Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid và paracetamol ở chuột nhắt trắng

1

Đặt vấn đề
Miễn dịch học là một lĩnh vực ngày càng phát triển và
có nhiều ứng dụng rộng rÃi trong y, sinh học. Một trong các hớng nghiên cứu quan trọng của miễn dịch là tìm hiểu các
yếu tố trong mạng lới điều hoà, kiểm soát hoạt động của hệ
thống này. Trong quá trình hoạt động của hệ thống miễn
dịch, có sự tham gia của nhiều chất đóng vai trò truyền đạt
thông tin giữa các tế bào. Các chất này có tác dụng kích
thích hay kìm hÃm sự trởng thành và các hoạt động chức
năng của các tế bào miễn dịch. Những chất đợc gọi là chất
kích thích miễn dịch khi làm tăng cờng đáp ứng miễn dịch
hoặc ngợc lại nếu có tác dụng gây suy giảm đáp ứng miễn
dịch đợc gọi là chất ức chế miễn dịch [3] [8] [9]. Trên lâm
sàng các tình trạng bệnh lý liên quan đến suy giảm miễn
dịch, đặc biệt là suy giảm miễn dịch thứ phát rất phổ biến
do nhiễm trùng cấp, mạn tính, nhiễm độc hoá chất, sau trị
liệu ung th bằng tia xạ, AIDS.... Điều trị các bệnh lý đó ngoài
việc điều trị nguyên nhân cần dùng thêm biện pháp kích
thích miễn dịch thích hợp. Các chất kích thích miễn dịch
có nguồn gốc rất khác nhau, quan trọng nhất phải kể đến
các chất kích thích miễn dịch nội sinh (đây là các sản
phẩm chế tiết của các tế bào miễn dịch) nh: interleukin (IL) 1,
2, 3...35, interferon (IFN)... gäi chung lµ các cytokin [53]. Các
chất kích thích miễn dịch có nguồn gèc tõ vi khuÈn, virus, ký
sinh trïng, nÊm... nh BCG, bronchovaxom, lentinan...[3], [9],
[29], [62], [90].


2
Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc hoá học đợc

tổng hợp hoặc bán tổng hợp đà đợc sử dụng nh levamisol,
imuthiol. Hiệu quả mang lại do việc sử dụng các chất kích
thích miễn dịch là rất khả quan, tuy nhiên vẫn còn nhiều tồn
tại... nh chi phí cho một đợt điều trị quá cao khi sử dụng các
thuốc kích thích miễn dịch có nguồn gốc nội sinh, không phù
hợp với điều kiện kinh tế của phần lớn ngời bệnh. Trong khi
đó các thuốc có nguồn gốc hoá học lại có độc tính cao, ảnh
hởng xấu tới chức năng gan, thận. Vì vậy, việc tìm kiếm và
đa vào sử dụng những chất kích thích miễn dịch có nguồn
gốc từ thực vật, đặc biệt là các dợc liệu có sẵn trong nớc là
một vấn đề cấp thiết đợc đặt ra. Cây nhàu (Morinda
citrifolia L. Rubiaceae), một trong những dợc liệu đợc nhân
dân sử dụng lâu đời với mục đích nâng cao sức đề kháng
của cơ thể [5], [28]. Đặc biệt gần đây nhiều nhà khoa học
trên thế giới đà nghiên cứu sâu hơn về quả của cây nhàu
trồng ở Hawaii và đa ra nhiều kết quả nghiên cứu khả quan
về tác dụng chống ung th, chống oxyhóa và kích thích miƠn
dÞch [46], [75], [81], [97].[98], [99], [100], [101], [102],
[116], [175], [218].
Trong các nghiên cứu trớc của chúng tôi đà chứng minh
cao quả nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua
tác dụng kích thích hồi phục các chỉ số miễn dịch ở súc vật
thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia gamma và
tiêm cyclophosphamid [2]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài này nhằm nghiên cứu tác dụng chống oxyhóa và


3
đánh giá sâu hơn về tác dụng kích thích miễn dịch trên thực
nghiệm của cao quả nhàu Việt Nam.

Mục tiêu của đề tài:
1. Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch

in

vitro và in vivo của cao quả nhàu trên chuột nhắt
trắng.
2. Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả
nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô hình gây tổn
thơng gan bằng carbon tetraclorid và paracetamol ở
chuột nhắt tr¾ng.


4
Chơng 1

Tổng quan tài liệu
1.1. suy giảm miễn dịch trên lâm sàng

1.1.1 Khái niệm suy giảm miễn dịch
Suy giảm miễn dịch là trạng thái hoạt động của hệ miễn
dịch không đủ mạnh để chống lại kháng nguyên nhằm bảo
vệ cơ thể. Hậu quả của suy giảm miễn dịch là dễ mắc các
bệnh nhiễm khuẩn, tái nhiễm nhiều lần cùng một loại tác
nhân gây bệnh, mắc các bệnh mạn tính... Suy giảm miễn
dịch đợc chia làm 2 nhóm: bẩm sinh và mắc phải. Suy giảm
miễn dịch bẩm sinh là hậu quả của một hoặc nhiều khiếm
khuyết trong quá trình phát triển bào thai. Suy giảm miễn
dịch bẩm sinh thờng rất khó điều trị, biểu hiện lâm sàng
nặng nề và tỷ lệ tử vong cao [63], [64], [77]. Suy giảm miễn

dịch mắc phải không bắt nguồn từ các khiếm khuyết do di
truyền mà thờng do các yếu tố từ môi trờng sống gây ra.
Điều trị các suy giảm miễn dịch mắc phải bên cạnh việc
điều trị nguyên nhân thờng dùng thêm các thuốc hỗ trợ
điều biến miễn dịch, các chất chống oxy hoá[16], [68],
[150], [170], [176], [189], [192], [203].
1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải:
Đây là loại bệnh lý rất thờng gặp ở cả các nớc đang phát
triển và phát triển [92]. Dựa vào nguyên nhân gây ra tình
trạng suy giảm miễn dịch ngời ta chia ra một số nhóm chính
sau:
-

Suy giảm miƠn dÞch do suy dinh dìng.


