(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu điều chế hydrogel trên cơ sở polysaccharide (chitosan, alginate) ghép pluronic f127 ứng dụng hỗ trợ điều trị vết thương bệnh lý đái tháo đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Đình Trung

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ HYDROGEL TRÊN CƠ SỞ
POLYSACCHARIDE (CHITOSAN, ALGINATE) GHÉP
PLURONIC F127 ỨNG DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ VẾT
THƯƠNG BỆNH LÝ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 04/2021

Luan van


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ

Nguyễn Đình Trung

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ HYDROGEL TRÊN CƠ SỞ
POLYSACCHARIDE (CHITOSAN, ALGINATE) GHÉP
PLURONIC F127 ỨNG DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ VẾT
THƯƠNG BỆNH LÝ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Trần Ngọc Quyển

Thành phố Hồ Chí Minh – 04/2021

Luan van


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong
bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tơi xin
chịu hồn tồn trách nhiệm.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 04 năm 2021
Học viên cao học

Nguyễn Đình Trung

Luan van

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập
và rèn luyện trong suốt thời gian vừa qua.
Tôi xin cảm ơn PGS. TS. Trần Ngọc Quyển đã hướng dẫn tôi thực hiện đề
tài này. Thầy đã truyền đạt những kiến thức chuyên ngành sâu rộng, những kinh
nghiệm nghiên cứu quý báu, và nguồn động lực để tôi có thể vượt qua những
khó khăn trong q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin cảm ơn Phịng Vật liệu Hóa dược Viện Khoa học Vật liệu Ứng
dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận
lợi bao gồm hóa chất, dụng cụ và thiết bị để tơi có thể hồn thành đề tài.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên tinh thần và hỗ
trợ tôi trong thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 04 năm 2021
Học viên cao học

Nguyễn Đình Trung

Luan van


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ đầy đủ

Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

ĐTĐ

Diabetic

FDA

Food
and
Administration

PEO

Poly (ethylene oxide)

Nhóm ưa nước

PPO

Poly (propylene oxide)

Nhóm kỵ nước

DLS

Dynamic light scattering

Tán xạ ánh sáng động

FTIR

Fourier transform infrared
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
spectroscopy

1

Proton nuclear
resonance

HNMR

Đái tháo đường
Drug Cục Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ

magnetic

Cộng hưởng từ hạt nhân
Khối lượng phân tử

Mw

Molecular weight

LCST

Lower critical
temperature

solution

Giá trị nhiệt độ tới hạn dưới

UCST

Uper
critical
temperature

solution

Giá trị nhiệt độ tới hạn trên

Cys

Cystamine dihydrochloride

Hóa chất

RE

Resveratrol

Hoạt chất

QU

Quercetin

Hoạt chất

CDCl3

Deuterated chloroform

Hóa chất

UV-Vis

Ultraviolet-visible
spectroscopy

Phổ tử ngoại-khả kiến

NPC

p-nitrophenyl chloroformate Hóa chất

CS

Chitosan

Hóa chất

Luan van


DMEM

Dulbecco’s

Eagle’s medium

modified Môi trường sinh lý cơ bản nuôi
cấy tế bào

Alg-F127

Sodium
Pluronic F127

CS-F127

Chitosan-g- Pluronic F127

Mẫu tổng hợp

THF

Tetrahydrofuran

Hóa chất

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

Hóa chất

PBS

Phosphate Buffer

Dung dịch đệm pH 7,4

Na-Alg

Sodium Alginate

Hóa chất

Na-AlgCys

Sodium
Cystamine

Mẫu tổng hợp

F127

Pluronic F127

Hóa chất

NHS

N-hydroxysucinimide

Hóa chất

Alginate-g-

Alginate-g-

Luan van

Mẫu tổng hợp


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất ................................................................. 26
Bảng 2.2. Danh mục các trang thiết bị và dụng cụ ......................................... 27
Bảng 2.3. Hàm lượng 2 hoạt chất được nang hóa trong 2 nền hydrogel........ 38
Bảng 3.1. Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển
đổi từ gel sang dung dịch và ngược lại. ......................................................... 53
Bảng 3.2. Kết quả định lượng QU trong hydrogel CS-F127/Alg-F127 ......... 67
Bảng 3.3. Kết quả định lượng RE trong hydrogel CS-F127/Alg-F127. ........ 67
Bảng 3.4. Dữ liệu động học giải phóng thuốc đơn của các mẫu CS-F127QU/RE, Alg-F127-QU/RE .............................................................................. 72
Bảng 3.5. Dữ liệu giải phóng đa thuốc của các mẫu CS-F127-QU+RE, AlgF127-QU+RE .................................................................................................. 74
Bảng 3.6. Giá trị T1/2 của các hoạt chất phóng thích ra từ các nền hydrogel
mang đơn chất ................................................................................................. 76
Bảng 3.7. Giá trị T1/2 của các hoạt chất phóng thích ra từ các nền hydrogel
mang 2 hoạt chất ............................................................................................. 77

