CHƯƠNG I - CÁC KỸ THUẬT CHÍNH CỦA docx

CHƯƠNG I - CÁC KỸ THUẬT CHÍNH CỦA
CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI
BÀI 1
CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
Công nghệ DNA tái tổ hợp, còn được gọi là
nhân dòng gen hay nhân dòng phân tử, là
một khái niệm bao quát gồm một số quy trình
thí nghiệm dẫn đến việc chuyển thông tin di
truyền (DNA) từ sinh vật này sang sinh vật
khác.
THẾ NÀO LÀ DNA TÁI TỔ HỢP
I. THU NHẬN GEN

Vào năm 1969, Becwitt, Shapiro đã thông
báo về công trình tách gen từ operon lactose
của E. coli dựa trên cơ sở kết hợp các
phương pháp di truyền vi sinh cổ điển với
các phương pháp vật lý để tách và lai các
phân tử DNA.

Có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật tái
tổ hợp DNA bằng ba phương pháp khác
nhau.
1.Tách đọan ADN chứa gen từ bộ gen:

Toàn bộ DNA được tách ra những đoạn nhỏ có
chiều dài 15.000 – 20.000 cặp base bằng phương
pháp lắc cơ học hay bằng enzyme cắt hạn chế. Sau
đó gắn vào các vector mang gen tạo thành plasmid
tái tổ hợp.


Phương pháp này thường cho các đoạn DNA có
kích thước khác nhau và không xác định chính xác
đoạn DNA ta mong muốn. Tuy nhiên phương pháp
này vẫn đựơc dùng trong việc tạo ra thư viện gen
hay ngân hàng gen.
2.Tổng hợp bằng phương pháp hóa học

Bằng hiểu biết về trình tự và sự sắp xếp các
nucleotide trên gen, các acid amin trong
chuỗi polypeptide mà người ta có thể tổng
hợp đựơc các đoạn gen mong muốn bằng
phương pháp hóa học.
3.Sinh tổng hợp gen từ mARN tương ứng

Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào khả
năng hoạt động của enzyme phiên mã
ngược.

Enzyme này có khả năng tổng hợp nên DNA
một mạch (cDNA – complementary DNA) từ
khuôn mARN hoặc cũng có thể từ một đoạn
polyribonucleotide thu nhận đựơc từ quá
trình tổng hợp hoá học.
II. VECTOR TÁCH DÒNG
Vector tách dòng (cloning vector) gồm nhiều
loại như plasmid, phage, cosmid, virus,
….Mỗi loại vector tách dòng có những ưu,
nhược điểm nhất định. Tùy thuộc kích thước
của gen tách dòng và đặc điểm của loại tế
bào chủ để chọn loại vector tách dòng thích

hợp.
1. Các vector đối với E.coli

Các vector tách dòng đơn giản nhất, được
sử dụng rộng rãi nhất là dựa trên các
plasmid vi khuẩn. Một lượng lớn các vector
plasmid khác nhau có thể sử dụng cho
E.coli.

Ưu điểm của các vector này là: dễ làm sạch,
hiệu quả biến nạp cao, các marker chọn lọc
thuận tiện cho biến nạp và tái tổ hợp, có khả
năng tách dòng các mẫu DNA lớn tới 5kb.
PLASMID
2. Vector đối với nấm men và các nấm khác:

Nấm men S.cerevisiae là một trong những
cơ thể quan trọng nhất trong công nghệ sinh
học.
3.Vector đối với thực vật bậc cao:
* Vector tách dòng là vi khuẩn A. tumefaciens:

A. tumefaciens là VK Gram (-), tạo nên các nốt
sần trên cây trồng khi bị nhiễm.

Việc tạo nên các nốt sần chính là kết quả của
việc chuyển đoạn T-DNA của plasmid Ti vào bộ
gen tế bào thực vật.
* Vector tách dòng là virus Cauliflower mosaic:
Hầu hết virus thực vật là virus RNA nên rất khó

biến nạp, chỉ có Geminvirus và Caulimovirus
(CaMV) là virus DNA.
4. Vector đối với tế bào động vật có vú:
* Vector dựa trên SV40:
- SV40 (Simian virus) có khả năng gây nhiễm
một số loài động vật có vú.
- Bộ gen của SV40 nhỏ (khoảng 5,2kb) và chỉ
dung hợp được vài trăm nucleotide.
* Vector virus khác của động vật có vú:
Bovine papilloma virus (BPV) chủ yếu gây ra
mụn cóc trên bò nhưng cũng gây nhiễm trên
các loài khác. Trong các tế bào chuột, BPV
có nhiều bản sao 100 phân tử/tế bào.
III. ENZYME GIỚI HẠN VÀ MỘT SỐ
ENZYME THƯỜNG DÙNG
1. Enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn (Restriction enzyme – RE) có
đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài. Số
lượng và kích thước đọan cắt dài hay ngắn
tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên
phân tử DNA.

Mỗi dòng tế bào và vi khuẩn đều có hệ thống
enzyme cắt hạn chế chuyên biệt, các
enzyme này có khả năng phân biệt DNA của
mình và đoạn DNA lạ, do đó nó không cắt
DNA của chính mình hay DNA đã thích nghi
với tế bào.
a.Tên gọi các enzyme:
Tên enzyme Chi, loài Giống Chủng Thứ tự

dòng
EcoRI Escherichia coli Ry13 I
SmaI Serratia martesens I
HaeIII Hemophylus aegypticus III
b. Các loại enzyme giới hạn:
Hiện nay có hàng nghìn enzyme giới hạn được
ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận
biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 6
cặp nucleotide người ta chia enzyme giới
hạn làm 3 loại:

Loại thứ nhất:

Loại thứ hai:

Loại thứ ba:
c.Các kiểu cắt của enzyme giới hạn:

Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc
hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định.
Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu
bằng và cắt tạo đầu so le.
–
Cắt tạo đầu bằng (Blunt ends): một số RE cắt 2 mạch
DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ
không có khả năng tự kết hợp trở lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzyme T4 ligase.
–
Cắt tạo đầu dính (cohesive ends): ở một số RE, vị trí
cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này,

các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.

Đoạn ADN lạ và vector khi được cắt bởi cùng
một lọai enzyme cắt hạn chế sẽ có thể nối lại với
nhau nhờ enzyme nối Ligase

Người ta sử dụng tính chất này để cắt và ghép
gen.
2. Một số enzyme thường sử dụng
trong kỹ thuật gen
a. Enzyme polymerase: Là các enzyme xúc tác
quá trình tái bản DNA, phiên mã tổng hợp
RNA.
- Enzyme DNA polymerase I (pol I)
- Enzyme T
4
DNA polymerase
- Enzyme Taq polymerase
- Enzyme RNA polymerase
b. Enzyme DNA ligase:
Enzyme ligase là các enzyme xúc tác hình
thành các liên kết, nối 2 đoạn acid nucleic với
nhau.
- Enzyme T4 DNA ligase:
- Enzyme T4 RNA ligase: