Khóa luận khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng phyllanthus emblica linn

LỜI CẢM ƠN
Quá trình thực nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm Hợp chất
thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết – người
giảng viên ln nhiệt tình trong việc truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm,
ln theo sát q trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em được hoàn thành tốt đề tài này. Bên cạnh những bài học
thực nghiệm quý báu mà em được học tập từ cô, em cịn được cơ truyền cho tinh
thần nghiên cứu khoa học giúp em có được động lực trong việc nghiên cứu và
học tập. Cảm ơn thầy Phạm Đức Dũng đã giúp đỡ và cho em những ý kiến bổ
ích để em hồn thành đề tài của mình.
Em cũng xin dành một lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã là điểm tựa
vững chắc cho em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận của
mình. Thành cơng của em trong ngày hơm nay khơng thể có được nếu khơng có
sự u thương và chăm sóc của ba mẹ.
Em xin hết lịng cảm ơn q thầy cơ khoa Hóa học – trường Đại học Sư
phạm thành phố Hồ Chí Minh, thầy cơ đã tận tâm trong cơng tác giảng dạy,
truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích trong suốt thời gian em học
tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Huỳnh Thị Thùy
Linh – học viên cao học, cùng các bạn Nguyễn Thị Thanh Trúc, Nguyễn Hữu
Toàn, Trần Thị Tú Quyên, Dư Vỉnh An đã luôn giúp đỡ, động viên em trong quá
trình thực hiện đề tài này. Xin gửi những lời chúc tốt đẹp nhất đến các bạn và
mong các bạn mãi thành công trên con đường tương lai sau này. Mong rằng sẽ
có thật nhiều cơ hội hợp tác với các bạn sau này.
Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 04 năm 2018


MỤC LỤC
Lời cảm ơn

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các hình
Danh mục các phụ lục
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN ..................................................................................... 1

1.1.

Đặc điểm thực vật cây Me rừng ..................................................................1

1.2.

Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng ...........................................2

1.3.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học .......................................................4

CHƯƠNG 2.

THỰC NGHIỆM .............................................................................. 13

2.1.

Hóa chất, thiết bị, phương pháp ................................................................ 13

2.2.

Nguyên liệu ............................................................................................... 14

2.3.

Điều chế các loại cao.................................................................................14

2.4.

Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate........................15

CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 20

3.1.

Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04 ............................................................ 20

3.2.

Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1 ................................................................ 23

3.3.

Khảo sát cấu trúc hợp chất PA2 ................................................................ 26

CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................. 30

4.1.

Kết luận .....................................................................................................30

4.2.

Đề xuất ......................................................................................................31

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 32


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
1H-NMR
13C-NMR
HSQC
HMBC
brs
s
d
dd
m
𝛿
J
ppm
RP-18
Rf
EA
C

Me
H
SKC
SKLM
G
Mg
Hz

Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1))
Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13))
Heteronuclear Single Quantum Correlation
(Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết)
Heteronuclear Multiple Bond Coherence
(Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)
Broad singlet (mũi đơn rộng)
Singlet (Mũi đơn)
Doublet (Mũi đôi)
Double of doublet (Mũi đôi - đơi)
Multiplet (Mũi đa)
Chemical shift (Độ chuyển dịch hố học)
Coupling constant (Hằng số ghép spin)
Part per million (Một phần một triệu)
Reversed Phase-18 (Pha đảo C-18)
Retention factor (Hệ số lưu giữ)
Ethyl Acetate
Chloroform
Methanol
n-Hexane

Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng
Gam
Miligam
Hertz


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. 4
Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ..................................... 15
Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 ........................................ 16
Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 ..................................... 17
Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 ..................................... 18
Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 ..................................... 19
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin ............... 22
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1và 16-dehydropregenolone .. 25
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA2 và phyllanthol...................... 28


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng .............. 15
Sơ đồ 2.2. Quy trình cơ lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate.................. 19


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Me rừng........................................................................................ 1
Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng .......................................................................... 1
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica
Linn. .................................................................................................................... 12
Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04 ............. 23

Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA1 ................. 25
Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA2 ................. 29


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04
Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEE04
Phụ lục 2a. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất PEE04
Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất PEE04
Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất PEE04
Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất PEE04
Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1
Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA1
Phụ lục 8. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất PA1
Phụ lục 9. Phổ COSY (CDCl3) của hợp chất PA1
Phụ lục 10. Phổ HSQC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1
Phụ lục 11. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1
Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2
Phụ lục 12a. Phổ 1H-NMR dãn rộng (CDCl3) của hợp chất PA2
Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2
Phụ lục 14. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA2
Phụ lục 15. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA2


LỜI MỞ ĐẦU
Chi Phyllanthus là một chi lớn, bao gồm khoảng 500 đến 700 loài, được
chia thành 10 đến 11 chi nhỏ, bao gồm các chi Isocladus, Kirganelia, Cicca,
Emblica, Conani, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus,
Ericocus và Phyllanthus [6]. Bên cạnh các loài như Phyllanthus amarus Schum
et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng), Phyllanthus urinaria L. (cây Diệp hạ châu

ngọt), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) được dùng nhiều trong các
bài thuốc chữa bệnh gan, sỏi thận,…[2], thì trong những năm gần đây, cây Me
rừng (Phyllanthus emblica Linn.) cũng đang rất được quan tâm bởi vì những
ứng dụng của nó trong y học cổ truyền và y học hiện đại.
Cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) là cây thuộc chi Phyllanthus.
Cây này được dùng phổ biến trong y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước
trên thế giới. Ở nước ta, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, trong các rừng thưa.
Quả có thể dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát, rễ
được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp, lá nấu nước rửa bên
ngồi có thể trị lở lt, mẫn ngứa, cịn thân vỏ có tác dụng hạ huyết áp [2]. Bên
cạnh việc được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, các hợp chất cô lập
được từ cây Me rừng đã được chứng minh có tác dụng hạ men gan, chống oxi
hóa, kháng khuẩn [1].
Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học về cây
Me rừng, nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này
cịn hạn chế, đặc biệt là chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học trên vỏ thân.
Chính vì vậy mà chúng tôi chọn vỏ thân cây Me rừng để nghiên cứu với mong
muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh
của cây và đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của
Y học Việt Nam.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật cây Me rừng
Tên thông thường tại Việt Nam là cây Me rừng. Ngồi ra, cây Me rừng có
tên gọi khác tùy thuộc từng vùng miền là mận rừng, me quả tròn, chùm ruột núi,
chùm ruột rừng, mác kham (Tày), diều cam (Dao), xì xà Liên (K’Ho) [2].
Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn.
Thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Hình 1.1. Cây Me rừng

Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng

Cây Me rừng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới châu Á, có thể tìm thấy
lồi thực vật này ở Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan,… Riêng tại Việt Nam, cây Me
rừng phân bố nhiều ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc như Cao Bằng,
Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, … [1].
Cây Me rừng thường là loại cây gỗ nhỏ, ưa sáng, ưa nóng, chịu khơ hạn rất
tốt, thân cây cao 2 – 7 mét, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lơng, dài 20cm.
Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim,
cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc.
Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dưới của cành, với rất nhiều hoa đực
và vài hoa cái. Quả hình cầu trước mọng, sau khơ thành quả nang. Hạt hình ba
cạnh, màu hồng nhạt. Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm.
1


1.2. Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng
1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền
Dựa vào những nghiên cứu trước đây về dược tính theo y học cổ truyền,
hầu hết tất cả các bộ phận của loài thực vật này đều có những cơng dụng chữa
bệnh. Ở Ấn Độ, quả Me rừng là một thành phần trong nhiều bài thuốc cổ truyền
dùng để chữa sỏi niệu, các bệnh về gan, có tác dụng bảo vệ chống độc hại gan.
Cịn ở Việt Nam, quả Me rừng khơ thường được dùng để trị tiêu chảy đau bụng.
Hơn hết, quả Me rừng còn được dùng như một nguồn vitamin C dồi dào với tên
“Myrobalan emblic”, chữa bệnh cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô
khát (dùng 10 – 30 quả sắc uống mỗi ngày), còn trị được bệnh đái tháo đường,
trị ho, lợi tiểu, nhuận tràng. Còn rễ có vị đắng, chát, tính mát được dùng để trị
viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp (dùng 15 – 20g sắc uống mỗi ngày).