Luan van


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Chitosan có nguồn gốc từ vỏ tơm, cua; phản ứng deacetyl hóa chitin
tạo chitosan [15] ................................................................................................ 6
Hình 1.2. Cấu trúc của Alginate ...................................................................... 9

Hình 1.3. Scaffold từ hydrogel dextran chuyển từ dạng lỏng sang dạng gel khi
có sự tác động của ánh sáng hỗ trợ quá trình tạo mạch máu và tái tạo da [34]
......................................................................................................................... 14
Hình 1.4. Quercetin và cấu trúc Quercetin ..................................................... 15
Hình 1.5. Resveratrol và cấu trúc Resveratrol ............................................... 17
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp hệ hydrogel CS -F127 .................................... 31
Hình 2.2. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC ........................ 31
Hình 2.3. Quy trình tổng hợp NPC-F127-NPC.............................................. 32
Hình 2.4. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH .......................... 33
Hình 2.5. Quy trình tổng hợp NPC-F127-OH ................................................ 33
Hình 2.6.Sơ đồ phản ứng của quá trình tổng hợp Na-Alg-Cys ...................... 35
Hình 2.7. Sơ đồ tổng hợp copolymer nhạy cảm nhiệt Alg -F127 .................. 36
Hình 3.1. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC.................................. 44
Hình 3.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-OH..................................... 45
Hình 3.3. Kết quả phổ FTIR của NPC-F127-OH........................................... 46
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của copolymer ghép CS -F127 ................................ 47
Hình 3.5. Kết quả phổ FTIR của CS-F127 (1:15) .......................................... 48
Hình 3.6. Phổ FT-IR của Na-Alg, Cys và Na-Alg-Cys tổng hợp sử dụng
EDC/NHS/Cys ................................................................................................ 50
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Na-Alg-Cys trong dung mơi D2O. .................... 51
Hình 3.8. Phổ FT-IR của Alg-F127 (1:10) ..................................................... 52

Luan van


Hình 3.9. Phổ 1HNMR của Alg-F127 ............................................................ 53
Hình 3.10. Chuyển hóa sol-gel của các dung dịch CS-F127 ở 10 °C va 37 °C
......................................................................................................................... 54
Hình 3.11. Đồ thị thể hiện sự tương quan của nồng độ copolymer (%wt/v) và
nhiệt độ lên quá trình chuyển pha sol-gel ....................................................... 55

Hình 3.12. (A) Hình ảnh chụp các tiêu chí đánh giá về sự hình thành gel, giản
đồ (B) thể hiện mối tương quan giữa nồng độ Alg-F127 và nhiệt độ trong sự
tạo gel trong mơi trường nước. ....................................................................... 57
Hình 3.13. Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ copolymer và nhiệt độ
chuyển sol-gel ................................................................................................. 59
Hình 3.14. Hàm lượng nước (%) được hydrogel hấp thụ khi ngâm trong dung
dịch PBS 1X (pH 7,4) trong thời gian 12 ngày (n=3). .................................... 62
Hình 3.15. Hàm lượng nước (%) được hydrogel hấp thụ khi ngâm trong dung
dịch 2mg/ml collagenase pha bằng PBS 1X (pH 7,4) trong thời gian 12 ngày
(n=3). ............................................................................................................... 63
Hình 3.16. Hàm lượng nước (%) được hydrogel hấp thụ khi ngâm trong môi
trường DMEM có bổ sung 10% FBS trong thời gian 12 ngày (n=3). ............ 64
Hình 3.17. Tốc độ phân rã của các hydrogel trong các môi trường ngâm: PBS,
collagenase và DMEM (n= 3). ........................................................................ 65
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện sự tương quan của nồng độ copolymer (%) và nhiệt
độ của mẫu CS-F127 gel (a), Alg-F127 gel (b), CS-F127-QU/RE (c); AlgF127-QU/RE (d).............................................................................................. 69
Hình 3.19. Kết quả giải phóng QU từ hệ hydrogel CS-F127/Alg-F127 ........ 70
Hình 3.20. Kết quả giải phóng RE từ hệ hydrogel CS-F127/Alg-F127......... 71
Hình 3.21. Kết quả giải phóng RE (a) QU (b) từ hai hệ hydrogel CS-F127 và
Alg-F127 mang 2 loại hoạt chất. ..................................................................... 74

Luan van


Hình 3.22. Đồ thị biểu diễn % khối lượng giảm cấp sinh học theo thời gian của
các mẫu hydrogel CS-F127/Alg-F127 mang hoạt chất RE (a), QU (b) trong
môi trường PBS pH 7.4 ................................................................................... 80
Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn % khối lượng giảm cấp sinh học theo thời gian của
các mẫu hydrogel mang 2 hoạt chất RE, QU trong môi trường PBS pH 7.4 (a)
DMEM (b) ....................................................................................................... 81

