Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin as 48 của vi khuẩn enterococcus faecium trong tế bào escherichia coli er2566

Lun vn Thc s Sinh hc

Mở đầu
Hàng năm, trên thế giới và Việt Nam, các vụ ngộ độc thực
phẩm không ngừng gia tăng. Nguyên nhân chính gây ra ngộ độc
thực phẩm đợc xác định là do vi sinh vật gây bệnh và các yếu tố
độc (độc tố nấm hay thuốc trừ sâu có trong rau quả...). Các vi
sinh vật gây bệnh đều có khả năng sinh trởng, phát triển tốt
trong các loại thực phẩm nh thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản
và các sản phẩm sữa. Ngộ độc thực phẩm ảnh hởng trực tiếp
đến sức khỏe và tính mạng con ngời, đồng thời gây tác động
không nhỏ đến nền kinh tế, chính trị của mỗi quốc gia. Chính
vì thế, vấn đề bảo quản lơng thực, thực phẩm luôn đợc đặt lên
hàng đầu trong chính sách kinh tế, sức khỏe cộng đồng của mỗi
quốc gia, đặc biệt là bảo quản tránh khỏi các vi sinh vật gây
bệnh.
Để khắc phục những hạn chế của các phơng pháp bảo quản
thực phẩm truyền thống (bảo quản theo phơng pháp hóa học, vật
lý), các nhà khoa học trên thế giới đà và đang nghiên cứu, ứng
dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi chung là
bacteriocin. Đây là các peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt
an toàn, không gây tác dụng phụ khi sử dụng do bị phân cắt
nhanh chóng bởi protease trong đờng tiêu hóa ở ngời. Nhiều
bacteriocin đà đợc nghiên cứu nhng hiện nay mới có nisin và
pediocin PA-1/AcH đợc thơng mại hóa, sử dụng trong công nghệ
thực phẩm dới dạng bột. Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các
bacteriocin an toàn, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là rất
cần thiết. Enterocin là các bacteriocin đợc tạo ra từ chi vi khuẩn
Enterococcus rất phong phú và đa dạng, có những đặc tính
đáng quan tâm trong chế biến, bảo quản thực phẩm. Điển hình

Page 1 of 116

1


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

lµ enterocin AS-48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ
ức chế rộng cả vi khuẩn gram dơng và gram âm. Những đặc trng khác của AS-48 nh tính ổn định, bền nhiệt và tính tan tiêu
biểu trong phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm)
hứa hẹn là sự lựa chọn thay thế cho các chất bảo quản hóa học
trong tơng lai.
Từ tính u việt của enterocin, đặc biệt là enterocin AS-48
trong bảo quản nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đà nghiên
cứu nhằm thu lợng lớn peptit này với mong muốn sử dụng thành thơng phẩm. Vấn đề gặp phải là các chủng vi khuẩn Enterococcus
có khả năng sinh enterocin thờng tiết ra độc tố. Việc lên men và
thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn sạch để có thể sử dụng trong
thực phẩm gặp nhiều khó khăn và đạt hiệu suất thấp. Do đó,
việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp không những
khắc phục hạn chế trên mà còn chủ động đợc nguồn enterocin.
Enterocin AS-48 hoàn toàn có thể đợc tổng hợp bằng con đờng tái
tổ hợp khi biÕt tr×nh tù ADN cđa gen m· hãa cho AS-48 mà không
cần phải phân lập từ các chủng tự nhiên. Nh vậy, enterocin AS-48
có thể đợc tổng hợp với hiệu suất cao bằng con đờng tái tổ hợp
nhờ vi khuẩn E. coli.
Từ thực trạng trên, chúng tôi đà tiến hành đề tài: Tng hp
v biu hin gen mà hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn
Enterococcus

faecium

trong

tế

bào

Escherichia

coli

ER2566” nh»m mơc ®Ých tỉng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp
để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học.
Công trình này đợc thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Page 2 of 116

2


Lun vn Thc s Sinh hc

chơng 1. Tổng quan tài liƯu
1.1. tỉng quan vỊ Bacteriocin

1.1.1. Giíi thiƯu chung
1.1.1.1. Ngé ®éc thực phẩm
Mặc dù con ngời đà sử dụng những công nghệ bảo quản
thực phẩm mới và an toàn (ví dụ: HACCP - hƯ thèng kiĨm so¸t rđi

ro vỊ vƯ sinh an toàn thực phẩm mang tính phòng ngừa) trong
chế biến và bảo quản nhng các ca ngộ độc thực phẩm vẫn không
ngừng gia tăng Error: Reference source not found. Các hóa chất,
kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus và vi khuẩn đều có thể
gây ngộ độc thực phẩm. Trong đó, vi khuẩn là nguyên nhân
phổ biến nhất với hơn 90% các ca ngộ độc thực phẩm hàng năm,
chủ yếu do Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium
botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria
monocytogenes,

Page 3 of 116

Vibrio

parahaemolyticus,

3

Bacillus

cereus,


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Toxoplasma

gondii

vµ

Escherichia

coli

O157:H7

6.,

Error:

Reference source not found. Trêng hợp nhẹ là những hậu quả về
rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức, trờng hợp
nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị kịp thời,
đúng cách. Do đó, an toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm
hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là bảo quản thực phẩm
phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh 6.. Theo uỷ ban Khoa học
và Công nghệ Hoa Kỳ, ớc tính hàng năm nớc này có khoảng 76
triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra 5000 ca tử vong. Thực phẩm
chính là thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm
sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error: Reference source not
found. Các mầm bệnh thực phẩm nh Listeria spp. có khả năng
chịu nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao, gây ra hơn 2500 vụ
ngộ độc thực phẩm với 500 ca tư vong chØ riªng ë Hoa Kú 12.. ë
ViƯt Nam, hàng năm cũng có hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm,
gây tổn thất về sức khỏe và kinh tế. Trong năm 2008, tính đến
tháng 7, đà có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngời mắc và
43 ngời đà bị tử vong. Bởi vậy, những chất bảo quản thực phẩm
an toàn là vô cùng quan trọng 1., 12..
Cùng với sự gia tăng nhu cầu về những thực phẩm tự nhiên và

an toàn hơn, con ngời cần những công nghệ bảo quản mới để
ngăn ngừa sự h hỏng và nhiễm độc thực phẩm. Các cách truyền
thống đà đợc thay thế bởi những công nghệ mới, cải tiến nh khử
trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp
suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng
khuẩn tự nhiên - các bacteriocin 6., Error: Reference source not
found. Việc sử dụng bacteriocin một mình hoặc kết hợp với xử lý
hoá lý và chất bảo quản hoá học có thể là biện pháp hiệu quả để