Bên cạnh đó, lá nấu nước rửa bên ngoài để trị lở loét, mẩn ngứa. Vỏ thân cây và
rễ có vị đắng, chát, tính mát, sắc lấy nước uống làm lợi tiểu, chữa phù thũng và
tăng huyết áp [1–2].
1.2.2. Dược tính theo y học hiện đại
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về dược tính theo y học
hiện đại về cây Me rừng, trong đó phải kể đến một số nghiên cứu tác dụng dược
lý của các hợp chất quan trọng trong cây Me rừng như acid gallic, acid ellagic,
phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, putranjivain A, emblicamin A và B…
 Tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hóa
Năm 2007, từ dịch chiết của quả Me rừng, Xiaoli Liu cùng các cộng sự của
mình đã nghiên cứu thành công được về khả năng kháng khuẩn và chống oxi
hóa từ dịch chiết đó. Dịch chiết này thu được bằng phương pháp chiết với chất
lỏng siêu tới hạn và cao chiết với methanol [22].
Kết quả của cuộc nghiên cứu cho thấy cao chiết bằng phương pháp chiết
với chất lỏng siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn ở các loại vi khuẩn gram âm
(E. coli, P. aeruginosa, S. typhi), gram dương (S. aureus, B. cereus và B.
subtilis) và kể cả nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) gây hại trên thực
2


phẩm. Điều này được xem như góp phần vào việc sử dụng một sản phẩm thay
thế để kiểm soát vi khuẩn và bảo quản thực phẩm từ tự nhiên.
Ngoài ra, vào năm 2016, cũng từ dịch chiết ethanol của quả Me rừng,
Sirinya Pientaweeratch và các cộng sự đã cho thấy nó khả năng chống oxi hóa
với nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DDPH) là 1.70  0.07 mg/mL và phương pháp
khử gốc tự do 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) là 4.45  0.10
mg/mL [13].
 Tác dụng bảo vệ gan
Năm 2008, từ dịch chiết trong vỏ thân cây Me rừng, S.K. El-Desouky và

các cộng sự đã cơng bố trong dịch này có chứa các phenolic, flavonoid và tanin.
Với một số thử nghiệm trên chuột, kết quả thu được cho thấy dịch chiết này có
tác dụng chống rối loạn chức năng gan dưới tác dụng của ethanol [15].
Sau đó, năm 2010, một loạt các nghiên cứu của Sharma Bhawna và cộng sự
đã công bố dịch chiết ethanol của cây Me rừng có tác dụng hạ men gan, phục
hồi chức năng gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [12].
 Tác dụng kháng virus
Vào năm 2011, Yang Fei Xiang và các cộng sự đã cơ lập được hợp chất
1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75), sau đó họ tiến hành một loạt các thử
nghiệm với tác dụng chống virus HSV (Herpes Simplex virus) loại 1 và 2 (HSV1 và HSV-2). Kết quả cho thấy rằng hoạt chất này ngăn chặn được sự lây nhiễm
virus trong tế bào ở giai đoạn đầu [26].
Năm 2017, He Yan và các cộng sự từ dịch chiết rễ Me rừng đã tìm ra được
hai hợp chất chalconoid là emblirol A (21) và emblirol B (22) có tác dụng kháng
virus khảm thuốc lá (TMV) gây bệnh khảm thuốc lá, với khả năng ức chế lần
lượt ở 79,6% và 82,1% (nồng độ thử nghiệm 1mg/mL) [5].
 Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã cô lập từ cao etyl acetat của quả
Me rừng và thử nghiệm hoạt tính sinh học một số hợp chất một số hợp chất
3


tannin (41–52), flavonoid (70–73). Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác
dụng gây độc tế bào ung thư vú. Đặc biệt, hợp chất isocorilagin (41) có tác dụng
gây độc HELF (Human embryonic lung fibroblast cell) với nồng độ ức chế 50%
(IC50) là 51,4 μg/mL [23].
Vào năm 2013, Xinxian Zhu cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu cho thấy
trên cao chiết xuất giàu polyphenol từ cây Me rừng có tác dụng ức chế sự phát
triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) ở nồng độ tối ưu là 150 mg/mL [24].

1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Theo một số nghiên cứu đã được cơng bố, phần lớn trên các bộ phận như
lá, quả, cành và rễ của cây Me rừng chứa các nhóm hợp chất alkaloid,
benzenoid, coumarin, phenolic, tanin, terpenoid, steroid, flavonoid,… [4], [6],
[16–21], [25–28].
Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn.
Nhóm
hợp chất
Alkaloid

Benzenoid

Hợp chất
Zeatin (1)
Zeatin nucleotide (2)
Zeatin riboside (3)
Chebulic acid (4)
3,6-Di-O-galloyl-β-O-D-glucopyranose
(5)
Gluco-gallin (6)
Gallic acid (7)
Ethyl gallate (8)
Cinnamic acid (9)
2-O-Galloyl L-malic acid (10)
2-O-Galloyl mucic acid (11)
2-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid
(12)
5-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid
(13)
4

Bộ phận
cây
Quả

Tài liệu
tham
khảo
[6]
[6]
[6]
[6]
[6]

Quả

[6]
[4], [6]
[4], [6]
[4]
[26]
[26]
[26]
[26]


3-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid
(14)
3,5-Di-O-galloyl1,4-lactone mucic acid
(15)
2-O-Galloylmethyl ester mucic acid

(16)
2-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid
methyl ester (17)
5-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid
methyl ester (18)
3-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid
methyl ester (19)
3,5-Di-O-galloyl-1,4-lactone mucic
acid methyl ester (20)

[26]
[26]
[26]
[26]
[26]
[26]
[26]

Emblirol A (21)

[5]
Rễ

Emblirol B (22)

[5]

Ellagic acid (23)
Giberellin A-1 (24)
Giberellin A-3 (25)

Diterpenoid Giberellin A-4 (26)
Giberellin A-7 (27)
Giberellin A-9 (28)
Phyllaemblic acid (29)
Phyllaemblic acid methyl ester (30)
Phyllaemblic acid B (31)
Sesquiterpenoid Phyllaemblic acid C (32)
Phyllaemblicin D (33)
Phyllaemblicin A (34)
NorsesquiPhyllaemblicin B (35)
terpenoid
Phyllaemblicin C (36)
2-Carboxylmethylphenol-1-O-β-Dglucopyranoside (37)
Phenolic
2,6-Dimethoxy-4-(2Glycoside
hydroxyethyl)phenol1-O-β-Dglucopyranoside (38)
Chebulanic acid (39)
Tannin
Coumarin

5

Quả

Quả

Rễ

Rễ

[4], [6]
[6]
[6]
[6]
[6]
[6]
[27]
[28]
[28]
[28]
[28]
[29]
[29]
[29]
[28]

Rễ
[28]
Quả

[19]


Lipid và
acid

Steroid

Flavonoid

Corilagin (40)
Isocorilagin (41)
Chebulanin (42)
Chebulagic acid (43)
Mallotusinin (44)
Phyllaembinin A (45)
Phyllaembinin B (46)
Phyllaembinin C (47)
Phyllaembinin D (48)
Phyllaembinin E (49)
Phyllaembinin F (50)
Phyllanthunin (51)
Geraniin (52)
Stearic acid (53)
Lauric acid (54)
β-Sitosterol 3-O-β-D-glucoside (55)
Stigmasta-5,22-diene-3-O-β-Dglucopyranoside (56)
5α,6β-Dihydroxysitosterol (57)
5α,6β,7α-Trihydroxysitosterol (58)
7α-Acetoxysitosterol (59)
β-Sitosterol (60)
7α-Hydroxy-β-sitosterol (61)
7β-Ethoxy-β-sitosterol (62)
7-Ketositosterol (63)
Stigmast-4-ene-3-one (64)
Stigmast-4-ene-3,6-dione (65)
Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (66)
Stigmast-4-ene-3β,6α-diol (67)
3-O-β-D-(6'-OHexanedecanoylglucopyranosyl)stigma
st-5-ene-3β-ol (68)

3-O-β-D-(6'-OHexanedecanoylglucopyranosyl)stigma
st-5-ene-3β,7β-diol (69)
Kaempferol (70)
Quercetin (71)
6

Lá, cành

Quả
Quả

[6]
[21], [22]
[19]
[19]
[20]
[29]
[29]
[22]
[29]
[29]
[29]
[4]
[22]
[4]
[8]

Lá, quả

Lá, cành

[8]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]
[18]