5
-

Suy giảm miễn dịch do nhiễm vi sinh vật: nhiễm vi

khuẩn, nấm, kí sinh trùng, virus. Đặc biệt suy giảm miễn
dịch do nhiễm HIV/AIDS.
-

Suy giảm miễn dịch do bệnh lý: các bệnh mạn tính

kéo dài, đặc biệt là bệnh ung th.
-

Suy giảm miễn dịch do phóng xạ.

-

Suy giảm miễn dịch do thuốc hoặc hóa chất.

-

Suy giảm miễn dịch khác nh: tuổi già, chấn thơng....

[173]
* Suy giảm miễn dịch trong nhiễm HIV/AIDS
NhiƠm HIV/AIDS lµ bƯnh thêi sù cđa thÕ kû vµ trên toàn
thế giới. Bệnh AIDS do retrovirus HIV-1 hay HIV-2 gây ra. HIV
có ái lực cao với phân tử CD4 và đồng thụ thể (Co - receptor)
nh CXCR4 có trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch chủ
yếu là tế bào TCD4+ và đại thực bào. Thời kỳ ủ bệnh thờng
không có triệu chứng. Diễn biến lâm sàng của quá trình
nhiễm HIV phản ánh sự tơng tác phức tạp giữa tác động của
virus trên chức năng của tế bào có thẩm quyền miễn dịch và
trên đáp ứng miễn dich của vật chủ. Suy giảm miễn dịch
mắc phải do nhiễm HIV/AIDS là tình trạng nhiễm khuẩn kéo
dài, trờng diễn dai dẳng, diễn biến chậm nhng hậu quả rất
nặng nề dẫn đến cơ thể bị suy giảm miễn dịch đặc biệt
là suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào. Virus tấn công
vào các tế bào TCD4, chemokin (CCR-5, CXCR-4) do các tế bào
này có thụ thể với virus. Ngời nhiễm HIV bị mất lympho TCD4.
Do thiếu hụt TCD4 dẫn đến các tổn thơng miễn dịch kèm
theo vì TCD4 có vai trò rất to lớn trong đáp ứng miễn dịch cả
dịch thĨ vµ qua trung gian tÕ bµo [8], [9], [77], [169].

* Suy giảm miễn dịch trong ung th


6
Ung th lµ mét bƯnh ngµy cµng phỉ biÕn vµ gia tăng trên
toàn thế giới. Về mặt tế bào học thì các tế bào ung th bắt
nguồn từ các tế bào bình thờng của cơ thể nhng vì một
nguyên nhân nào đó các tế bào này bị đột biến và phát
triển vô hạn định làm cơ thể không thể kiểm soát đợc nữa.
Về mặt gen học, sự đột biến trong quá trình phân bào là
hiện tợng bình thờng, chúng luôn bị loại trừ theo cơ chế
miễn dịch. Nh vậy khi bị mắc ung có thể do hệ miễn dịch
của cơ thể đà bị suy giảm hoặc bản thân bệnh ung th làm
hệ miễn dịch bị suy yếu hơn, đặc biệt suy giảm miễn
dịch qua trung gian tế bào do các tế bào lympho T đảm
nhận [3], [9], [79].
Điều trị miễn dịch có nhiều hớng nhng vẫn đang còn
trong thời kỳ thử nghiệm. Các kháng thể

đơn dòng đặc

hiệu thì vẫn thuộc loại khác loài nên biến chứng do gây mẫn
cảm dị loài còn nghiêm trọng hơn là tác dụng diệt tế bào
ung th. Nhiều trờng hợp sử dụng các cytokin kết quả thì cha
rõ nhng phản ứng toàn thân rất mạnh mẽ nhiều khi phải bỏ
thuốc. INF- đà đợc dùng trong popilloma, leukose, IL-2 trong
adenocarcinoma và melanoma đà tạo đợc những thời kỳ thoái
lui kéo dài của bệnh. Rosenberg lần đầu tiên dùng IL-2 trên
ex-vivo nghĩa là ủ tế bào lympho của bệnh nhân với cytokin
này ngoài cơ thể để tạo ra LAK, sau đó tiêm trả lại cho bệnh

nhân thì ung th thu nhá l¹i [3], [8], [9], [73], [205]. Trong u
lympho một phơng pháp điều trị có nhiều hứa hẹn là tự
ghép tế bào tuỷ xơng và tế bào máu cuống rốn. Chọn lúc
bệnh thoái lui tự nhiên, lấy tuỷ xơng cất trong đông lạnh
sâu, sau đó dùng tia xạ với liều gây chết tế bào (các tế bào
ung th ngoại vi sẽ bị tiêu diệt hết), khi ấy truyền lại lợng tế


7
bào gốc dự trữ cho bệnh nhân. Hoặc dùng tế bào máu
cuống rốn truyền cho bệnh nhân. Các tế bào này có thể
giúp cơ thể hồi phục hoàn toàn nhất là nếu chúng đợc sử lý
trớc để chỉ có tế bào gốc mới đợc truyền vào.
Một hớng mới đang đợc chú ý là tác dụng ngay vào vị trí
mà quá trình phát triển tế bào bị phong bế nhằm phục hồi
lại quá trình biệt hóa tế bào. Đó là dùng các chất chống
oxyhóa tại chỗ hoặc toàn thân, hoặc dùng thực phẩm chức
năng nh các chất chống oxyhoá [29], [61],[63],[78], [196].
1.2. Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm:

Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm đợc
chia thành nhiều nhóm khác nhau: Thuốc hoặc hóa chất, yếu
tố vật lý: phóng xạ, bức xạ ion, gây ung th thực nghiệm, gây
nhiễm các vi sinh vật: vi khuẩn, nấm, virus...
1.2.1.Thuốc hoặc hóa chất:
Hoá chất thờng đợc sử dụng là cyclophosphamid (CY),
cyclosporinA, dexamethason, azathioprin. Mỗi một chất có
một hiệu lực và một cơ chế gây suy giảm miễn dịch riêng.
* Nhóm kháng purin:
Ba

chất

thờng

dùng

nhất

là

6-mercaptopurin,

azathioprin và thioguanin. Azathioprin (Imuran) là dẫn
xuất nitro-imidazol của mercaptopurin là chất hay đợc sử
dụng.
- Tác dụng và cơ chế: Tác dụng ức chế miễn dịch:
nồng độ thấp 10 -2 mg/l, azathioprin ức chế sinh sản các
lympho T, gây độc tế bào và ức chế các tế bào tạo kháng


8
thể. Với nồng độ thấp hơn 1mg/l, azathioprin ức chế phản
ứng tạo hoa hồng tự nhiên của chuột cống. Trên ngời, với
liều ức chế miễn dịch thông thờng không làm giảm bạch
cầu, tác dụng này chỉ xuất hiện ở liều cao gây độc.
Azathioprin tác dụng lên cả miễn dịch đặc hiệu và không
đặc hiệu, kéo dài thời gian tồn tại của mảnh ghép. Tác
dụng lên sản xuất kháng thể có ®Ỉc ®iĨm: dïng ®ång
thêi hc 48 giê sau khi dïng kháng nguyên mới có tác

dụng, còn nếu dùng trớc thì không có tác dụng. Tác dụng
lên sản xuất IgG hơn là IgM, tác dụng lên đáp ứng miễn
dịch nguyên phát hơn là thứ phát. Phối hợp azathioprin với
kháng nguyên liều cao có thể tạo ra tình trạng dung nạp
miễn dịch đặc hiệu. Trên chuột nhắt trắng dùng liều
20-35 mg và chuột cống liều 15-20 mg/kg thể trọng để
gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [88], [205]. .*
Nhóm mù tạc nitơ (nitrogen mustard)
Hai thuốc thờng dùng là cyclophosphamid

(CY) và

clorambuci
-Cơ chế tác dụng ức chế miễn dịch: Liều cao CY: 100300mg/kg thể trọng trên chuột cống trắng thấy giảm tế
bào lympho, teo hạch lympho, teo vùng vỏ tuyến ức, teo
lách. Các tổn thơng này phục hồi nhanh, sau ngừng thuốc
vài ngày thấy tăng sinh ở các cơ quan lympho và đáp ứng
miễn

dịch

trở

lại

bình

thờng

sau

1

-

2

tuần.

Cyclophosphamid tác dụng mạnh trên lympho B hơn là


9
lympho T. Điều này có thể là do thời gian sống của lympho B
ngắn hơn lympho T.
Trên đáp ứng miễn dịch dịch thể: cyclophosphamid
tác dụng chủ yếu lên IgG và tác dụng yếu hơn với IgM, tác
dụng lên phản ứng miễn dịch nguyên phát mạnh hơn thứ
phát.

Làm

mất

phản

ứng

mẫn

cảm

chậm.

Cyclophosphamid thờng dùng liều 100 - 200 mg/kg trên
chuột nhắt, liều 150mg/kg trên chuột cống để gây suy
giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [20], [32].
* Methotrexat: chế cả miễn dịch tế bào và miễn
dịch dịch thể, thông qua ức chế sự nhân

lên và giảm

chức năng của tế bào lympho B và T. Tuy nhiên thuốc ít
đợc dùng trên thực nghiệm [3], [6].
* Cyclosporin A: Cycloporin có cấu trúc một pepid
vòng đợc chiết xuất từ nÊm Tolypoclodium inflatum gams.
Thuèc øc chÕ chän läc víi lympho T. Với nồng độ điều trị,
cyclosporin không gây ức chế tủy xơng. Liều điều trị
thuốc ức chế sản sinh và ức chế sự giải phóng các
lymphokin, đặc biệt là interleukin 2 làm cho lympho T
không trở thành tế bào lympho T nhận cảm đợc. Liều cao,
thuốc ức chế interleukin 2-receptor [3], [11], [73], [205].


1
0

Hình 1.1: Cơ chế tác dụng suy giảm miễn dịch cđa
cycloporin A
* Corticoid: víi liỊu 2-10mg, ë cht cèng corticoid hủy

tế bào lympho, đặc biệt là huỷ tế bào tuyến ức. Tác
dụng làm giảm tế bào lympho sớm xuất hiện, đồng thời
làm giảm khả năng tập trung tế bào lympho, tế bào đơn
nhân và bạch cầu đa nhân ở vị trí viêm. Corticoid ức
chế phản ứng quá mẫn chậm, ức chế di tản đại thực bào,
làm giảm lympho độc với tế bào, kéo dài thời gian tồn tại
của mảnh ghép da. Hiệp đồng với azathioprin trong ghép
cơ quan, làm giảm khả năng lu giữ kháng nguyên trên bề
mặt đại thực bào, và có thể làm giảm tính thực bào của
nó thông qua sự giảm giải phóng interleukin 1. Corticoid
làm giảm sự sản xuất IL-2, IFN , làm tăng sự dị hóa của
IgG. Liều lợng: trên chuột nhắt dùng liều 20-40 mg/kg thể
trọng để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [9],
[205].