Page 4 of 116

4


Lun vn Thc s Sinh hc

đảm bảo hàm lợng dinh dỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm,
kéo dài thời gian bảo quản, kìm hÃm vi khuẩn làm hỏng, gây
bệnh 2..
1.1.1.2. Bacteriocin
Bacteriocin đợc Gratia phát hiện lần đầu tiên năm 1925 với
tên là principe V bắt nguồn từ một chủng

E. coli có khả năng

chống lại các chủng E. coli khác trong cùng môi trờng nuôi cấy.
Thuật ngữ colicin do Gratia và Fredericq đặt ra năm 1946.
Ngày nay, colicin đợc dùng cho protein kháng khuẩn từ các loài E.
coli và có quan hệ gần với Enterobacteriaceae Error: Reference
source not found. Năm 1953, Jacob và CS. đà đặt tên cho các

protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu cao là bacteriocin.
Thuật ngữ bacteriocin đợc giải thích đơn giản. Tơng tự
ase sử dụng trong enzyme, tiếp tố cin dùng để biểu thị hoạt
tính tạo bacteriocin. Tiếp tố cin đợc viết thêm vào tên chi (hay
đúng hơn là tên loài). Colicin đợc phân lập đầu tiên từ E. coli,
monocins từ L. monocytogenes, subtilin đợc tạo ra bởi Bacillus
subtilis, staphylocin từ S. aureus và nhiều loại khác. Các chữ cái
theo thứ tự tìm ra đợc viết sau tên bacteriocin để phân biệt với
bacteriocin duy nhất từ chủng khác cùng loài. Ví dụ, lactacin F là
bacteriocin thứ 6 đợc tìm ra từ loài Lactobacilli 34..
Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả năng tạo ra các hợp chất
khác nhau nhằm hạn chế hoặc chống lại các vi sinh vật khác 44.,
60.. Các hợp chất này đợc biết đến nh kháng sinh, sản phẩm trao
đổi chất thứ cấp nh axit lactic, các yếu tố phân giải nh lysozym,
các dạng exotoxin protein và bacteriocin. Bacteriocin đợc tổng hợp
khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác ®éng cđa m«i trêng

Page 5 of 116

5


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

sèng, c¹nh tranh vỊ ngn dinh dỡng, không gian... Các bacteriocin
có hoạt tính kháng khuẩn cao thËm chÝ ë nång ®é rÊt thÊp 69..
Hä bacteriocin gồm các protein đa dạng về mặt kích thớc, vi
khuẩn đích, dạng hoạt động và cơ chế miễn dịch. Hiện nay, có
hàng trăm loại bacteriocin. Những bacteriocin này đợc tìm thấy
trong hầu hết các vi khuẩn, gần đây còn tìm thấy trong vi

khuẩn cổ - Archaea (gọi là các Archaeocin) 60..
Nhiều nghiên cứu đợc tiến hành với bacteriocin trên các loài
vi khuẩn khác nhau cho thấy chúng đợc mà hóa bởi các gen trên
plasmid (ví dụ, Col plasmid trong E. coli). Một số đợc mà hóa bởi
các gen nằm trên ADN hƯ gen, nh plantaracin A vµ sakacina 674,
trong khi có trờng hợp đợc xác định trên các transposon nh nisin
69..
Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trớc đây, bacteriocin
bị nhầm lẫn nh là các chất kháng sinh. Năm 1965, Reeves và
CS. đà tìm ra sự khác biệt của bacteriocin với các chất kháng sinh
bởi đặc điểm đặc trng: Bacteriocin có bản chất là protein.
Chính sự khác biệt này đà tạo nên đặc tính u việt của
bacteriocin trong ứng dụng bảo quản thực phẩm 34..
Sự tranh luận nên đợc đặt vào bối cảnh khám phá ra nisin
năm 1924, trớc cả penicillin và colicin. Khi đó những chất kháng
khuẩn protein bị xem là các chất kháng sinh. Chất kháng sinh đợc
tạo ra bởi một nhóm hạn chế vi sinh vật, là sản phẩm trao đổi
chất bậc hai. Các chất này không có chức năng rõ ràng trong sinh
trởng và sinh sản của bản thân vi khuẩn, đợc tiết dễ dàng ra khỏi
tế bào 60.. Khi khám phá ra trong cấu tróc nisin cã chøa mét sè
axit amin hiÕm nh de-hydroalanin, dehydrobuterin và cầu lanthion
sulfur đơn, nisin không đợc xem là mét protein bëi riboxom kh«ng

Page 6 of 116

6


Lun vn Thc s Sinh hc

tạo những axit amin này (kể cả những chất tơng đồng với nisin
nh subtilin và epidermin). Chỉ đến khi Hansen và CS. (1990) phát
hiện ra rằng, nisin thực tế đợc tạo ra bởi riboxom qua quá trình
khử nớc các axit amin và sự hình thành cầu lanthion diễn ra sau
dịch mÃ, nisin mới đợc công nhận là một bacteriocin. Sự có mặt
của các gen riêng rẽ trong tổng hợp bacteriocin xác nhận rằng
chúng là protein peptit thực sự. Nh vậy, bacteriocin đợc phân biệt
để tránh sự nhầm lẫn và liên quan tới chất kháng sinh y học - có
thể gây dị ứng bị cấm sử dụng trong thực phẩm đối với con ngời.
Đặc điểm khác biệt chính là: Bacteriocin đợc tổng hợp trong
riboxom, không phải là các chất chuyển hóa. Do có bản chất
protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein nh trypsin,
-chymotrypsin và pepsin) 4. nên bacteriocin không gây tác dụng
phụ do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đờng tiêu
hóa ở ngời. Bacteriocin có phổ kháng khuẩn tơng đối hẹp, đợc
tiết vào môi trờng để ức chế sự sinh trởng của vi khuẩn hay bào
tử, đôi khi tiêu diệt các vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản
xuất. Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin.
Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng
sinh. Các đặc điểm trên đợc tổng kết trong bảng 1 12., Error:
Reference source not found .
Bảng 1. Sự khác nhau giữa bacteriocin và kháng sinh
Các đặc điểm