[18]
Quả

[21], [22]
[6], [22]


Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside
(72)
Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside
(73)
Leucodelphinidin (74)
Rutin (75)

(1)

(4)

[21]
[21], [22]
[6]
[6]

(2)

(3)

(5)

(6)

(7) R = H, (8) R = C2H5

(9)

(10)

(16) R1=R2=CH3, (18) R1=CH3, R2=H

(12) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H

(17) R1=H, R2=CH3, (11) R1=R2=H

(19) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3
(14) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl

(15) R1=R4=H, R2=R3=Gallo
7


(13) R1=H, (20) R1=Me

(21) R=Me, (22) R=H

(23)

(24) R1=R2=OH

(25) R=OH

(29) R=H

(26) R1=H, R2=OH

(27) R=H

(30) R=Me

(28) R1=R2=H

(31) R1=OH, R2=H

(34)

(32) R1=R2=H
(33) R1=H, R2=Glu

(35)

(36)

8


(37)

(38)

(41)

(44)

(39

(40)

(42)

(43)

(45)

(46)

9

(48) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H
(49) R1=Galloyl, R3=neoche, R2=R4=H
(50) R1=Galloyl, R4=neoche, R2=R3=H
(47)

(53) R=n-C17H35
(54) R=n-C11H23

(51)

10


(55)

(57) R=H
(58) R=OH

(56)

(59) R1=H, R2=OCOCH3, (60) R1=H, R2=H
(61) R1=H, R2=OH, (62) R1=OC2H5, R2=H

(63)

(64) R1=R2=H
(66) R1=H, R2=OH

(65)

(67)

11


(68) R1=H, R2=OOC(CH2)14CH3

(70) R=H

(69) R1=OH, R2=OOC(CH2)14CH3

(71) R=OH

(72)

(73)

(74)

(75)

Chú thích:

Galloyl

Neoche

Glu =Glucopyranosyl

Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn.

12


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp
2.1.1. Hoá chất
- Silica gel: silica gel 40–63μm, Merck và silica gel 230–400μm, Himedia
dùng cho sắc kí cột.
- Silica gel pha đảo, RP–18, Merck dùng cho sắc kí cột.
- Sắc kí lớp mỏng loại DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck.
- Sắc kí lớp mỏng loại 25DC, RP–18, Merck.
- Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n–hexane, chloroform,
ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất.
- Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng dung dịch
H2SO4 20%, nung nóng bảng.
2.1.2. Thiết bị
- Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
- Các cột sắc kí.
- Máy cơ quay chân khơng.
- Bếp cách thuỷ.
- Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
- Cân điện tử.
2.1.3. Phương pháp tiến hành
 Phương pháp phân lập các hợp chất
Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc
kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP–18 và sắc kí lớp mỏng.
Phát hiện vết chất hữu cơ có trên sắc kí lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%,

nung nóng bảng mỏng.

13


 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz),
2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phịng thí nghiệm Phân tích
trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành
phố Hồ Chí Minh và tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Phịng 133,
nhà A18, Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

2.2. Nguyên liệu
2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là vỏ thân cây Me rừng
(Phyllanthus emblica Linn.) được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình
Thuận vào tháng 5 năm 2014.
Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt (khoa Sinh học – trường Đại học Sư
phạm thành phố Hồ Chí Minh) nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica
Linn.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khơ trong
bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các
hợp chất.

2.3. Điều chế các loại cao
Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô và nghiền
thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (16.2kg). Nguyên liệu bột mịn
được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại
dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (350.5g).

Cao ethanol thô được chiết lỏng–lỏng lần lượt với n–hexane, ethyl acetate
thu được cao hexane (11.5g), cao ethyl acetate (85.4g) và cao cịn lại (224.8g).
Q trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

14


Bột vỏ thân cây khô (16.2kg)
- Ngâm dầm với ethanol
- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao ethanol thô (350.5g)
- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n–hexane
- Lọc, cô quay, thu hồi dung mơi

Cao n-hexane (11.5g)

Dịch chiết cịn lại
- Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate
- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao ethyl acetate (85.4g)

Dịch chiết cịn lại

Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng

2.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate
2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate
Cao ethyl acetate (85.4g) được SKC silica gel, giải ly với hệ dung mơi