Hình 3.24. Đồ thị thể hiện sự ổn định của các hydrogel Alg-F127 sau lưu trữ 1
tháng (M1), 2 tháng (M2), 3 tháng (M3) và 6 tháng (M6) ở nhiệt độ bảo quản
4 °C (a) và 37 °C (b) ........................................................................................ 83
Hình 3.25. Đồ thị thể hiện sự ổn định của các hydrogel CS-F127 sau lưu trữ 1
tháng (M1), 2 tháng (M2), 3 tháng (M3) và 6 tháng (M6) ở nhiệt độ bảo quản
4 °C (a) và 37 °C (b) ........................................................................................ 83
Hình 3.26. Độ ổn định của hoạt chất RE (a), QU (b) được đánh giá sau 6 tháng
lưu trữ trong môi trường nước tại nhiệt độ phòng 37 ± 2°C và 4 ± 2°C khi mang
bởi CS-F127/Alg-F127. .................................................................................. 85

Luan van


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: ĐƯỜNG CHUẨN CỦA QU XÂY DỰNG BẰNG UV-VIS
TRONG MÔI TRƯỜNG ETOH:PBS (1:1) ................................................... 96
PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN CỦA RE XÂY DỰNG BẰNG UV-VIS
TRONG MÔI TRƯỜNG DMSO:PBS (1:1)................................................... 96
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HOẠT CHẤT
TRONG HỆ HYDROGEL .............................................................................. 97
PL3.1. Kết quả đo hàm lượng hoạt chất RE trong hệ hydrogel sau thời gian lưu
trữ tại điều kiện 4 ± 2 °C. ................................................................................ 97
PL3.2. Phần trăm hoạt chất RE còn lại trong hệ hydrogel sau thời gian lưu trữ
tại điều kiện 4 ± 2 °C....................................................................................... 97
PL3.3. Kết quả đo hàm lượng hoạt chất QU trong hệ hydrogel sau thời gian lưu
trữ tại điều kiện 4 ± 2 °C. ................................................................................ 97
PL3.4. Phần trăm hoạt chất QU còn lại trong hệ hydrogel sau thời gian lưu trữ
tại điều kiện 4 ± 2 °C....................................................................................... 98
PL3.5. Kết quả đo hàm lượng hoạt chất RE trong hệ hydrogel sau thời gian lưu
trữ tại điều kiện 37 ± 2 °C. .............................................................................. 98

PL3.6. Phần trăm hoạt chất RE còn lại trong hệ hydrogel sau thời gian lưu trữ
tại điều kiện 37 ± 2 °C..................................................................................... 98
PL3.7. Kết quả đo hàm lượng hoạt chất QU trong hệ hydrogel sau thời gian lưu
trữ tại điều kiện 37 ± 2 °C. .............................................................................. 98
PL3.8. Phần trăm hoạt chất QU còn lại trong hệ hydrogel sau thời gian lưu trữ
tại điều kiện 37 ± 2 °C..................................................................................... 99

Luan van


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT........................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .......................................................... vi
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ......................................................................... ix
MỤC LỤC .......................................................................................................... I
TÓM TẮT .......................................................................................................... I
ABSTRACT ......................................................................................................II
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN ........................................................................ 4

PLURONIC F127 ................................................................................... 4

1.1.1. Giới thiệu Pluronic F127....................................................................... 4

1.1.2. Tính chất của Pluronic .......................................................................... 4
1.1.3. Ứng dụng của Pluronic ......................................................................... 5
1.2.

TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN ............................................................. 5

1.2.1. Nguồn gốc và cấu tạo của chitosan ....................................................... 5
1.2.2. Tính chất ............................................................................................... 6
1.2.3. Ứng dụng của chitosan trong y sinh ..................................................... 7
1.3.

TỔNG QUAN VỀ ALGINATE ............................................................. 8

1.3.1. Nguồn gốc và cấu tạo của Alginate ...................................................... 8
1.3.2. Tính chất và ứng dụng của Alginate ..................................................... 9

Luan van


1.3.2.1. Tính tương hợp sinh học ................................................................... 10
1.4.

TỔNG QUAN VỀ HYDROGEL.......................................................... 10

1.4.1. Khái niệm hydrogel............................................................................. 10
1.4.2. Phân loại hydrogel thông minh ........................................................... 11
1.4.2.1. Hydrogel đáp ứng kích thích hóa học ............................................... 11
1.4.2.2. Hydrogel đáp ứng kích thích vật lý................................................... 12
1.4.3. Tính chất của hydrogel........................................................................ 12
1.4.3.1. Tính trương nở .................................................................................. 12

1.4.3.2. Tính phân hủy sinh học ..................................................................... 12
1.4.3.3. Tính tương hợp sinh học ................................................................... 13
1.4.4. Ứng dụng của hydrogel nhạy nhiệt ..................................................... 13
1.4.4.1. Ứng dụng trong lĩnh vực tái tạo mô .................................................. 13
1.4.4.2. Ứng dụng chữa lành vết thương ....................................................... 14
1.4.4.3. Ứng dụng trong mang nhả thuốc ...................................................... 14
1.5.

TỔNG QUAN VỀ QUERCETIN VÀ RESVERATROL .................... 15

1.5.1. Quercetin ............................................................................................. 15
1.5.1.1. Cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của QU ....................... 15
1.5.1.2. Hoạt tính sinh học của QU ................................................................ 16
1.5.2. Resveratrol .......................................................................................... 17
1.5.2.1. Cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của RE ........................ 17
1.5.2.2. Hoạt tính sinh học của RE ................................................................ 18
1.6.