Bacteriocins

Các kháng sinh

ứng dụng

Thực phẩm

Tổng hợp

Riboxom (sản phẩm chuyển Sản

Hoạt tính

Page 7 of 116

Y häc
phÈm

hãa bËc 1)

chun hãa bËc 2

Phỉ hĐp

Phỉ réng

7


Lun vn Thc s Sinh hc

Miễn dịch tế bào Có

Không

chủ
Sự có mặt của các Có mặt

Vắng mặt

tế bào miễn dịch
trong tế bào chủ
Dạng hoạt động

Hầu hết qua sự hình thành lỗ

Màng tế bào hay

nhng đôi khi cũng tác động lên

các đích nội bào

sự tổng hợp sinh học thành tế
bào
ảnh hởng độc lên tế Không

Có

bào nhân chuẩn

1.1.2. Phân loại bacteriocin
Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm
cấu trúc, khối lợng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất...
56., 59.. Riley và CS. (2007) đà chia bacteriocin thành hai nhóm
lớn theo vi khuẩn gram dơng và gram âm. Bacteriocin của vi

khuẩn gram dơng phong phú và đa dạng hơn ë vi khn gram
©m. Chóng ph©n biƯt víi bacteriocin gram âm theo hai cơ sở.
Thứ nhất, quá trình tạo bacteriocin không cần sự giết chết bản
thân nó nh ở vi khuẩn gram âm. Đây là do cơ chế vận chuyển,
giải phãng bacteriocin ë vi khuÈn gram d¬ng. Mét sè tham gia vào
hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, trong khi một số
khác tham gia vào con đờng vận chuyển phụ thuộc chuỗi tín hiệu
(signal sequences dependent export pathway). Thứ hai, vi khuẩn
gram dơng tạo quá trình điều hòa đặc hiệu bacteriocin, trong

Page 8 of 116

8


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

khi c¸c bacteriocin tõ vi khuẩn gram âm chỉ phụ thuộc vào hệ
thống điều hòa cđa tÕ bµo chđ 60..
1.1.2.1. Bacteriocin tõ vi khn gram âm
Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein
kích thớc lớn. Hơn 30 loại bacteriocin từ E. coli đà đợc xác định.
Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hởng đến quá trình tạo
bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn cha hoàn toàn rõ ràng.
Những hiểu biết này rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các
quần thể vi khuẩn trong môi trờng tự nhiên mà còn để giải quyết
vấn đề ứng dụng 60..
Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm là
colicin với phổ kháng khuẩn hẹp và hoạt động thông qua tơng tác
với thụ thể đặc hiệu màng ngoài của tế bào đích. Colicin có các

cụm gen phân bố trên các plasmid và đợc sắp xếp thành gen
colicin mà hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mà hóa cho
protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản
xuất (bằng cách gắn và bất hoạt protein gây độc) và gen phân
giải mà hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông
qua phân giải tế bào chủ 12., 60.. Sự tạo colicin đợc thông qua
đơn vị điều hòa SOS (SOS regulon - là một dạng phản ứng của vi
khuẩn với sự h hại ADN, trong đó, các gen lexA và recA có vai trò
chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản ứng SOS) 35., 73. và do đó,
nó đợc tạo ra chủ yếu dới những điều kiện ức chế. Colicin tiêu
diệt vi khuẩn qua các cơ chế khác nhau, bằng cách ngăn chặn
tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích do
sự hình thành lỗ hay hoạt hoá hoạt động của nuclease 60..
Phân loại bacteriocin vi khuÈn gram ©m

Page 9 of 116

9


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

C¸c bacteriocin tõ vi khuÈn gram âm đợc đặt tên theo chi,
loài sản xuất, nh klebicin cđa Klebsiella pneumoniae hay theo loµi
nh colicin cđa E. coli, marcescin cđa Serratia marcescens, alveicins
cđa Hafnia alvei vµ cloacins cđa Enterobacter cloacae) 60..
Bacteriocin tõ vi khn gram ©m cã thể đợc phân thành ba nhóm
dựa vào kích thớc: Nhóm 1 - Colicin kÝch thíc lín (25-80 kDa),
nhãm 2 - Các microcin kích thớc nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 Bacteriocin nh phần đuôi của phage gồm các đơn vị lắp ghép
peptit. Trong đó, microcin là những peptit khối lợng phân tử thấp

không cảm ứng SOS, có cấu trúc tơng tự bacteriocin lớp II của vi
khuẩn gram dơng, đợc tổng hợp trong pha cân bằng 42..
Bacteriocin nh đuôi phage là các nuclease và protease kháng vi
khuẩn que, tiêu diệt tế bào nhạy cảm bởi sự khử cực màng. Chúng
là nh÷ng phage thiÕu sãt hay cã nguån gèc tõ phage với chức
năng nh bacteriocin. Ví dụ: Pyocin R2 (từ Pseudomonas spp.) là
một phần thừa của phage P2 trong khi pyocin F2 t¬ng tù nh phage
 60..
1.1.2.2. Bacteriocin tõ vi khuÈn gram dơng
Nisin là đại điện đợc nghiên cứu sớm nhất trong các
bacteriocin vi khuẩn gram dơng. Đây là lantibiotic đợc tạo ra từ
Lactococcus lactis spp. gọi là các chất ức chÕ nhãm N” 59.. HÇu
hÕt bacteriocin tõ vi khuÈn gram dơng là các peptit nhỏ, mang
điện dơng, kỵ nớc hay lỡng tính và thờng không có thụ thể nhận
biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trờng hợp ngoại lệ).
Các bacteriocin này khác nhau ở dạng giải phóng, vận chuyển
trong tế bào và sự phân cắt trình tự dẫn đầu trong quá trình
chế biến tạo phân tử trởng thành 56., 60..
Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram dơng

