................................................................... 2
2.1.2. Đặc điểm phân loại ................................................................. 2
2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................... 2
2.1.4. Đặc điểm hình thái .................................................................. 2
2.1.5. Đặc điểm ni cấy................................................................... 3
2.1.6. Đặc điểm sinh hoá ................................................................... 3
2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................... 4
2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật
gây bệnh ....................................................................................... 4
2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................... 5
2.2.1. Khả năng sinh bào tử................................................................ 6
2.2.2. Cấu tạo của bào tử .................................................................... 7
2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử ................................................ 8
2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử ............................................................ 9
2.2.5. Sức đề kháng của bào tử .......................................................... 9
2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn ................................... 10
2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột ....................................................... 10
2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột ...................................... 11
iii


2.3.3. Sự loạn khuẩn ......................................................................... 12
2.4. Giới thiệu chung về probiotic ......................................................... 13
2.4.1. Định nghĩa .............................................................................. 13
2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic .......................................... 13

2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa
vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................. 14
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................ 16
3.2. Vật liệu thí nghiệm .......................................................................... 16
3.2.1. Giống vi khuẩn ....................................................................... 16
3.2.2. Mơi trường ni cấy............................................................... 16
3.2.3. Hố chất .................................................................................. 16
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ.................................................................. 16
3.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 17
3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ......................................................... 17
3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................. 17
3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis ........................................ 17
3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc)
và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn ............................. 17
3.4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian ni cấy thích hợp cho
vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối .................... 18
3.4.2.3. Khảo sát pH môi trường thích hợp cho ni cấy
vi khuẩn Bacilus subtilis .......................................................... 19
3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ............................. 20
3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................ 20
3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................... 21
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22
4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................... 22
4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis .......................................... 22

iv

4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis ......................... 22
4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên mơi trường canh23
4.1.4. Tính chất sinh hố ........................................................................... 23
4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils ......................................................... 25
4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian
ni cấy thích hợp ................................................................................. 25
4.2.2. Khảo sát mơi trường và thời gian ni cấy thích hợp .................... 27
4.2.3. Khảo sát pH mơi trường ni cấy vi khuẩn thích hợp .................... 29
4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ..................................... 30
4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử
của Bacillus subtilis ......................................................................... 30
4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử
của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 32
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 34
5.1. Kết luận.................................................................................................... 34
5.2. Đề nghị .................................................................................................... 34
Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................. 36
Phần 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 38

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ........................................................................... 6
Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis ........................................................... 7
Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở
độ phóng đại 1000 lần ..................................................................... 22
Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường TSA ..... 23

Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trường thạch tinh bột ............. 23
Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 25

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis ..................................... 4
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................... 18
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 .......................................................................... 19
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 .......................................................................... 20
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 .......................................................................... 21
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 .......................................................................... 21
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 25
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 27
Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis.................................................................... 29
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis.................................................................... 30
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis ................................................................................... 32

vii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy và thời gian đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................. 26
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của thời gian và môi trường nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................. 28
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 29
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 31
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis .......................................................................... 33

viii


1

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng
ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển. Với mục đích
tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo
vệ môi trường sống khơng bị ơ nhiễm bởi các loại hố chất độc hại và đặc biệt là nhằm
hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải
pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn ni đã rất chú ý đến vấn
đề sử dụng chế phẩm sinh học.
Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi
sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho
hệ vi sinh vật đường ruột, khơi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có
hại cho vật ni. Ngồi ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và

khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng…
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc
Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào
tử vi khuẩn Bacillus subtilis”.
1.2. Mục đích – u cầu
 Mục đích
Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, mơi trường ni cấy thích hợp và
nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
 Yêu cầu
 Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi
khuẩn…
 Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, mơi trường và thời gian ni cấy thích hợp.
 Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử.


2

Phần 2. TỔNG QUAN
2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức
y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry,
Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó,
“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại
tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, y học, thực phẩm….
2.1.2. Đặc điểm phân loại

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc
Bộ:

Eubacteriales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

Bacillus subtilis

2.1.3. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước….
Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng
10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis
rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sơng cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.4. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 –
3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông.
Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm.

