Chuyên Đề Sinh Học Phân Tử - Kỹ Thuật Array.docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN
INH HỌC PHÂN TỬ CƠ SỞ DƯỢC

Tên chuyên đề:

Kỹ thuật ADN Array

Học viên TH: Phạm Đoàn Bảo Châu
Trần Duy Cường
Phan Thị Diệp
Lớp: 22MDS1A

 2023 


MỤC LỤC
Danh mục từ viết tắt

1

Tóm tắt
CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN

2
4
5

II.1. DNA

II.2. ARN
II.2.1. Protein
II.2.2. Microarrays
II.2.2.1. Chất nền
II.2.2.2. Chế tạo
CHƯƠNG III. NỘI DUNG
III.1. DNA microarray
III.2. Cơ chế hoạt động
III.3. Phát hiện và phân tích dữ liệu
III.4. Ứng dụng microarray
III.5. DNA microoarray để chuẩn đoán các rối loạn di truyền
III.6. Phát hiện bất thường nhiễm sắc thể
III.7. Phát hiện đột biến gây bệnh
III.8. Phát hiện các thay đổi đa hình

5
8
9
10
10
11
12
12
12
13
14
15
15
16
17

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN

17

Tài liệu tham khảo

19


Danh mục từ viết tắt
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng anh

Nghĩa tiếng việt

CCD

Charge-coupled device

Thiết bị kết nối sạc

TIFF

Tagged Image File Format

Định dạng tệp hình ảnh
được gắn thẻ

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase

BRCA1

Gen ức chế khối u

BRCA2

Gen ức chế khối u

SNP

SSCP

CE

HNPP

LASIK

CAH

Single nucleotide polymorphism

Đa hình nucleotide đơn

Single strand conformation
polymorphis

Đa hình cấu trúc sợi đơn

Capillary Electrophoresis

Điện di mao quản

Hereditary neuropathy with liability
to pressure palsies

Bệnh bại liệt

Laser-Assisted in situ

Phẫu thuật điều chỉnh thị

Keratomileusis

giác bằng laser

Congenital Adrenal Hyperplasia

Bệnh do tình trạng rối loạn
hormon vỏ thượng thận gây
ra

1

Tóm tắt

2


Trong nghiên cứu sinh học và y học là sự kết hợp cuối cùng của các phân tử trên bề
mặt trong quá trình chuyển đổi quan trọng, đang được thúc đẩy bởi hai yếu tố chính: sự gia
tăng lớn về lượng thơng tin trình tự DNA và sự phát triển của các công nghệ để khai thác
việc sử dụng nó. Do đó, chúng ta thấy mình đang ở thời điểm mà các loại thử nghiệm mới
có thể thực hiện được. Các quan sát, phân tích và khám phá đang được thực hiện trên một
quy mô chưa từng có. Trong vài năm qua, hơn 30 sinh vật đã có bộ gen hoàn chỉnh, với
khoảng 100 sinh vật khác đang được tiến hành. Ít nhất một phần trình tự đã thu được đối với
hàng chục nghìn gen của chuột nhắt, chuột cống và người, và trình tự của tồn bộ hai nhiễm
sắc thể người (nhiễm sắc thể 21 và 22) đã được xác định. Trong vòng một năm, một phần
lớn bộ gen của con người sẽ được giải mã, bằng cả nỗ lực cơng và tư, và trình tự hồn chỉnh
của chuột cũng như các bộ gen của động vật và thực vật khác chắc chắn sẽ theo sát phía sau.
Thật khơng may, hàng tỷ cơ sở của trình tự DNA khơng cho chúng ta biết tất cả các gen làm
gì, tế bào hoạt động như thế nào, tế bào hình thành sinh vật như thế nào, bệnh tật diễn ra như
thế nào, chúng ta già đi như thế nào hoặc làm thế nào để phát triển một loại thuốc. Đây là
nơi bộ gen chức năng phát huy tác dụng. Mục đích của bộ gen là để hiểu sinh học, không chỉ
đơn giản là xác định các bộ phận cấu thành, và các phương pháp thử nghiệm và tính tốn tận
dụng càng nhiều thơng tin trình tự càng tốt. Theo nghĩa này, bộ gen chức năng không phải là
một dự án hoặc chương trình cụ thể mà là một tư duy và cách tiếp cận chung đối với các vấn
đề. Mục tiêu không chỉ đơn giản là cung cấp một danh mục tất cả các gen và thông tin về
chức năng của chúng, mà còn để hiểu cách thức các thành phần hoạt động cùng nhau để tạo
nên các tế bào và sinh vật hoạt động.