Page 10 of 116

1
0


Lun vn Thc s Sinh hc

Nhiều nhà khoa học phân loại bacteriocin từ vi khuẩn gram
dơng theo các lớp có một số điểm khác nhau. Dựa trên các kết

quả của Klaenhammer et al. 1993, Kemperman et al. (2003a),
Cotter et al. (2005b) bacteriocin từ vi khuẩn gram dơng đợc
chia thành bèn líp theo h×nh 1:
Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương

Lớp I: các
lantibiotic

Loại A:
mạch dài
dài

Lớp II: các nonlantibiotic, Mr bé
(<10 kDa)

Lớp III: các
protein Mr lớn
(>10 kDa)

Lớp IV: các
peptit vòng

Loại C: đa
thành phần
Loại B:
hình cầu

Phân lớp IIa:
như pediocin

IIc: cịn lại

IIIa: các
lysin

IIIb: khơng
phân gii

IIb: a
thnh phn
AI: nh
nisin

AII: nh
SA-FF22

Hình 1. Sơ đồ phân loại các bacteriocin từ vi khuẩn gram dơng

Lớp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các
peptit bền nhiệt, tác động lên cấu trúc màng (<5 kDa), chứa các
axit amin hiếm, bị biến đổi sau dịch mà nh lanthionin (Lan), methyllanthion, -methyl lanthionin (MeLan), dehydroalanin và
dehydrobutyrin. Lớp I còn đợc phân nhỏ hơn thành các lantibiotic
loại A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn.


Lantibiotic loại A là các peptit có cấu trúc mạch

thẳng kéo dài và linh động. Loại A đợc phân thành hai phân loại
AI và AII dựa trên kích thớc, sự tích điện và trình tự peptit dẫn

Page 11 of 116

1
1


Lun vn Thc s Sinh hc

đầu. Ví dụ: nisin thuộc phân loại AI, streptococcin A-FF22 (SAFF22) tạo ra bởi S. pyogenes chủng FF22 thuộc phân loại AII.
Lantibiotic loại B là các peptit có hình cầu và kém



linh động so với loại A, thờng không mang điện hay mang điện
âm ở pH trung tính. Hoạt động kháng khuẩn dựa trên sự can
thiệp những phản ứng enzyme thiết yếu của các tế bào nhạy
cảm. Mersacidin đại diện cho loại này là peptit gồm 20 axit amin.
Lantibiotic loại C là các lantibiotic đa thành phần,



chủ yếu cấu tạo gồm hai peptit biến đổi sau dịch mÃ. Trong đó,
mỗi peptit có một ít hay không có hoạt tính kháng khuẩn nhng
chúng có vai trò điều phối, nghĩa là chỉ khi kết hợp hai peptit mới
tạo phân tử bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Ví dô lactacin
3147 tõ Lactococcus lactis DP3147 gåm hai peptit LtnA1 và LtnA2
34..
Lớp II - Bacteriocin <10kDa gồm các bacteriocin peptit đa
dạng về khối lợng phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông
thờng (non-lantibiotic). Đây là lớp đợc các nhà khoa học tập trung

nghiên cứu nhất 60.. Những peptit này đợc chia thành ba phân
lớp là:


Phân lớp IIa gồm các bacteriocin với cấu trúc tơng tự

nh pediocin- có một trình tự liên ứng đầu N của bacteriocin hoàn
chỉnh - Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys. Phân lớp này đợc tập trung
nghiên cứu nhiều do hoạt tính diệt mầm bệnh L. monocytogenes
hiệu quả. Ví dụ: pediocin PA-1, mét peptit 44 axit amin tõ
Pediococcus acidilactici 17. .


Phân lớp IIblà bacteriocin nhiều thành phần cũng t-

ơng tự nh ë lantibiotic lo¹i C. VÝ dơ, lactococcin G tõ L. lactis. Mặc
dù rất hiếm gặp nhng cũng có những bacteriocin ba hay bèn

Page 12 of 116

1
2


Lun vn Thc s Sinh hc

thành phần. Ví dụ: SLUSH -hemolysin tõ Staphylococcus
lugdunensis, lµ bacteriocin ba peptit; aureocin A70 tõ S. aureus
gồm bốn peptit.

Phân lớp IIc là các bacteriocin còn lại của lớp này nh

bacteriocin tiết ra bởi con đờng phụ thuộc chuỗi tín hiệu. Ví dụ:
Sakacin Q.
Lớp III - Bacteriocin kích thớc lớn >10kDa là các protein
không bền nhiệt, trừ propionicin SM1 từ Propinonibacterium
jensenii. Do đó, lớp này ít đợc ứng dụng trong thực phẩm 60.. Có
thể chia thành hai phân lớp, đầu tiên là bacteriolysin (các enzyme
bacteriolytic) tiêu diệt các chủng nhạy cảm bằng cách phân giải tế
bào, vÝ dơ : lysostaphin tõ Staphylococcus simulans biovar
staphylolyticus. Ph©n líp thø hai là các protein kháng khuẩn không
phân giải, phải kể đến đầu tiên là helveticin J, một bacteriocin
37 kDa từ Lactobacillus helveticus.
lớp IV - Các bacteriocin vòng là lớp đặc biệt gồm các
bacteriocin có cấu trúc vòng (Bảng 2). Đây là các peptit đợc biến
đổi sau dịch mà bằng liên kết cộng hoá trị nội phân tử tạo cấu
trúc vòng cho peptit trởng thành. Đến nay, lớp này gồm một số
thành viên nh enterocin AS-48, circularin A, gassericin A đợc
tổng kết ở bảng 2 60., 63..
Bảng 2. Các bacteriocin vòng tạo ra từ vi khuẩn gram dơng
Bacteriocin