3

Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, khơng kháng acid, có khả năng
chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tơ Minh Châu, 2000).

Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
(www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba..._)

2.1.5. Đặc điểm ni cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC.
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong mơi trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
Mơi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình trịn, rìa răng cưa khơng đều,
có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày
bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng.
Mơi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
2.1.6. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose, arabinosse.
Indol (-), nitrate (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein
(+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dịng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do
tác động của hemolysine.

4

Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hố

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh Indol

-

MR

+

VP

+

Sử dụng citrate

+

Khử Nitrate

+

Tan chảy Gelatin

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

(Theo Holt, 1992)
2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L acid glutamic.
Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-.
Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis khơng gây bệnh.
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu
đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hố trong đường ruột. Chúng cịn có khả
năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.


5

 Với các vi sinh vật gây bệnh
Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi
khuẩn và nấm.
Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh
dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của

nấm bị ức chế.
 Với đồng loại
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu
cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đơng”, hay
nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra
bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất
sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết
những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá
vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn cơng, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang
hình thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng
lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì khơng thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ
cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt.
Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt
những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến
khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua
những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH khơng thích
hợp, mơi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi…. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo
được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào
sinh dưỡng.


6

2.2.1. Sự hình thành bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong

chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong
môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tô Minh Châu, 2000).
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước
1. Hình thành vách ngăn.
2. Sự tạo tiền bào tử.
3. Tạo lớp vỏ bào tử.
4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
5. Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2. Q trình tạo bào tử
www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền
bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát
triển và trở thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng
ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau
đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào
sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).


7

2.2.2.Cấu tạo của bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hố học cơ bản
như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và
có thêm một số thành phần mới. Phía ngồi của nguyên sinh chất được bao bọc bởi
nhiều lớp màng.

Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis
www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu
tạo chủ yếu là lipoprotein.
Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành
phần hố học là protein và có sự tham gia của keratin đây là những lớp có khả năng
ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hồ tan trong nước, chúng có tác dụng
tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi.
Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất
đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở
trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương. 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hố học, tính chất sinh lí.


8

Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis
Đặc tính

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

Cấu trúc

Tế bào G+, điển hình

Vỏ bào tử dày, khó thấm
nước

Canxi

Thấp

Cao

Protein

Thấp hơn

Cao hơn

Hoạt tính enzyme

Cao

Thấp

Đặc tính chịu nhiệt

Yếu

Cao

Đặc tính chịu bức xạ

Kém

Mạnh

Đặc tính chịu các chất
hố học và acid

Yếu

Cao

Khả năng bắt màu chất
nhuộm

Dễ nhuộm

Phải sử dụng phương
pháp đặc biệt

Thành phần hoá học

2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều
glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngồi ra cịn có sự tham gia của keratin.
Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển
hố ở trạng thái khơng hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu
hoạt động.
Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm
từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này không bao giờ có trong tế bào sinh
dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm).
Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết.
2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998)
Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn

được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử.
Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hoá, nảy mầm và sinh trưởng:


9

 Hoạt hoá
Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở
60oC trong 5 phút có thể xúc tiến q trình nảy mầm. Sau khi xử lí nhiệt, ta chuyển
vào mơi trường ni cấy thích hợp..
Có một số hố chất đặc biệt có thể xúc tiến q trình nảy mầm của bào tử. Ví dụ:
L-alanine, Mn2+, chất hoạt động bề mặt, glucose,…. Cũng có những chất lại có tác
dụng ức chế q trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate…
 Nảy mầm
Protein có chứa nhiều cystein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm,
xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong bào tử áo giảm
xuống. Các cation bên ngoài co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ
bào tử lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp
lõi của bào tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hố, bắt
đầu q trình tổng hợp thành tế bào.
Trong q trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm
dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide dần dần mất đi; bắt đầu việc tổng
hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng.
Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành
tế bào cịn rất mỏng và chưa hồn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm
DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp.
2.2.5. Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hoá học như: nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng.
Sỡ dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:

 Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó khơng có khả năng làm
biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
 Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử
kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với
nhiệt độ.
 Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới
dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.