3

Để tận dụng tối đa khối thơng tin trình tự lớn và tăng nhanh, cần phải có các công
nghệ mới. Trong số các công cụ mạnh mẽ và linh hoạt nhất cho bộ gen là các mảng
oligonucleotide mật độ cao hoặc DNA bổ sung. Mảng acid nucleic hoạt động bằng cách lai
RNA hoặc DNA được đánh dấu trong dung dịch với các phân tử DNA được gắn tại các vị trí
cụ thể trên bề mặt. Trên thực tế, sự lai tạo của một mẫu thành một mảng là một tìm kiếm
song song cao của từng phân tử được xác định bởi các quy tắc nhận biết phân tử. Mảng acid
nucleic đã được sử dụng cho các thử nghiệm sinh học trong nhiều năm. Theo truyền thống,
các mảng bao gồm các đoạn DNA, thường có trình tự khơng xác định, được phát hiện trên
màng xốp (thường là nylon). Các đoạn DNA được sắp xếp theo mảng thường đến từ thư
viện cDNA, DNA bộ gen hoặc plasmid và vật liệu lai thường được đánh dấu bằng một nhóm
phóng xạ. Gần đây, việc sử dụng thủy tinh làm chất nền và phát huỳnh quang để phát hiện,
cùng với sự phát triển của các công nghệ mới để tổng hợp hoặc lắng đọng acid nucleic trên
các phiến kính với mật độ rất cao, đã cho phép thu nhỏ các mảng acid nucleic đồng thời tăng
lên. về hiệu quả thử nghiệm và nội dung thông tin . Mặc dù việc tạo ra các mảng với hơn vài
trăm phần tử cho đến gần đây vẫn là một thành tựu kỹ thuật quan trọng, nhưng các mảng với
hơn 250.000 đầu dò oligonucleotide khác nhau hoặc 10.000 cDNA khác nhau trên mỗi
centimet vuông hiện có thể được tạo ra với số lượng đáng kể. Mặc dù có thể tổng hợp hoặc
gửi các đoạn DNA có trình tự chưa biết, nhưng cách triển khai phổ biến nhất là thiết kế các
mảng dựa trên thơng tin trình tự cụ thể, một q trình đơi khi được gọi là tải bộ gen vào
chip. Có một số biến thể về kỹ thuật cơ bản này: phản ứng lai hóa có thể được điều khiển (ví
dụ, bằng điện trường); các phương pháp phát hiện khác" ngoài huỳnh quang có thể được sử
dụng; và bề mặt có thể được làm bằng các vật liệu khác ngoài thủy tinh như nhựa, silicon,
vàng, gel hoặc màng, hoặc thậm chí có thể bao gồm các hạt ở đầu sợi quang. Tuy nhiên, các
yếu tố chính của phép lai song song với các mẫu dò acid nucleic liên kết bề mặt, cục bộ và
việc đếm các phân tử liên kết, và các mảng acid nucleic mật độ cao trên kính (thường được
gọi là các microarray DNA, các mảng oligonucleotide, các mảng Gene Chip, hoặc đơn giản
là chip) và công dụng sinh học của chúng sẽ là trọng tâm của đề tài.