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ....................................... 19

1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước ....................................................... 19
1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................... 23
CHƯƠNG 2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 26

Luan van


2.1.

NGUN LIỆU - HĨA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . 26

2.1.1. Nguyên liệu – hóa chất ....................................................................... 26
2.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị..................................................................... 27
2.1.3. Các phương pháp phân tích ................................................................ 29
2.1.3.1. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng 1H-NMR ........................ 29
2.1.3.2. Phổ hồng ngoại (FT-IR) .................................................................... 29
2.1.3.3. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) .................................................... 30
2.2. TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ CHITOSAN
VÀ PLURONIC F127 ..................................................................................... 30
2.2.1. Tổng hợp NPC-F127-NPC ................................................................. 31
2.2.2. Tổng hợp NPC-F127-OH.................................................................... 33
2.2.3. Tổng hợp hệ copolymer ghép chitosan-g- Pluronic F127 (CS -F127) 34
2.3. TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ ALGINATE
VÀ PLURONIC F127 ..................................................................................... 34
2.3.1. Tổng hợp dẫn xuất Alginate-cystamine (Na-Alg-Cys) ...................... 34
2.3.2. Tổng hợp copolymer ghép alginate-g- Pluronic F127(Alg -F127) .... 35
2.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊN NHIỆT
ĐỘ TẠO GEL ................................................................................................. 36
2.4.1. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS -F127 ............. 36
2.4.2. Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg -F127............ 37
2.4.3. Khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép ........ 37
2.5. ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ HYDROGEL
NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC ................... 38
2.5.1. Điều chế hệ hydrogel có mang các loại thuốc/hoạt chất sinh học ...... 38
2.5.1.1. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU ................ 38
2.5.1.2. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang RE ................. 39

Luan van

2.5.1.3. Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU và RE...... 39
2.5.2. Xác định hàm lượng QU và RE được nang hóa trong hệ hydrogel.... 39
2.5.3. Kiểm tra tính nhạy nhiệt và xác định điểm chuyền pha của hệ hydrogel
CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE ........................................... 39
2.5.4. Khảo sát và đánh giá khả năng nhả các hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel
theo thời gian ................................................................................................... 40
2.5.4.1. Khảo sát và đánh giá về khả năng nhả hoạt chất ra khỏi hệ
hydrogel ........................................................................................................... 40
2.5.4.2. Nghiên cứu động học giải phóng thuốc khỏi hệ hydrogel ................ 41
2.5.4.3. Xác định thời gian T1/2 giải phóng một nửa thuốc in vitro ............... 42
2.5.5. Khảo sát và đánh giá thời gian giảm cấp của hệ hydrogel hoạt tính trong
mơi trường giả sinh học................................................................................... 42
2.5.6. Khảo sát và đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong hệ hydrogel ..... 42
CHƯƠNG 3.
3.1.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 44

KẾT QUẢ TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT CS -F127 ....... 44

3.1.1. Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC ..................................................... 44
3.1.2. Kết quả tổng hợp NPC-F127-OH ....................................................... 45
3.1.3. Kết quả tổng hợp CS -F127 ................................................................ 47
3.2.

KẾT QUẢ TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT ALG -F127 ... 49

3.2.1. Kết quả tổng hợp Na-Alg-Cys ............................................................ 49

3.2.2. Kết quả tổng hợp Alg -F127 ............................................................... 51
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER
LÊN NHIỆT ĐỘ TẠO GEL ........................................................................... 53
3.3.1. Kết quả khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS-F127 . 53
3.3.2. Kết quả khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg-F127 56

Luan van


3.3.3.

Kết quả khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép
........................................................................................................... 60

3.3.3.1. Kết quả đánh giá khả năng hấp thụ nước của hydrogel .................... 60
3.3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng giảm cấp của hydrogel .......................... 64
3.4.
KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ
HYDROGEL NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH
HỌC ........................................................................................................... 66
3.4.1. Điều chế hệ hydrogel có mang các loại thuốc/hoạt chất sinh học ...... 66
3.4.2. Kiểm tra tính nhạy nhiệt và xác định điểm chuyền pha của hệ hydrogel
CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE ........................................... 68
3.4.3. Khảo sát và đánh giá khả năng nhả các hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel
theo thời gian ................................................................................................... 69
3.4.3.1. Kết quả khảo sát và đánh giá khả năng nhả đơn hoạt chất ra khỏi 2 hệ
hydrogel ........................................................................................................... 69
3.4.3.2. Kết quả khảo sát và đánh giá khả năng nhả hoạt chất ra khỏi 2 hệ
hydrogel mang 2 hoạt chất .............................................................................. 73
3.4.3.3. Kết quả khảo sát đánh giá về T1/2 của hệ hydrogel mang hoạt chất .. 76

3.4.4. Khảo sát và đánh giá thời gian giảm cấp của hệ hydrogel hoạt tính trong
mơi trường giả sinh học................................................................................... 78
3.4.5. Khảo sát và đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong hệ hydrogel ..... 82
CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 86

4.1.