1
1

Tiết
cytokin:
IL-2,TNF

Diệt các tế
bào

Đáp ứng miễn dịch tế
bào

Hình1.2 Cơ chế tác dụng suy giảm miễn dịch của

corticoid
* Kháng thể kháng lympho

Có thể dùng các kháng thể đa clôn hay các kháng thể
đơn clôn chống các phân tử có mặt trên các tÕ bµo lympho
nh CD1, 2, 3, 4... tïy theo mơc đích gây suy giảm áp ng
min dch tế bào hay dịch thể mà có thể dùng các kháng thể
kháng CD đặc trng, ví dụ: dùng kháng CD2, CD3 để ức chế
miễn dịch tế bào (c ch các t bo T), kh¸ng CD40 để ức chế
miễn dịch dịch thể (ức chế các t bo B) [3], [73], [205].
+ Kháng thể đa dòng:Đợc tạo ra bằng cách gây miễn
dịch cho súc vật bằng tế bào lympho ngời. Nếu kháng


1
2
nguyên là lympho lấy từ tuyến ức sẽ tạo ra kháng thể
kháng tế bào T (antithymocyteserum- ATS). Khi kháng
nguyên lympho có nguồn gốc từ lách, máu ngoại vi sẽ tạo ra
thể kháng lympho B.
Cơ chế tác dụng: Lympho T có đời sống kéo dài nên bị
phá hủy ở gan, huyết thanh kháng lympho bào cũng loại
trừ các lympho này. Tác dụng nổi bật của kháng thể đa
dòng là lên miễn dịch tế bào, đặc biệt là phản ứng quá
mẫn chậm, phản ứng loại trừ mảnh ghép, phản ứng mảnh
ghép chống vật chủ. Kháng thể đa dòng còn làm trở ngại
sự nhận biết kháng nguyên trên receptor của tế bào
lympho [3], [73], [205].
+ Kháng thể đơn dòng :Những kháng thể đợc tạo ra
bởi sự gây mẫn cảm bằng các kháng nguyên đặc hiệu ở

màng tế bào lympho T và B nên có u điểm hơn kháng thể
đa dòng, vì :
- Thuốc có phản ứng chọn lọc với kháng nguyên bề mặt chỉ có
trên một loại tế bào miễn dịch, rất đặc trưng. Ví dụ: CD-3 có mặt trong hầu hết các
tế bào T chín, CD-4 có mặt trên tế bào Th trong khi CD-8 lại có mặt trên các tế bào
Tc.
- Không có phản ứng chéo với các tế bào không phải lympho
nh tiểu cầu.
- Kháng thể có thể định lợng đợc nên việc sử dụng đợc
chính xác hơn. Kháng thể muromonab CD3 (biệt dợc Orthoclone
OKT3) là loại kháng thể thuộc nhóm IgG-2a có trọng lợng phân tử


1
3
150.000 daltons. Thuốc tác dụng thông qua sự giảm chức năng
và sự sản xuất các cytokin của lympho T [88], [205].

* Kháng các cytokin và receptor của chúng:
Đây là nhóm thuốc mới, rất đặc hiệu. Khi dùng trên
lâm sàng ít tác dụng không mong muốn hơn các nhóm
thuốc ức chế miễn dịch khác. Dùng trên thực nghiệm để
gây suy giảm miễn dịch trên súc vật giúp tìm hiểu cơ
chế tác dụng của thuốc thử khu trú hơn. Phần lớn các
thuốc trong nhóm này đợc sản xuất theo công nghệ tái tổ
hợp gen [3], [88], [205].
- Thuốc kháng interleukin -2 receptor

(kháng

CD25)
Cơ chế tác dụng: IL-2 là một cytonkin quan trong bậc
nhất trong quá trình biệt hóa và trởng thành của các tế
bào lympho T. Đồng thời IL-2 là sản phẩm tiết của tế bào
Th khi đợc hoạt hóa. Khi IL-2 gắn đợc vào receptor

(có

mặt trên các tế bào T chín) nó sẽ khởi động một dòng
thác miễn dịch, phản ứng viêm và sự biệt hóa tr ởng thành
các tế bào T diễn ra nhanh chóng. Hơn nữa sự kết hợp IL2 và recptor còn ảnh hởng đến cả đáp ứng miễn dịch
dịch thể. Thuốc kháng interleukin -2 receptor sẽ ức chế
đáp ứng miễn dịch tế bào rất điển hình [88], [123].
- Thuốc kháng TNF (Remicade).
Cơ chế tác dụng: TNF là một cytokin đợc các tế bào
có thẩm quyền miễn dịch tiết ra khi tiếp xúc với kháng


1
4
nguyên, đặc biệt là tế bào ung th, virus, ký sinh trïng.
TNF α cã vai trß quan träng trong miƠn dịch chống ung th
và chống vi sinh vật. Thuốc kháng TNF có ái lực cao với với
TNF nên ngăn chặn đợc TNF kết hợp với receptor của nó
và làm mất các tác dụng của TNF [88], [123], [205].
- Thuèc øc chÕ LFA-1 (Enlimomab) hay kh¸ng CD-11a.
Thuèc øc chế LFA-1 kết hợp với LFA-1và ngăn chặn
LFA-1 ICAM (phân tử kết dính ngoại tế bào). Thuốc đang
dùng trong giai đoạn thử nghiệm để làm giảm thải trừ
mảnh ghép tối cấp trong ghép tạng [88], [205].

1.2.2. Tác nhân phóng xạ gây suy giảm miễn dịch
thực nghiệm:
Tia xạ tác động lên các cơ quan của cơ thể thông qua
năng lợng bức xạ gây biến đổi cấu trúc các phân tử sinh
học, phân hủy chúng và tạo ra các ion, gốc tự do trong các tế
bào và các mô. Các gốc tự do tiếp tục phản ứng chuỗi tạo
thành gốc tự do thứ cấp tiếp tục tấn công vào các phân tử
sinh học khác. Khi các phân tử sinh học bị tổn thơng dẫn
đến rối loạn trao đổi chất trong tế bào. Hậu quả là tế bào
bị biến đổi về cấu trúc, chức năng và có thể chết [19]. Tác
dụng của bức xạ ion hoá đồng thời lên nhiều cơ quan trong
cơ thể, nhng tổn thơng cấp tính trớc tiên xảy ra ở các tế
bào hệ lympho và các tế bào máu tại tủy xơng. Do vậy máu
và cơ quan tạo máu là tổ chức đầu tiên của cơ thể chịu sự
tác ®éng cđa phãng x¹ [1], [10], [43], [47], [56].


1
5
Nh vậy, với cơ chế của tác dụng bức xạ ion, các tế bào và
cơ quan của hệ miễn dịch bị tổn thơng không chọn lọc,
nghĩa là cả hai hình thức miễn dịch tự nhiên và đặc hiệu
đều bị tổn thơng. Phóng xạ dùng trong y học để gây suy
giảm miễn dịch gồm nhiều loại tia nh tia , , và tia X. Mọi
bức xạ ion hoá dù ở dạng sóng hay dạng hạt đều có giá trị năng
lợng nhất định. Khi gặp vật chất, năng lợng sẽ truyền cho
nguyên tử hoặc phân tử của vật chất. Trong số các tia xạ trên
tia và tia X hay đợc dùng để gây suy giảm miễn dịch.
-Tia (gamma): Là bức xạ điện từ có khả năng đâm
xuyên cao nhất. ở các loài khác nhau, mức độ nhạy cảm với

những bức xạ cũng khác nhau. Ví dụ LD 50/30 (là liều bức xạ
gây tử vong 50% số cá thể trong vòng 30 ngày kể từ khi bị
chiếu xạ), thay đổi nh sau: Chuét lang: 300-500 rad, chuét
cèng: 450-600 rad, thá: 900-1000 rad [10], [56]. Có thể chiếu
tia toàn thân hay các tổ chức lympho. Đây là biện pháp
gây tổn thơng hệ thống miễn dịch không chọn lọc. Liều
chiếu và cách thức tiến hành tuỳ thuộc vào súc vật thử
nghiệm, vào mục tiêu của nghiên cứu [18], [15], [22]. Theo
Phan Thị Phi Phi: có thể gây suy giảm miễn dịch cấp bằng
liều 600 rad cho chuột nhắt một lần duy nhất hoặc có thể
gây suy giảm mạn tính bằng liều 100 rad cho mỗi chuột
trong một ngày, kéo dài 6-7 ngµy [20], [31], [32].
- Tia X: cịng lµ tia bøc xạ điện từ, khả năng đâm xuyên
kém hơn tia . Tia X đợc sử dụng nhiều nhất trong chụp hình


1
6
y học, ít đợc dùng để gây suy giảm miễn dịch trên súc vật
thực nghiệm [31].
1.2.3. Các phơng pháp khác: G©y ung th thùc nghiƯm
g©y nhiƠm vi sinh vËt... Ngêi ta đà gây đợc ung th thực
nghiệm bằng các tác nhân khác nhau trên nhiều loài súc vật
nh dùng yếu tè vËt lý, hãa häc, sinh häc. Trong ®ã hay dùng
nhất là hóa chất và virus [3]. Từ năm 1911 Peyton Rous đÃ
gây đợc ung th cho gà bằng tác nhân virus. Ngay sau đó
vào năm 1915 Yamagiwa và cộng sự lần đầu tiên dùng hắc
ín gây đợc ung th trên tai thỏ. Sau này việc gây ung th thực
nghiệm trở nên dễ dàng hơn nhờ ghép các khối u thực
nghiệm hoặc tiêm các tế bào ung th đặc chủng vào các loài

súc vật. Các phơng pháp gây ung th thực nghiệm khác nhau
tạo ra các đáp ứng miễn dịch khác nhau, từ đó sơ bộ tìm ra
đợc cơ chế chống ung th của chất mới đang đợc nghiên cứu.
Ví dơ khi khèi ung th thùc nghiƯm g©y ra b»ng hóa chất thì
kháng nguyên đặc hiệu ung th thay đổi tùy vào tổ chức bị
ung th hóa. Nếu tác nhân là virus thì không có kháng
nguyên đặc hiệu của tổ chức bị ung th hóa [3], [9], [205].
- Các tác nhân vt lý gây ung th thực nghiệm:
Bức xạ tử ngoại: gây ung th da. Chiếu tia tử ngoại có bớc
sóng từ 600-3400 Angtron để gây ung th da trên
chuột nhắt trắng [3].
Bức xạ ion hóa: dùng tia X, tia gamma gây ung th trên
nhiều loài súc vật. Gây ung th máu trên chuột nhắt
bằng chiếu xạ toàn thân trong thời gian dài khoảng 90


1
7
ngày. Gây ung th buồng trứng trên chuột nhắt ở liều
25-50 rad [3].
+ Các tác nhân sinh học gây ung th thực nghiệm:
Đặc biệt do virus oncogen vì khi tích hợp vào ADN của
vật chủ chúng thờng gây biến chuyển ác tính tế bào. Một số
các virus gây ung th thực nghiệm hay đợc sử dụng nh Murine
sacoma virus, Murine leukemia virus, herpes virus… HiƯn nay
hay sư dơng nhÊt lµ cấy ghép tổ chức ung th hoặc tiêm các
tế bào ung th [3], [205].
1.3. Một số xét nghiệm thờng đợc sử dụng để đánh giá khả
năng đáp ứng miễn dịch:

1.3.1. Nghiên cứu đánh giá sự giải phóng các cytokin: IL1alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8 và TNF-alpha từ bạch cầu ngời
[83].
- Nguyên lý: các cytokin là sản phẩm của tế bào khi
chúng đợc hoạt hoá, là các peptid có hoạt tính sinh học cao,
đợc kích thích sinh tổng hợp nh những chất nội tiết. Các
cytokin liên quan đến nhiều quá trình, nhiều loại tế bào
khác nhau. Ví dụ: quá trình viêm, quá trình đáp ứng miễn
dịch và nhiều quá trình khác. Hoạt tính sinh học của các
cytokin này rất đa dạng, ảnh hởng đến nhiều loại tế bào nh:
các cytokin của các tế bào lympho T, hoạt tính của các
lympho bào B và các yếu tố khác nhau nh chất gây sèt, u
tè hđy cèt bµo, u tè biƯt hãa tun ức, yếu tố do đại thực
bào (IL-1). Yếu tố kích thích tế bào gan, yếu tố phát triển tế
bào lai, u tè kÝch thÝch tÕ bµo míi (IL-6). Ỹu tè hãa øng


1
8
động bạch cầu, ức chế sự kết dính của bạch cầu (IL-8). Yếu
tố hoại tử khối u (TNF) [83].
- Tiến hành: lấy máu ngoại vi của ngời trởng thành khỏe
mạnh, khoảng 10 ml, phá bỏ hồng cầu, tiểu cầu. Ly tâm, tách
lấy các bạch cầu, nuôi cấy và ủ với kháng nguyên đặc hiệu
(PHA làm kháng nguyên). Sau thời gian nuôi cấy, lấy chất tiết
của các tế bào này định lợng các cytokin bằng phơng pháp
ELISA [83].
1.3.2. Nghiên cứu chất đối kháng với yếu tố hoại tử
khối u (TNF-alpha antagonism)
- Nguyên lý: có 2 phân nhóm của TNF (TNF alpha
cachetin và TNF beta lymphotoxin). Một số tác dụng của TNF

đà đợc nghiên cứu nh: cảm ứng IL-1, điều hòa hoạt tính các
tế bào nội mô mạch máu và tăng cờng chức năng miễn dịch
đặc hiệu nh diệt các tế bào ung th, tế bào nhiễm virus
Tuy nhiên không phải khi nào tác dụng của TNF cũng có lợi cho
ngời bệnh, TNF alpha nếu đợc giải phóng ra quá nhanh và
nhiều có thể gây tử vong do suy tuần hoàn, rối loại chuyển
hóaVì vậy, trong một số trờng hợp thuốc có tác dụng đối
kháng với TNF alpha có tác dụng làm hạn chế tỷ lệ tử vong
trên lâm sàng [83].
- Tiến hành:Dùng các tế bào thuộc dòng L 929 nuôi cấy
trong các giếng, mỗi giếng có 2 x 104 tế bào, điều kiện
nhiệt độ 37oC và không khí có 5% CO2. Các tế bào nuôi cấy
đợc tiếp xúc với TNF (cho vào mỗi giếng 1-10UI), ủ ấm và
nuôi cấy thêm 20 giờ. Sau khi nuôi cấy đủ thời gian, các tế
bào còn sống đợc thu hoạch, giữ ở nhiệt độ phòng trong 30


1
9
phút, thêm vào mỗi giếng 100l LDH, 15 phút sau đo hoạt
tính enzym trên máy quang phổ ở bớc sóng 490 nm.
- Một số phơng pháp cải tiến: Maloff và Delmendo: đánh
giá sự kết hợp của TNF với receptor TNF của ngời. Dùng tế bào
HeLa S3 của ngời, nuôi cấy và ủ với TNF có gắn Iod phóng xạ
(I125) [83].
1.3.3. Nghiên cứu đánh giá sự tăng sinh của các tế
bào

lympho

với

các

mitogen

(Mitogen

induced

lymphocyte proliferation).
- Nguyên lý: Các tế bào lympho có thể đợc kích thích
tăng quá trình tăng sinh khi đợc cảm ứng bằng các mitogen
khác nhau. Quá trình biệt hóa sẽ thể hiện thông qua tăng
sinh tổng hợp DNA. Định lợng DNA bằng phơng pháp đánh
dấu phóng xạ +3H-thymidin, nhờ đó ngời ta xác định đợc các
nucleotid mới
Trên ex vivo:Các súc vật đợc dùng thuốc thử mỗi ngày
một lần trong 5 ngày liên tục. Sau khi dùng thuốc thử đủ
ngày, lấy tổ chức lách, tách lấy tế bào (Hỗn dịch chứa 5x 10 6
tế bào/ml). Các mitogen đợc đa vào các giếng nuôi cấy. ủ
ấm và nuôi cấy tế bào trong điều kiện chuẩn: nhiệt độ
37oC, trong không khí có 5 % khí CO2, thời gian nuôi cấy 4860 giờ. Thêm 0,25C

+

3H-thymidin vào các giếng nuôi cấy.

Thu hoạch các tế bào bằng dụng cụ lọc thủy tinh chuyên biệt,
làm khô và định lợng [4], [83].

1.3.4. Nghiên cứu đánh giá sự chuyển dạng cđa tÕ
bµo lympho T (T cell proliferation)


2
0
- Nguyên lý: Các tế bào lympho T sẽ tăng biệt hóa khi đợc
kích thích bới kháng nguyên đặc hiệu. Dùng các tác nhân
khác nhau làm suy giảm về số lợng và chức năng của các tế
bào lympho T, sau đó gián tiếp định lợng các tế bào lylpho T
bằng phơng pháp đánh dấu phóng xạ (+3H-thymidin) và chất
tiết đặc hiệu của chúng là IL-2 bằng phơng pháp ELISA [83].
- Tiến hành: các tế bào lympho máu ngoại vi gồm cả tế
bào B và T. Dùng kháng CD3 (phân tử CD3 là một tổ hợp gồm
4 chuỗi peptid có trọng lợng phân tử từ 20-26 kD, phân tử
CD3 có mặt ở mọi tế bào T chín) hoặc kháng CD28 để cô
lập các tế bào T. Sau đó ủ và nuôi cấy các tế bào T với kháng
nguyên đặc hiệu trong các giếng nuôi cấy tế bào. Thêm vào
các giếng 1C +3H-thymidin để gián tiếp định lợng số lợng
các tế bào lympho T. Dùng phơng pháp ELISA để định lợng
interleukin-2 receptor (IL-2R).
- Đánh giá: IL-2 là cytokin quan trọng, đợc sản xuất bởi các
tế bào Th. Dới tác dụng của IL-2 các tế bào lympho T tăng cờng
phân chia và biệt hóa. IL-2R gồm 2 chuỗi peptid (chuỗi :
trọng lợng phân tử 75 kD và : 55 kD). Các tế bào T khi nghỉ
chỉ có một ít chuỗi , hầu nh không còn chuỗi . Những
receptor có ái tính cao với IL2 có khả năng cảm ứng sự tăng trởng và biệt hóa tế bào T. Receptor có ái tính thấp với IL2 chỉ
có chuỗi , chúng không hoạt hóa đợc tế bào T [3], [83].
1.3.5. Nghiên cứu đánh giá khả năng tạo quàng
dung huyết in vitro (Plaque forming colony test in

vitro)[4], [39], [83].


2
1
1.3.6. Đánh giá khả năng tạo hoa hồng mẫn cảm với
kháng nguyên [4], [39].
1.3.7. Phản ứng bì với kháng nguyên OA [4], [83].
1.3.8. Xác định số lợng các dới nhóm của lympho bào
T [38], [205].
Dùng kỹ thuật miễn dịch hình quang xác định số lợng
TCD3, TCD4, TCD8a, TCD8b. Nguyên lý: các tế bào lympho T có nhiều
loại nh Th, Tc, Ts, TDTH mỗi loại có chức năng đặc hiệu và
đặc trng bởi các dấu ấn miễn dịch riêng (các CD) trên bề
mặt tế bào. Ví dụ, CD3: đặc trng cho các tế bào T9 sau khi
đà đợc hoạt hoá bởi các kháng nguyên đặc hiệu, CD4: đặc
trng cho các tế bào T hỗ trợ, trong khi CD8 đặc trng cho các
tế bào T độc (là những tế bào có chức năng quan trọng
trong miễn dịch chống tế bào ung th và virus)
Đánh giá số lợng các dới nhóm của lympho bào T bằng kỹ
thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong máu ngoại vi và
trong tổ chức lympho. Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào TCD3,
TCD4, TCD8a, TCD8b trong tổng số 100 tế bào. Đánh giá: các tế bào
TCD3 là những tế bào T chín sau khi đợc mẫn cảm với kháng
nguyên đặc hiệu. Phân tử CD3 của các tế bào T chín liên
kết trực tiếp với TCR. Số lợng các tế bào TCD3 tăng tơng ứng với
khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đợc cải
thiện.
Các tế bào TCD4 và TCD8 là các quần thể tế bào gây độc
với virus và các tế bào ung th. Bản thân chúng có thể tiêu

diệt trực tiếp các tế bào ung th và các tế bào nhiễm virus


2
2
(TCD8) hoặc gián tiếp thông qua các cytokin do chúng tiết ra
nh IL2, TNF.
1.3.9. Định lợng các cytokine: IL-2, TNF, INF [38],
[83], [205]
Nguyên lý: các tế bào lympho T sau khi đợc hoạt hoá bởi
kháng nguyên sẽ tăng sinh, biệt hoá để trở thành các tế bào T
mẫn cảm có chức năng loại bỏ kháng nguyên đó. Một trong
những công cụ quan trọng của các tế bào lympho T mẫn cảm
là chất tiết cytokin của chúng. Các cytokin này có tác dụng
trực tiếp loại bỏ kháng nguyên (TNF với tế bào ung th) hoặc
chúng có vai trò khuếch đại dòng thác miễn dịch thông qua
việc kích thích các tế bào T hỗ trợ nh IL2. Bản chất của
cytokin là các protein đợc đặc trng bởi các chuỗi acid amin.
Dùng kỹ thuật ELISA để xác định nồng độ của các cytokin
trong dịch tiết của các tế bào lympho T đợc nuôi cÊy.
- TiÕn hµnh: lÊy tỉ chøc lympho cđa sóc vËt (thờng là
lách, hạch, tuyến ức) nghiền nhỏ ly tâm, rửa trong các dung
dịch đặc hiệu, tách lấy các tế bào lympho khoảng 10 5 tế
bào, các tế bào đợc nuôi cấy trong khoảng 48giờ với PHA
3g/ml.
1.3.10. Một số các phơng pháp nghiên cứu khác:
nghiên cứu đánh giá sự kết hợp tại các receptor của interferon
(binding to interferon receptors), nghiên cứu sàng lọc các chất
đối kháng với IL-1 (screening for interleukin-1 antagonists),
nghiªn cøu øc chÕ enzym chun cđa IL-1 (inhibition of

interleukin-1 converting enzym) [83]
1.4. Các thuốc kích thích miễn dịch đợc sử dụng trên lâm sàng