H:EA có độ phân cực tăng dần từ 70% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với
hệ dung mơi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Dịch giải ly
qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ
cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả
thu được 9 phân đoạn (EA1 – 9) được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

1

Phân
đoạn
EA1

2

EA2

3

EA3

4

EA4

STT

Dung mơi
giải ly
H:EA (95:5)

Khối
Sắc kí
lượng (g)
lớp mỏng
4.1
Nhiều vết tách xa
Nhiều vết,
H:EA (9:1)
5.4
kéo dài
Nhiều vết,
H:EA (85:15)
12.6
kéo vệt
EA:Me (99:1)
4.6
Nhiều vết
15

Ghi chú
Đã khảo sát
Đã khảo sát
Chưa khảo sát
Đã Khảo sát


5

EA5

EA:Me (95:5)

6.2

6

EA6

EA:Me (9:1)

11.2

7

EA7

EA:Me (8:2)

6.7

8

EA8

EA:Me (7:3)

10.5

9

EA9

Me (100%)

9.8

Nhiều vết tách xa
Nhiều vết,
kéo dài
Nhiều vết,
kéo dài
Nhiều vết,
kéo dài
Nhiều vết,
kéo dài

Đã khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát

2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.1
Phân đoạn EA4 (4.6g) SKLM cho nhiều vết, hiện hình màu tím dưới đèn tử
ngoại nên được chọn SKC silica gel, giải ly với hệ dung mơi H:Ac có độ phân
cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung mơi
EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước
tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 8 phân đoạn
(EA4.1 – EA4.8) được ghi lại ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4
STT Phân đoạn Dung môi giải ly

1

EA4.1

H:Ac (95:5)

2

EA4.2

H:Ac (9:1)

3

EA4.3

H:Ac (85:15)

4

EA4.4

H:Ac (8:2)

5

EA4.5

H:Ac (7:3)

6

EA4.6

H:Ac (6:4)

Khối lượng Sắc kí lớp
Ghi chú
(mg)
mỏng
Có vết trùng
với vết
437.8
Chưa khảo sát
glycoside của
stigmasterol
Có vết trùng
323.9
với vết của Chưa khảo sát
lupeol
Khảo sát
554.7
Nhiều vết thu được hợp
chất PA1
449.9
Nhiều vết Chưa khảo sát
Nhiều vết,

375.9
Chưa khảo sát
kéo vệt
Khảo sát
536.6
3 vết
thu được hợp
16


7

EA4.7

EA:Me (95:5)

421.3

8

EA4.8

EA:Me (9:1)

312.9

chất PEE04
Khảo sát
Nhiều vết thu được hợp
chất PA2

Nhiều vết,
Chưa khảo sát
kéo vệt

2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 của bảng 2.2
Phân đoạn EA4.6 (536.6mg) bằng hệ dung mơi C:Me có độ phân cực tăng
dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân
đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.6.1 – EA4.6.6). Kết quả được
trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6
Khối lượng
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
(mg)
Nhiều vết, kéo
EA4.6.1
C:Me (95:5)
68.6
Đã khảo sát
vệt
Nhiều vết, kéo
EA4.6.2
C:Me (95:5)
81.9
Đã khảo sát
vệt
Tinh chế thu
Nhiều vết,
EA4.6.3
C:Me (9:1)
161.7

được hợp
tách rõ
chất PEE04
Nhiều vết, kéo
EA4.6.4
C:Me (9:1)
121.3
Đã khảo sát
vệt
Nhiều vết, kéo
EA4.6.5
C:Me (9:1)
52.0
Đã khảo sát
vệt
Nhiều vết, kéo
EA4.6.6
C:Me (8:2)
49.6
Đã khảo sát
vệt
Phân đoạn EA4.6.3 (161.7mg) của bảng 2.3 khi SKLM cho vết màu xanh

STT Phân đoạn
1
2
3
4
5
6

Dung môi
giải ly

và hai vết dơ kéo dài, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung mơi C:Ac thu
được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PEE04 (5.8mg).
2.4.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 của bảng 2.2
Phân đoạn EA4.3 (554.7mg) bằng hệ dung mơi H:Ac có độ phân cực tăng
dần từ 20% đến 100% Ac. Tiến hành các bước tương tự như khi SKC phân đoạn
17