KẾT LUẬN ........................................................................................... 86

4.2.

KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 88
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 96

Luan van


TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, các hydrogel nhạy nhiệt được điều chế trên cơ sở
F127 ghép với chitosan/alginate và kết hợp với các hoạt chất QU/RE hỗ trợ
điều trị dạng nano tạo ra màng gel thông minh đa chức năng có nhiều hoạt tính
để phủ vết thương. CS-F127 (1:15); Alg-F127 (1:10) tốt nhất trong các tỷ lệ
ghép, cấu trúc được chứng minh bằng phổ 1HNMR và phổ hồng ngoại FT-IR.
Các hệ này trước và sau khi mang hoạt chất đều có điểm tạo gel ở 30-35 °C và
điểm tan gel ở trên 50 °C. Khả năng hấp thụ nước và tốc độ phân rã của hệ
hydrogel phụ thuộc tuyệt đối vào nồng độ copolyme sử dụng. Hiệu quả mang

QU/RE của hydrogel CS-F127/Alg-F127 đạt trên 98% . Thời gian giữ hoạt chất
và T1/2 cao hơn nhiều so với QU/RE tự do. Thời gian giảm cấp của hệ hydrogel
mang 2 hoạt chất kéo dài trên 12 ngày, độ ổn định của hoạt chất trên 6 tháng,
cho thấy khả năng hydrogel Alg-F127 và CS-F127 mang hoạt chất rất thích hợp
cho các ứng dụng trong y sinh học đặc biệt trong điều trị vết thương.

I

Luan van


ABSTRACT
In this study, the heat-sensitive hydrogel was made based on the combine
of F127, chitosan/alginate and others active ingredient as supporting nanotreatment QU/RE to create a multifunctional smart gel membrane with multiple
activities which cover the wound. CS-F127 (1:15); Alg-F127 (1:10) is the best
coupling ratio of which the structure is proven by 1HNMR spectroscopy and
FT-IR infrared spectroscopy. Before and after carrying substance, the gelation
point and gel melting points of these complex are sequentially meansured at
30-35 °C and above 50 °C. The water absorption capacity and decay rate of the
hydrogel complex are completely based on the used copolymer concentration.
The QU/RE carrying efficiency of CS-F127/Alg-F127 hydrogel is more than
98%. Moreover the retention time and half-life of the active substance are much
higher than free QU/RE. The decomposition time of the hydrogel complex with
2 substance lasted for more than 12 days and the stability of the active
ingredient was also over 6 months. Therefore, the Alg-F127 and CS-F127
hydrogels have ability to carry subtances and suitable for pharmaceutical
applications, especially in wound treatment.

II

Luan van


MỞ ĐẦU
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) type 2 là bệnh rối loạn chuyển hóa tăng
glucose huyết do cả 2 lý do là khiếm khuyết về tiết insulin và về tác động của
insulin. Tại Việt Nam số lượng người bị ĐTĐ đang tăng lên nhanh chóng. Theo
thống kê của Cục Quản lý khám chữa bệnh (Bộ Y tế): tại Việt Nam số người
mắc ĐTĐ chiếm khoảng 5,4% dân số (với hơn 5 triệu người mắc) xếp hàng đầu
thế giới. Tỷ lệ này tăng gấp đôi so với đầu những năm 2000. Tại các thành phố
lớn như Hà Nội, Hải Phòng, hoặc thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ này lên đến 1012 thậm chí gần 15% [1].
Bệnh ĐTĐ thường dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng như đột quỵ,
loét chân, tim mạch. Loét chân là nguyên nhân hàng đầu của việc nhập viện đối
với những người mắc bệnh ĐTĐ. Loét chân do ĐTĐ được ước tính xảy ra ở
25% trong số tất cả các bệnh nhân mắc ĐTĐ, trong đó có thể đến 84% bị cắt
cụt chân liên quan do biến chứng [2]. Các vết thương do bệnh ĐTĐ thường
được đánh giá là "không thể chữa trị được". Trên thực tế, vết thương bị chậm
lành dẫn đến biến chứng loét. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: cứ 5 người mắc
ĐTĐ thì có 1 người bị nhiễm lt và phải chữa bằng phương pháp “đoạn chi”
(cắt cụt tay, chân) [3]. Tỷ lệ chết ở bệnh nhân mắc chứng loét do áp lực gây ra
cao gấp bốn lần ở các bệnh nhân khơng mắc chứng này. Chi phí cho việc điều
trị có thể là cao do bao gồm sự chăm sóc điều dưỡng chuyên sâu cũng như các
trị liệu phụ trợ, ví dụ thiết bị chống áp suất, băng bó bảo vệ và điều trị da.
Vật liệu sinh học thay thế da tạm thời là 1 trong những hướng tiếp cận
mới, những vật liệu có nguồn gốc sinh học ( da đồng loại, da dị loại, các màng
sinh học, các vật liệu sinh tổng hợp…) được dùng để che phủ vết loét một cách
tạm thời [4]. Nhằm tạo ra một lớp ngăn cách thích hợp nhất về mặt sinh lý giữa
bề mặt vết lt và mơi trường bên ngồi. Điều này cho phép các hệ thống sửa
chữa và miễn dịch của cơ thể tham gia vào quá trình liền vết loét một cách hữu
hiệu nhất. Do không tương hợp về mặt miễn dịch ghép nên các vật liệu này chỉ

bám sống trên nền vết loét trong một thời gian nhất định sau đó sẽ bị thải loại.