2
3
C¸c chÊt KTMD cã nhiỊu ngn gèc kh¸c nhau nh sinh
học, hoá học, vi sinh vật, thực vật..., vì thế ngời ta có thể
dựa vào nguồn gốc để phân loại chúng. Mỗi loại chất lại có
cơ chế tác dụng khác nhau nên cũng có thể đợc phân loại
theo cơ chế tác dụng của chúng.
1.4.1. Cơ chế tác dụng của các chất KTMD
Các chất có thể tác động vào một trong các khâu sau:
* Kích thích làm tăng sinh tế bào: tác động để đẩy
nhanh quá trình phân bào ở các tế bào gốc đa năng hay tế
bào gốc đà định hớng dòng bạch cầu hạt, dòng bạch cầu
lympho, dòng bạch cầu đơn nhân ở tủy xơng. Các chất
KTMD có thể tác động đến quá trình biệt hoá và trởng
thành của các tế bào này ở tủy xơng hay tuyến ức [3], [73],
[205].
* Chất KTMD làm tăng cờng hoạt động chức năng của các
tế bào miễn dịch: mỗi loại tế bào có một loại chức năng riêng
khi tế bào đợc hoạt hoá sẽ tham gia vào đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu và không đặc hiệu chống lại các kháng nguyên.
Chức năng đó có thể là khả năng thực bào, chế tiết các yếu
tố tham gia vào ĐƯMD giúp cho quá trình viêm mạnh hơn [3],
[73], [205]...
* Chất KTMD giúp cho các tế bào miễn dịch liên hệ hợp
tác với nhau tốt hơn trong quá trình ĐƯMD: mỗi tế bào dù thực
hiện tốt chức năng nhng giữa chúng không có mối liên hƯ th×

cịng cã thĨ dÉn tíi bƯnh lý vỊ rèi loạn miễn dịch. Thông thờng
mối quan hệ này thông qua các cytokin [3], [73], [205].
1.4.2. Tế bào đích của các chÊt KTMD


2
4
1.4.2.1. Trên đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu:
Miễn dịch không đặc hiệu hay miễn dịch tự nhiên gồm
nhiều thành phần với các cơ chế bảo vệ khác nhau. Các chất
kích thích miễn dịch có thể tác động vào một trong nhiều
khâu để tăng cờng chức phận của các hàng rào miễn dịch
không đặc hiệu này.
- Hàng rào vật lý: gồm da và niêm mạc, có nhiệm vụ che
chắn bề mặt cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật
gây bệnh. Da lành lặn không bị sây sát cản trở sự xâm
nhập của các kháng nguyên. Da gồm nhiều lớp tế bào, trong
đó lớp tế bào ngoài đà bị sừng hoá luôn luôn bong ra và đổi
mới, tạo ra một cản trở vật lý trớc sự xâm nhập của các kháng
nguyên. Niêm mạc tuy chỉ có một lớp tế bào nhng nó đợc bao
phủ một lớp chất nhày. Chất nhày do các tuyến ở dới niêm mạc
tiết ra tạo nên một màng bảo vệ làm cho các kháng nguyên
không xâm nhập thẳng đợc vào tế bào [3], [8], [9], [205].
- Hàng rào hoá học:
Kháng nguyên sau khi đà vợt qua hàng rào vật lý sẽ gặp
hàng rào hoá học ngay bên trong cơ thể. Đó là huyết thanh
có chứa các lysozym, protein phản ứng C, các thành phần của
bổ thể, interferon...Nhiều chất KTMD làm tăng cờng chức
phận bảo vệ này nh bronchovaxom làm tăng sản xuất IFN,
rannitidin và melatoin làm tăng hàm lợng bổ thể [154], [179],

[205].
- Hàng rào tế bào:
Là hàng rào quan trọng và phức tạp nhất. Trên niêm mạc
có nhiều tế bào có khả năng thùc bµo, tham gia trùc tiÕp


2
5
hoặc gián tiếp loại trừ các kháng nguyên lạ là các vi khuẩn,
virus, ký sinh trùng, tế bào ung th. Thành phần của hàng rào
tế bào gồm: bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào,
bạch cầu ái toan, bạch cầu diệt tự nhiên, tế bào nội mô, dỡng
bào.
Nhiều chất kích thích miễn dịch tác động vào các loại
tế bào này làm tăng chức phận của chúng nh: hormon tuyến
ức, c¸c IL, c¸c IFN, c¸c chÊt KTMD cã nguån gèc hoá học, thực
vật [3], [8], [9], [14].
1.4.2.2. Trên đáp ứng miễn dịch đặc hiệu:
Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là trạng thái miễn dịch
xuất hiện khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên. Đáp ứng miễn
dịch này có hai điểm khác cơ bản với miễn dịch không đặc
hiệu là khả năng nhận dạng và trí nhớ về kháng nguyên. Ngời
ta chia đáp ứng miễn dịch đặc hiệu thành đáp ứng miễn
dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào. Miễn dịch
dịch thể giữ vai trò bảo vệ cơ thể thông qua những kháng
thể hoà tan có mặt ở mọi dịch sinh học của cơ thể. Bản
chất của kháng thể là các globulin nên đợc gọi là các globulin
miễn dịch (Ig). Đó là các sản phẩm tiết của các tơng bào, giai
đoạn cuối của quá trình biệt hoá tế bào lympho B. Miễn
dịch tế bào, chủ yếu do tế bào lympho T đảm nhiệm. Các

chất kích thích miễn dịch có thể tác động làm tăng cờng
đáp ứng miễn dịch dịch thể hay đáp ứng miễn dịch tế bào
[3], [8], [9], [73], [205].