Nguồn gốc

Kích thớc (axit
amin)

Đặc điểm đặc trng

1. Enterocin
AS-48

Enterococcus
faecalis

70

- Dạng chuẩn và là bacteriocin vòng biết rõ
nhất cả về hóa sinh và di truyền

2. Gassericin
A

Lactobacillus
gasseri LA39

58

- Bacteriocin vòng đầu tiên đợc báo cáo
chứa hỗn hợp D và L-axit amin (ít nhất D-Ala)

Page 13 of 116

1
3


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

3. Reutericin
6

Lactobacillus
reuteri LA6

58

- Tr×nh tù axit amin bậc nhất tơng tự nh
gassericin A nhng khác biệt ở phổ ức chế do
thành phần thay đổi D-Ala (tỷ lệ của DAla:L-Ala)

4. Circularin
A

Clostridium
beijerinckii
ATCC 25752

69

- Có quá trình cải biến sau dịch mà khác thờng; locus gen (cir) chứa các gen cùng nguồn
gốc với các gen đợc tìm thấy trong locus của
as-48

5.
Butyrivibrioci
n AR10

Butyrivibrio

fibrisolvens
AR10

58

- Bacteriocin vòng đầu tiên đợc phân lập từ
vi khuẩn dạ cỏ, tơng đồng 45% với gassericin
A

6. Uberolysin

Streptococcus
uberis 42

70

- Từ chi Streptococcus, đáng chú ý do tính
không bền nhiệt và chỉ phân giải các tế bào
sinh trởng nhanh

7. Acidocin B

Lactobacillus
acidophilus
M46

58

- Bacteriocin có trình tự tơng tự gassericin
A, gen mà hóa (acdB) ở trên một plasmid của

chủng sản xuất

8. Subtilosin
A

Bacillus subtilis

35

- Bacteriocin vòng mang điện âm, tác
động lên cả vi khuẩn gram dơng và gram
âm, đáng chú ý ở khả năng chống chịu các
điều kiện ức chế

1.1.3. ứng dụng của bacteriocin
Đối với vi sinh vật, bacteriocin là phơng thức để cạnh tranh
dinh dỡng và không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh
thái vi sinh vật 69.. §èi víi con ngêi, bacteriocin cịng cã vai trß
quan träng. Những ứng dụng tiềm năng của bacteriocin gồm:
1.1.3.1.

Bảo quản sinh học thực phẩm

Trớc đây bảo quản thực phẩm dựa trên việc sử dụng các
chất phụ gia tổng hợp hóa học. Điều này khiến ngời tiêu dùng lo
ngại do những ảnh hởng có hại đến sức khỏe. Bảo quản sinh học
thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng (giống bảo
vệ) hay các sản phẩm trao đổi của chúng (chất bảo quản sinh
học) để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là

Page 14 of 116

1
4


Lun vn Thc s Sinh hc

giải pháp có nhiều tiềm năng 56.. u điểm của bacteriocin trong
bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự
truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tÕ do h
háng thùc phÈm, h¹n chÕ sư dơng chất bảo quản hóa học cũng nh
những xử lý nhiệt khắt khe. Bacteriocin giúp bảo quản giá trị
dinh dỡng và vitamin, cung cấp những thực phẩm mới (ít axit, hàm
lợng muối thấp và hàm lợng nớc cao) thỏa mÃn nhu cầu công nghiệp
và ngời tiêu dùng Error: Reference source not found, 44.. Mét xu híng trong c«ng nghiƯp thùc phÈm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng
chất phụ gia và thành phần nhân tạo, hạn chế sự chế biến nhng
phải đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lợng. Những yêu cầu này
có thể đợc đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin 30., 34..
Bacteriocin có các đặc điểm lý tởng trong bảo quản sinh
học thực phẩm. Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ
chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng. Các bacteriocin
đợc xem là hợp chất an toàn do bị phân giải nh những protein
khác trong thức ăn 56.. Bacteriocin không mùi, không màu, không
vị, ảnh hởng không đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đờng ruột, có
phổ kháng khuẩn tơng đối rộng lên nhiều mầm bệnh và vi khuẩn
gây hỏng thực phẩm 30.. Một số bacteriocin cho thấy hiệu quả
bổ trợ khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác nh hợp
chất phenolic tự nhiên cũng nh những protein kháng khuẩn khác.
Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngừa sự

phát triển của những chủng kháng. Ngoài ra, sự kết hợp
bacteriocin với xử lý vật lý nh áp suất cao hay xung điện trờng
giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với những
dạng có khả năng sèng sãt cao nh vi khn sinh bµo tư. TÝnh hiệu
quả của bacteriocin thờng bị ảnh hởng bởi các yếu tè m«i trêng

Page 15 of 116

1
5


Lun vn Thc s Sinh hc

nh pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng nh vi
khuẩn thực phẩm. Thực phẩm phải đợc xem nh là hệ sinh thái mà
các tơng tác vi khuẩn có thể ảnh hởng lớn đến cân bằng vi sinh
vật và sự phát triển những vi khuẩn có lợi hay gây hại. Do đó, cần
xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm
34..
Các bacteriocin đợc sử dụng trong bảo quản sinh häc thùc
phÈm díi ba d¹ng chÝnh: 12..
- đ thùc phÈm với giống bảo vệ (thờng là vi khuẩn lactic - LAB:
Lactic axit bacteria) để tạo bacteriocin in situ. Trong trờng hợp
này, khả năng LAB sinh trởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là
quyết định.
- Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế nh là các chất bảo
quản thực phẩm.
- Sử dụng bán thành phẩm lên men trớc đó với một chủng sinh
bacteriocin nh là một thành phần trong quá tr×nh chÕ biÕn thùc

phÈm Error: Reference source not found.
Mét lùa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng
màng polythen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm
12..
1.1.3.2.

Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

Do nisin có khả năng ức chế phổ rộng các vi khuẩn gram dơng nên đợc sử dụng trong ngăn ngừa chứng viêm vú ở gia súc.
Hiện nay, mutacin từ cầu khuẩn

thuộc các chủng của

Streptococcus mutans biến đổi di truyền đợc sử dụng trong sản
phẩm chăm sóc sức khỏe răng miệng nh kem đánh răng, nớc súc

Page 16 of 116

1
6


Lun vn Thc s Sinh hc

miệng để ức chế sâu răng và cao răng. Bacteriocin có trong xà
phòng, mỹ phẩm giúp loại trừ mụn, trứng cá 34., 52..
Các bacteriocin gần đây cũng đợc ứng dụng trong lĩnh vực
y tế. Do vi sinh vật đang tăng dần tính kháng kháng sinh nên các
liệu pháp trong điều trị chống lại bệnh nhiễm trùng sẽ trở nên vô
hiệu. Bacteriocin có thể là một giải pháp cho trình trạng này, giúp

điều trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc
56.. Chúng cã thĨ øc chÕ sù sinh trëng cđa vi khn với u điểm:
Sản phẩm tự nhiên, từ vi khuẩn tốt và không có rủi ro nhiễm
bệnh hay các vấn đề khác. Các chủng probiotic và các chủng tạo
bacteriocin có khả năng bảo vệ đờng tiêu hóa chống lại vi khuẩn
gây bệnh 12., 34..
1.1.3.3.

Các giống khởi động

Giống khởi động (Starter cultures) là các sản phẩm công
nghiệp mà bản thân tế bào vi sinh vật đợc sử dụng làm nguyên
liệu cấy. Thông thờng giống khởi động là hỗn hợp các loài vi sinh
vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm đặc trng, làm giảm độ pH,
ngăn cản sự phát triển của vi khn cã h¹i trong thùc phÈm. Khi sư
dơng nh là một giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải thực
hiện lên men tối u, ngoài ra phải tạo lợng bacteriocin đủ khả năng
bảo vệ. ở một số trờng hợp, sự tạo bacteriocin có thể giúp tăng
tính cạnh tranh và ổn định giống nhng không đợc can thiệp
đến chức năng của giống khởi động ban đầu. Do đó, giống khởi
động phải kháng với bacteriocin. Chúng đợc tạo ra qua quá trình
chọn lọc các thể đột biến kháng tự nhiên, bằng nuôi cấy phụ lặp
lại với việc tăng nồng độ bacteriocin để chọn lọc các giống thích
nghi hay bằng biến đổi gen. VÝ dơ, sù nu«i cÊy mét chđng
Enterococcus sinh enterocin AS-48 nh là giống đồng nuôi cấy kết

Page 17 of 116

1
7

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

hỵp víi mét gièng khëi động thơng mại trong sản xuất phomat
không ảnh hởng đến sự sinh trởng của giống khởi động hay đặc
tính hóa sinh của phomat tạo ra. Đồng thời bacteriocin đợc tạo ra
trong phomat đủ đảm bảo ức chế Bacillus cereus Error:
Reference source not found, 34..
Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đà tạo ra các giống khởi động tái tổ
hợp chứa gen miễn dịch và gen tạo bacteriocin. Các gen này nằm
trên một đoạn ADN cụ thể, đợc cài vào vector nhân dòng và
chuyển vào các giống khởi động. Chúng có thể đợc đa vào giống
khởi động trong sữa và trong sản xuất các thực phẩm lên men
khác để ức chế sự sinh trởng của mầm bệnh in situ và tăng thời
hạn sử dụng; vào nấm men để ức chế các vi khuẩn gây hỏng
lactic... 34..
1.1.3.4.

Các probiotic

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic
tăng lên nhanh chóng. Nhiều sản phẩm probiotic đà xuất hiện trên
thị trờng dới dạng các loại sản phẩm đa dạng nh viên bọc, bột, sữa
chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác. Thuật ngữ probiotic
bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống. Theo đó,
probiotic là: Những vi sinh vật sống mà khi đa vào cơ thể một lợng đủ lớn sẽ tác động có lợi cho sức khỏe của vật chủ Error:
Reference source not found. Vi sinh vËt sư dơng cho các sản phẩm
probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB). Ví dụ,
Lactobacillus acidophilus là LAB lên men đồng hình đợc tìm thấy

trong đờng tiêu hoá của ngời và động vật. Chúng đợc bổ sung
vào các sản phẩm sữa lên men thơng mại nh sữa chua
acidophilus. Những vi khuẩn này có ảnh hởng tích cực lên sức
khoẻ con ngời nhờ khả năng sinh bacteriocin - giúp ức chế hay tiªu

Page 18 of 116

1
8


Lun vn Thc s Sinh hc

diệt các vi khuẩn gây bệnh. Các bacteriocin từ L. acidophilus và L.
gasseri có tác dụng kích thích hoạt động của hệ thống miễn
dịch, bất hoạt các hợp chất gây đột biến và ung th tiềm năng,
giảm cholesterol trong máu. Probiotic từ LAB hiệu quả trong ngăn
ngừa sự rối loạn đờng ruột và điều trị tiêu chảy do các nguyên
nhân khác nhau. Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi
sinh vật bản xứ cũng nh hệ vi khuẩn đờng ruột gây bệnh 31.,
34..
1.1.3.5.

Các dấu chuẩn

tạo vector tách dòng trong thực

phẩm
Các

gen

kháng

kháng

sinh

(kanamycin,

erythromycin,

tetracyclin,) đợc sử dơng phỉ biÕn nh lµ dÊu chn chän läc
trong vector tách dòng. Với mục đích khoa học, các gen kháng
kháng sinh dùng là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc những thể
biến nạp 69., 73.. Tuy nhiên, các dấu chuẩn này không đợc chấp
nhận trong thao tác với giống khởi động bởi lo ngại chúng có thể
truyền tính kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn đờng ruột. Do đó,
các gen kháng bacteriocin có thể đợc sử dụng nh là dấu chuẩn
chọn lọc thay thế, tạo vector tách dòng an toàn trong thùc phÈm
34.. T¬ng tù nh dÊu chuÈn chän läc kháng sinh, chúng có thể đợc
truyền và chọn lọc trong tế bào nhạy cảm với các yếu tố chọn lọc
(bacteriocin) hay thiếu khả năng chuyển hóa yếu tố sử dụng chọn
lọc (khả năng sử dụng hydrat cacbon) 69.. Ví dụ, gen miễn dịch
lafI kháng lactacin F dùng cho các chủng Lactobacillus - nhạy cảm
với lactacin F. Gen miễn dịch ltnI kh¸ng lacticin 3147 tõ L. lactis,
gen kh¸ng nisin... 69., 73..