1

Luan van


Hiện nay tại Việt Nam đã có những cơ sở sử dụng một cách thường quy các
sản phẩm này để điều trị các loét bàn chân ĐTĐ.
Tuy nhiên, các phương pháp trị liệu này đắt tiền và có thể là chi phí khơng
thể trả được đối với nhiều bệnh nhân. Do đó, việc chăm sóc và làm lành vết
thương ở người đặt ra nhiều thách thức nghiêm trọng. Các phương pháp trị liệu
hiện có của khoa học hiện đại có các hạn chế khi nó đi vào điều trị và chữa trị
các vết thương nhất định. Các điều kiện ảnh hưởng đến việc điều trị vết thương
ở người, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, ở đó điều kiện vệ sinh thường
khơng hồn tồn đầy đủ. Nguy cơ của các biến chứng do vật ký sinh, vi khuẩn
v.v. gây nghiêm trọng.
Hydrogel là loại vật liệu mềm và ẩm ướt, có thể có tới 95% thành phần
nước với các phân tử nằm trong khung polymer sinh học và có cấu trúc 3D.
Theo như đặc tính chung của hydrogel, chúng tạo lớp màng rắn cách ly sự tiếp
xúc của vùng bị thương với mơi trường bên ngồi ngăn ngừ khả năng nhiễm
khuẩn hay nấm có trong khơng khí. Ngồi ra hydrogel có khả năng giữ nước
cao có thể lên đến 200% so với trọng lượng, vì thế hydrogel cung cấp một môi
trường ẩm cho vết thương, thấm hút các dịch do vết thương tiết ra, đồng thời
tạo áp lực lên bề mặt vết thương kích thích sự tăng sinh của nguyên bào sợi,
thúc đẩy quá trình tái tạo collagen và hình thành mao mạch mới giúp cho vết
thương mau lành. Ngồi những ưu điểm trên, hydrogel có thể loại bỏ 1 cách dễ
dàng không gây đau đớn cũng như tổn thương phần mơ mền mới tái tạo tại
vùng vết thương.
Có rất nhiều loại hydrogel được nghiên cứu và triển khai thử nghiệm

trong điều trị vết thương ở người ĐTĐ, trong số đó, nhiều loại hydrogel hoạt
tính trên cơ sở Pluronic F127 là 1 trong những đối tượng quan tâm hàng đầu
hiện nay vì Pluronic F127 đã được FDA cho phép sử dụng để ứng dụng trên
lâm sàng [5]. Tuy nhiên việc sử dụng Pluronic khơng có biến tính để điều chế
hydrogel cho thấy các nhược điểm về cơ tính. Để cải thiện nhược điểm của gel
Pluronic, Pluronic thường được biến tính hay biến đổi cấu trúc bằng cách gắn
thêm các nhóm chức năng hoặc các nhóm có nguồn gốc từ polymer tự nhiên,
có thể là protein như collagen [6] và gelatin [7], hoặc polysaccharides như tinh
2

Luan van


bột [8], chitosan [9], alginate và agarose [10]. Trong lĩnh vực vật liệu sinh học
tái tạo mô, việc sử dụng các polymer sinh học có hoạt tính như chitosan, gelatin
hay alginate nhận được sự quan tâm đáng kể.
Sự kết hợp polysaccharide chitosan/alginate và Pluronic có thể tạo ra một
loại hydrogel nhạy cảm nhiệt tiếp xúc tốt với bề mặt vết thương, đồng thời tăng
cường sự tái tạo mạch máu, tăng cường khả năng cầm máu cũng như tạo mơi
trường thích hợp để kích thích q trình tái tạo lại vùng da bị tổn thương, đặc
biệt là đối với vết thương ở bệnh nhân ĐTĐ.
Vì vậy trong nghiên cứu này, đề tài “Nghiên cứu điều chế hydrogel trên
cơ sở polysaccharide (Chitosan, Alginate) ghép Pluronic F127 ứng dụng
hỗ trợ điều trị vết thương bệnh lý đái tháo đường” được chọn làm đề tài
luận văn tốt nghiệp cao học. Các hydrogel nhạy nhiệt (hydrogel thông minh)
được điều chế trên cơ sở Pluronic F127 ghép với chitosan/alginate và kết hợp
với các hoạt chất hỗ trợ điều trị dạng nano (quecertin với resveratrol) sẽ tạo ra
màng gel thơng minh đa chức năng có nhiều hoạt tính để phủ vết thương. Loại
hydrogel thơng minh này có sự chuyển đổi trạng thái vật lý từ lỏng sang gel, cụ
thể, khi vật liệu ở nhiệt độ thấp hơn 30 °C vật liệu ở trạng thái lỏng và chuyển

thành trạng thái gel- giống như màng sinh học khi nhiệt độ ở nhiệt độ trên 30
°C do đó làm tăng khả năng tiếp xúc của màng hydrogel với bề mặt vết thương
và các hoạt chất sẽ được phóng thích tương tác trực tiếp với các loại khuẩn hay
tế bào để tạo các hiệu ứng tăng cường quá trình chữa lành.

3

Luan van


CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN

PLURONIC F127

1.1.1. Giới thiệu Pluronic F127
Pluronic là polymer nhạy nhiệt và có tính tương hợp sinh học được FDA
(Food and Drug Administration) chứng nhận và cho phép sử dụng rộng rãi. Về
mặt cơng thức hố học, Pluronic cịn được gọi là poly (ethylene oxide)–poly
(propylene oxide)–poly (ethylene oxide) hay gọi tắt là PEO-PPO-PEO có cấu
trúc đặc biệt với hai nhóm ưa nước ở ngồi, cịn ở giữa là nhóm kỵ nước và
nhóm này cũng là thành phần nhạy nhiệt của Pluronic. Pluronic được sử dụng
trong nghiên cứu có ký hiệu F127 (Poloxamer 407) ở dạng rắn, số nhóm EO ưa
nước (x = 95–105), số nhóm PO kỵ nước (y = 54–60) và khối lượng phân tử
khoảng Mw = 9840–14600 Da [11]
1.1.2. Tính chất của Pluronic
Tất cả các Pluronic đều có cấu tạo hóa học giống nhau, chỉ khác nhau ở
số lượng tương đối của poly (ethylene oxide)-poly (propylene oxide), chính vì

thế mà tính chất, trọng lượng phân tử cũng như đặc tính hoạt động bề mặt của
mỗi loại là rất khác nhau. Trong đó, hầu hết các Pluronic là các chất rắn có khả
năng tan trong nước và chúng hịa tan trong nước lạnh nhiều hơn trong nước
nóng, đó là kết quả của việc gia tăng sự solvat hóa và liên kết hydro ở nhiệt độ
thấp. Bởi nhiệt độ thấp sẽ tồn tại một lớp hydrat hóa bao quanh các phân tử
Pluronic trong dung dịch nước, làm phân tán chúng và kết quả là các Pluronic
được hòa tan vào trong nước. Khi nhiệt độ nâng lên các chuỗi ưa nước của
Pluronic khơng solvat hóa nữa do sự đứt gãy các liên kết hydro đã được thiết
lập giữa dung môi và các chuỗi này, do đó mà pluronic khơng tan tốt trong
nước có nhiệt độ cao (> 20 °C).
Pluronic có tính chất rất đặc trưng là biến đổi trạng thái bởi nhiệt độ. Khi ở
nhiệt độ thấp (0-4 °C), dung dịch Pluronic với một nồng độ thích hợp sẽ tồn tại ở
trạng thái lỏng, nhưng khi tăng nhiệt độ lên nhiệt độ phịng 35 °C thì lại chuyển
sang dạng gel rắn. Nhiệt độ tạo gel là nhiệt độ tới hạn, khi nhiệt độ cao hơn nhiệt
4

Luan van


độ tới hạn thì dung dịch polyme đơng lại thành gel. Ngun nhân do nhóm PEO
ưa nước cịn PPO thì kỵ nước nên khi nâng nhiệt độ lên nó tạo thành dạng micelle
với nhân là PPO và lớp vỏ ngoài là PEO. Việc tăng nhiệt độ sẽ dẫn đến sự cắt đứt
các liên kết trên mạch PPO và xảy ra q trình loại nước tại vùng chứa các nhóm
kỵ nước, kết quả là các nhóm PPO có xu hướng mất nước tạo thành lõi với vỏ bên
ngoài là chuỗi PEO ngậm nước hợp thành hình cầu micelle bền nhiệt động polyme
và gel được hình thành [12, 13]
Sự kết hợp của các loại thuốc kém tan vào trong các hạt micelle Pluronic
có thể làm tăng khả năng hịa tan và tăng sự ổn định của thuốc, có thể cải thiện
được dược tính của thuốc và tăng sự phân tán sinh học [13].
1.1.3. Ứng dụng của Pluronic

Pluronic được dùng để che phủ vết thương, bỏng mơ mềm để góp phần tăng
cường q trình chữa lành vết thương thơng qua q trình kích thích các tế bào tại
vùng mơ tổn thương trong cơ thể tăng cường sản sinh các nhân tố phát triển mạch
máu và thúc đẩy phát triển nguyên bào sợi. Đồng thời với tính chất chuyển pha
theo nhiệt độ của pluronic, các dung dịch pluronic có thể được tiêm vào các vị trí
cần tái tạo phục hồi mơ sụn. Ngồi ra, pluronic còn là chất hoạt động bề mặt
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp như tẩy rửa, tạo bọt
bền, nhũ hố, dầu bơi trơn, mỹ phẩm, mực và một số ứng dụng đặc biệt
như trong dược phẩm [14].
1.2.

TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN

1.2.1. Nguồn gốc và cấu tạo của chitosan
Chitosan một polysaccharides mạch thẳng, là dẫn xuất deacetyl hoá của
chitin, Chitin có trong tự nhiên ở cả thực vật và động vật như lồi giáp xác, cơn
trùng, nấm và một vài loài tảo. Chitosan được sản xuất bằng phương pháp
deacetyl hóa bằng nhiệt hóa trong mơi trường kiềm.

5

Luan van


Hình 1.1. Chitosan có nguồn gốc từ vỏ tơm, cua; phản ứng deacetyl hóa chitin
tạo chitosan [15]
Chitosan có thành phần chủ yếu là glucosamine, có các nhóm chức hoạt
động gồm một nhóm amino ở vị trí C2, hai nhóm hydroxyl ở vị trí C3, C6. Sự
thay đổi hóa học của những nhóm chức này cung cấp các vật liệu có ích trong
các ứng dụng khác nhau [16]. Tên gọi IUPAC của chitosan: Poly β-(1-4)-2amino-2-deoxy-D-glucose hay Poly β-(1-4)-glucosamine. Công thức phân tử :

(C6H11O4N)n.
1.2.2. Tính chất
Tính chất vật lý: Chitosan là chất rắn, xốp nhẹ, sản xuất dạng hình vảy
có thể xay nhỏ nhiều kích cỡ khác nhau có màu trắng hoặc màu vàng nhạt,
khơng mùi, khơng vị. Tính chất của chitosan phụ thuộc vào những yếu tố như
mức độ deacetyl hóa, trọng lượng phân tử [16].
Tính chất hóa học: Chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NH2 nên
chitosan có các tính chất hóa học của ancol và amin. Mặc khác chitosan là
polymer mà các monomer được nối với nhau bằng các liên kết β-(1,4)-glicozit;
các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như: bazơ, các chất oxy
hóa và các enzyme thủy phân
Tính chất sinh học: Chitosan có những tính chất quan trọng như khả năng
tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, kết dính sinh học, chống oxi hóa, khả
năng kháng khuẩn và kháng nấm, kháng khối u, kích thích sự phát triển tăng
sinh của tế bào, khả năng hấp thụ kim loại nặng… Ngoài ra, chitosan cịn có
khả năng giảm cholesterol trong máu, hoạt tính kháng virus, điều trị bệnh thận
mãn tính và chống rối loạn nội tiết [17].
6

Luan van


Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không
độc, liều tử vong (LD50) cho uống của chitosan đã được ghi nhận là 16g/kg
trọng lượng cơ thể, không gây độc trên động vật thực nghiệm và người [18].
Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã
kết luận: chitosan là vật liệu tương hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng
trong hệ thống tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh
mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà cịn sử dụng an tồn trong ghép mơ [19].
Vì chitosan có đặc tính kết dính sinh học nên khi được kết hợp với Pluronic

F127 sẽ tăng độ bền cũng nhưng khả năng bám dính vào bề mặt vết thương của
hệ hydrogel.
1.2.3. Ứng dụng của chitosan trong y sinh
Cầm máu: Trong y học, chitosan được sử dụng như một chất cầm máu,
đã được ứng dụng làm băng gạc có khả năng kháng khuẩn, không gây dị ứng.
Tác nhân cầm máu chitosan thường là muối chitosan hình thành khi trộn
chitosan với một acid hữu cơ như succinic axit hoặc axit lactic. Tác nhân cầm
máu hoạt động bằng sự tương tác giữa các màng tế bào hồng cầu (điện tích âm)
và chitosan proton (điện tích dương) và cả tiểu cầu dẫn đến hình thành cụm
máu đơng. Các muối chitosan có thể được trộn với các vật liệu khác để làm cho
chúng hấp thụ nhiều hơn chẳng hạn như kết hợp với alginate hoặc có thể thay
đổi tốc độ hịa tan, hấp thụ sinh học của muối chitosan. Các muối chitosan có
tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học nên chúng rất tương thích với
cơ thể. Chitosan proton hóa có thể bị cắt thành glucosamine bởi lysozyme trong
cơ thể, liên hợp với các acid tự nhiên trong cơ thể chẳng hạn như lactate hoặc
succinate [20].
Điều trị bỏng: Một số nghiên cứu ghi nhận màng đắp vết thương bỏng có
kết hợp chitosan có tác dụng rất tốt trong sự kiểm sốt tốc độ trao đổi hơi nước,
oxy và khả năng hút nước. Chitosan cung cấp mạng phi protein cho tế bào phát
triển trong khơng gian ba chiều. Đặc biệt chitosan cịn tác động lên macrophage
(đại thực bào) kích thích tiết GFs (grow factors) làm tăng sinh ngun bào sợi
có kiểm sốt (khơng để phát triển quá mức), giúp cho quá trình tái cấu trúc
7

Luan van