Page 19 of 116

1
9


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Đường tiêu hóa
của người

Thuốc chữa bệnh

Các probiotic
Tinh sạch
LAB

Giống khởi
động hay
đồng nuôi cấy

Bacteriocin

Chất phụ gia
(Nisin)
Thực phẩm

An ton v cht lng
thc phm

Hình 2. Các ứng dụng của bacteriocin

1.1.4. Các bacteriocin thơng mại
Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và
chất lợng của thực phẩm đà thôi thúc các nhà khoa học khám phá
và phát triển phơng pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc
biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các
bacteriocin trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm. Có thể
do yêu cầu khắt khe đối với một sản phẩm bảo quản sinh học an
toàn cũng nh những quan điểm trái ngợc về những giống khởi
động cải biến di truyền trong thực phẩm. Tuy nhiên, khi ngời tiêu
dùng cần những sản phẩm đợc bảo quản, ít bị chế biến, việc sử
dụng bacteriocin có thể trở nên phổ biến hơn, nh là một phơng
tiện giúp bảo quản thực phẩm tự nhiên 20.. Dới đây là một số
tiêu chuẩn đặt ra cho sản phẩm bacteiocin ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm:
-Về tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải có dạng GRAS
(Generally regarded as safe - đợc đánh giá là những vi sinh vËt an

Page 20 of 116

2
0


Lun vn Thc s Sinh hc

toàn), phải đợc thử nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe
qua quá trình xác định các mặt nh ảnh hởng tích lũy, điều phối
và tiềm tàng 69..
-Tính hiệu quả: Bacteriocin phải ức chế sự sinh trởng lên
phổ rộng các mầm bệnh và vi khuẩn gây hỏng nh L.

monocytogenes và C. botulinum hay có hoạt tính chống lại một
mầm bệnh đặc hiệu. Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính
cao khi kết hợp trong thực phẩm. Tất nhiên, bacteriocin cũng
không đợc ức chế sinh trởng của các giống khởi động khác 12.,
44..
Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin đợc thơng mại là nisin từ
Lactococcus

lactis

và

pediocin

PA-1/AcH

từ

Pediococcus

acidilactici, chúng đều đợc sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thơng mại tơng ứng là
NisaplinTM, ALTATM 12..
Nisin đợc khám phá ra đầu tiên với mong muốn ứng dụng
trong công nghệ trị liệu. Tuy nhiên những nghiên cứu sau đó cho
thấy nisin không bền ở pH sinh lý và tính nhạy cảm cao với sự
phân hủy của enzyme. Với khả năng ức chế các mầm bệnh (đặc
biệt là L. monocytogenes) giúp nisin phù hợp hơn trong công
nghiệp thực phẩm. Nisin đợc thơng mại đầu tiên ở Anh năm 1953.
Ngày nay, nisin là một sản phẩm đợc FDA phê chuẩn, đợc WHO

công nhận an toàn 69. và bán dới dạng bột sấy khô - từ sữa tách
bơ qua quá trình lên men. Nisaplin đợc sử dụng hơn 50 níc nh lµ
mét chÊt phơ gia thùc phÈm, chđ yếu trong chế biến phomat, sản
phẩm sữa và thực phẩm ®ãng hép 12..

Page 21 of 116

2
1


Lun vn Thc s Sinh hc

Pediocin PA-1 đà đợc thơng mại và kiểm soát bởi một số hÃng
độc quyền Hoa Kỳ và Châu âu. Quá trình lên men tạo pediocin
PA-1 đà sẵn sằng để thơng mại và đợc sử dụng nh là một chất
bảo quản thực phẩm Error: Reference source not found.
C¸c bacteriocin kh¸c nh lacticin 3147, enterocin AS-48 hay
variacin cũng có nhiều triển vọng. Trong khi đó, các bacteriocin
phổ hẹp có thể đợc dùng trong ức chế lựa chọn đặc hiệu cao với
vi khuẩn gây hại nguy hiểm nh L. monocytogenes 34..
1.2. enterocin

1.2.1.

Enterocin

1.2.1.1.

Giới thiệu enterocin

Đa số các chủng của Enterococci có khả năng tạo bacteriocin.
Chúng đợc gọi là các enterocin hay enterococcin và hầu hết thuộc
về lớp II. Hầu hết các enterocin đợc tinh chế và xác định di
truyền nhiều năm nay đều từ E. faecalis và E. faecium 52.. Điều
thú vị là enterocin có khả năng chống lại các Enterococci khác,
LAB, L. monocytogenes, S. aureus và Clostridium spp. (gồm C.
botulinum, C. perfringens và C. tyrobutyricum) 57.. Hoạt tính
kháng Listeria có thể đợc giải thích bởi thực tế rằng Enterococci
và Listeria có quan hệ gần về mặt phát sinh Error: Reference
source not found. Enterocin cã tÝnh bỊn víi nhiƯt độ cao và sự
dao động pH 26..
Enterocin là các peptit nhỏ đợc tổng hợp trong riboxom,
không bị biến đổi sau dịch mÃ, trừ việc phân cắt peptit dẫn
đầu. Những nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định liệu
enterocin đợc mà hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay ADN

Page 22 of 116

2
2


Lun vn Thc s Sinh hc

plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho việc
tinh sạch, nhân dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57..
1.2.1.2.

Phân loại enterocin

Các enterocin có thể đợc phân chia thành hai lớp chính:
Lớp I: Lantibiotic với duy nhất một đại diện là cytolysin hai
peptit từ E. faecalis 27.. Đây là peptit duy nhất đợc phân lập từ
Enterococci với hoạt tính cytolytic (hemolytic-tiêu máu). Cytolysin
là một yếu tố độc nên nó không đợc xem là yếu tố kháng khuẩn.
Các gen mà hóa cho cytolysin đợc tìm thấy không chỉ trong các
chủng Enterococcus từ bệnh viện, ngời bệnh mà còn từ thực
phẩm, động vật 42., 52..
Lớp II gồm các enterocin tơng tự với bateriocin từ các chi LAB
khác 23., là bacteriocin kích thớc nhỏ, mang điện dơng, kỵ nớc,
bền nhiệt. Lớp này có thể đợc chia thành các phân lớp 27., 34.:
Phân lớp IIa - tơng tự pediocin. Chóng bao gåm enterocin A
tõ E. faecium CTC 492, enterocin CCM 4231 tõ E. faecium CCM
4231, enterocin CRL35 tõ E. faecium CRL35 và mundticin từ E.
mundtii. Nhiều loại E. mundtii khác cũng tạo bacteriocin nhng cấu
trúc của chúng cha đợc xác định. Những bacteriocin phân lớp IIa
này có hoạt tính kháng khuẩn cao, điển hình là Listeria. Đặc
biệt, enterocin CRL35 có hoạt tính ức chế thậm chí cả virus
Herpes simplex 18., 27..
Phân lớp IIb là các enterocin gồm hai chuỗi polypeptit. Một
trong hai chuỗi có hoạt tính nhng cả hai chuỗi đều cần thiết
trong sự tạo hoạt tính sinh học đầy đủ 27.. Enterocin 1071A và
1071B từ E. faecalis, enterocin L50A và L50B với hoạt động điều
phối. Chúng không bị biến đổi sau dịch mà và không cần sự cã

Page 23 of 116

2
3

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

mỈt cđa mét peptit tÝn hiệu cho quá trình tiết Error: Reference
source not found, enterocin I (tơng tự enterocin L50A).
Phân lớp IIc gồm bacteriocin không thuộc các phân lớp trên,
nh enterocin P từ E. faecium P13, bacteriocin 31 tõ E. faecalis tiÕt
ra bëi con ®êng phụ thuộc chuỗi tín hiệu, enterocin Q, enterocin
M (một biến thể của enterocin P), enterocin B.
Phân lớp cuối cùng là bacteriocin vòng với đại diện enterocin
AS-48, đây là bacteriocin đầu tiên đợc tinh sạch từ chi
Enterococcus 27., 42., 52., 57., 67..
1.2.2.

Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp enterocin: Enterococci

1.2.2.1.

Enterococci

Enterococci lần đầu tiên đợc miêu tả bởi Thiercelin năm
1899, là một chi lớn thuộc họ LAB 12., 23.. Enterococci gồm các
cầu khuẩn gram dơng, kỵ khí tùy tiện, thờng tồn tại dới dạng cặp
và chuỗi, lên men đồng hình và tạo L(+)LA (axit lactic đồng
phân hình học dạng L). Đây là quá trình lên men hydrat cacbon
thành axit lactic nh là sản phẩm cuối cùng duy nhất, phân biệt với
lên men dị hình (axit lactic là sản phẩm chính, ngoài ra còn các
sản phẩm phụ nh axit axetic, ethanol, CO2, format hay succinat)
12., 59., 67.. Enterococci phân bố rất rộng rÃi, đợc tìm thấy trong

không khí, nớc, chất thải, đất, thực vật. Enterococci có nguồn gốc
từ đờng tiêu hóa của ngời và động vật máu nóng 42..
Nguyên nhân chính giải thích cho sự phân bố rộng rÃi trong
tự nhiên của Enterococci so với các LAB khác đó là sự sống bền bỉ
và chống chịu tốt trong các môi trờng đa dạng, các yếu tố ức chế
sinh trởng nh axit, muối, khô hạn, nhiệt và các yếu tố hóa học.
Chúng sinh trởng ở nhiƯt ®é tõ 10-45oC, sèng sãt ë nhiƯt ®é

Page 24 of 116

2
4


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

62,8oC trong 30 phót, nång ®é 6,5% NaCl vµ 40% muèi mËt, sinh
trëng ë pH 4,0-9,6, do đó cạnh tranh hiệu quả về dinh dỡng và
không gian sống 23., 42..
Trong thời gian dài, sự có mặt của Enterococci trong thực
phẩm bị xem nh là một chỉ thị của sự vệ sinh kém. Nhng ngày
nay, Enterococci đợc xem nh bình thờng trong hệ vi khuẩn thực
phẩm bởi chúng có vai trò quan trọng giúp làm chín và tạo mùi vị
trong các thực phẩm lên men 42.. Sự phân bố đa dạng và hoạt
động của Enterococci đà kích thích nghiên cứu của các nhà khoa
học. Nhiều nghiên cứu gần đây đà tập trung vào sự xác định chi
tiết và mô tả nhóm thú vị này của vi sinh vật 42., 61..
Sự xác định Enterococci có thể đợc tiến hành bằng cách sử
dụng các thử nghiệm sinh lý. Tuy nhiên, một số chủng với các đặc
điểm không điển hình có thể bị nhầm lẫn ở mức độ loài, thËm

chÝ ë møc ®é chi víi Lactococci hay Vagococcus fluvialis. Do đó,
các phơng pháp di truyền là cần thiết để xác định tin cậy
những thành viên của chi Enterococcus 23., nh nghiên cứu lai
ADN: ADN và sự tơng đồng trình tự gen rARN 16S. Hiện nay, các
nhà khoa học đà xác định đợc hơn 26 loài Enterococcus, phân
thành 8 nhóm loài dựa trên quan hệ phát sinh loài (tổng hợp ở
bảng 3) [Error: Reference source not found, 44.]. Trong đó, E.
faecalis vµ E. faecium lµ hai loµi chiÕm u thÕ, có vai trò quan
trọng trong vi sinh y học và thực phẩm 23., 42., 44.].

Bảng 3. Các nhóm loài khác nhau của Enterococci hiện
nay và các loài dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại

Page 25 of 116

2
5