4

CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Số lượng bệnh tật ngày càng tăng ở người, cả mắc phải và di truyền, đang được coi là
ít nhất một phần dựa trên sự thay đổi trong trình tự DNA . Đối với hầu hết các bệnh, di
truyền và mắc phải có thể phức tạp và đa gen. Những nỗ lực của Dự án bộ gen người nhằm
làm sáng tỏ nền tảng di truyền cấu trúc bằng cách xác định vị trí nhiễm sắc thể và tổ chức bộ
gen của khoảng 30.000 đến 35.000 gen người gần như đã hoàn tất [33].
Cho đến gần đây, các nghiên cứu về di truyền chức năng nhìn chung có phạm vi hạn
chế, chỉ có thể làm sáng tỏ vai trò của một hoặc một vài gen tại một thời điểm trong một hệ
thống. Theo truyền thống, thông tin về tính đặc hiệu và sự phong phú tương đối của các sản
phẩm biểu hiện được thu thập bằng các kỹ thuật như thử nghiệm lai tạo RNA Northern blot
và thử nghiệm bảo vệ ribonuclease. Các phương pháp tinh vi hơn một chút, chẳng hạn như
hiển thị vi phân [18] và Phân tích nối tiếp biểu hiện gen, [32] đã được sử dụng để sàng lọc
số lượng lớn hơn các dòng DNA bổ sung (cDNA) . Tuy nhiên, những hạn chế về kỹ thuật
khiến những kỹ thuật này không có lợi cho khảo sát di truyền quy mô lớn.
Để đạt được mục tiêu này, một công nghệ mới mạnh mẽ đang xuất hiện, sử dụng phép
lai với các mảng nucleotide, cái gọi là chip gen [19, 27]. Sự giao thoa cơng nghệ giữa sinh
học và máy tính này cho phép sàng lọc đồng thời một số lượng lớn gen đáng tin cậy và có
thể tuân theo quy trình tự động hóa.
Sức mạnh của những con chip này nằm ở khả năng nghiên cứu biểu hiện so sánh giữa
người bệnh và người bình thường .Các mẫu và ghi lại các thay đổi ở các giai đoạn khác nhau
trong quá trình tự nhiên của bệnh hoặc để đáp ứng với điều trị. Nó cung cấp cho nhà nghiên
cứu một kho vũ khí mới để phân tích các cơ chế bệnh lý cơ bản trên quy mô lớn và cũng để
xem xét cơ sở lý luận của các khái niệm trị liệu.

5


CHƯƠNG II. TỔNG QUAN

II.1. DNA
DNA chứa đựng thông tin di truyền dưới dạng acid deoxyribonucleic. Kích thước
và thành phần của một trình tự bộ gen xác định hình thức và chức năng của sinh vật. Nói
chung, độ phức tạp của bộ gen tỷ lệ thuận với độ phức tạp của sinh vật. Các sinh vật
tương đối đơn giản như vi khuẩn có bộ gen trong phạm vi 1-5 triệu (megabase) trong khi
bộ gen của động vật có vú bao gồm cả con người là khoảng 3000 megabase; bộ gen từ các
sinh vật có độ phức tạp trung bình như giun và côn trùng thường là 100-200 megabase.
Bộ gen thường được chia thành các phân đoạn riêng biệt được gọi là nhiễm sắc thể.
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) chứa một nhiễm sắc thể hình trịn duy nhất, trong khi
nấm men Saccharomyces cerevisiae chứa 16 nhiễm sắc thể tuyến tính. Bộ gen của con
người bao gồm 23 nhiễm sắc thể thường và một nhiễm sắc thể giới tính sao cho 24 nhiễm
sắc thể của người chứa tất cả 3000 megabase.
DNA bộ gen tồn tại dưới dạng polyme sợi kép chứa bốn base DNA (A, G, C và T)
được buộc vào một khung glucose-phosphate (Bảng 1). Thứ tự của các base dọc theo
DNA được gọi là trình tự chính của DNA. Trình tự bộ gen, còn được gọi là bộ gen cấu
trúc, cung cấp thơng tin trình tự cho ngành cơng nghiệp chip sinh học. Hai chuỗi DNA
được giữ với nhau bằng liên kết hydro tương tác giữa các base bổ sung trên mỗi mạch.
Cấu trúc hóa học của bazơ sao cho A tương tác với T (chứ không phải với bất kỳ base nào
khác) và G tương tác với C (chứ không phải với bất kỳ base nào khác). Cấu trúc sợi kép
vốn có của DNA và độ chính xác của các tương tác bắt cặp cơ sở có thể được khai thác
trong một quá trình được gọi là lai tạo. Lai tạo là quá trình trong đó hai chuỗi acid nucleic
đơn sợi bổ sung tạo thành một chuỗi xoắn kép ổn định. Phản ứng lai hóa có thể xảy ra
giữa hai phân tử bổ sung trong dung dịch hoặc giữa phân tử trong dung dịch và phân tử
bổ sung cố định trên giá đỡ vững chắc. Vì các thử nghiệm chip DNA sử dụng các phản
ứng lai giữa các phân tử huỳnh quang sợi đơn và trình tự sợi đơn trên bề mặt chip, nên lai
tạo là quá trình sinh hóa mà tồn bộ ngành cơng nghiệp microarray DNA dựa vào đó.

6

Bộ gen của một sinh vật chứa cả vùng mã hóa và mã hóa protein (Bảng 1) do đó bao
gồm exon và intron, vùng khởi động và điều hòa gen, nguồn gốc sao chép, telomere và
DNA liên gen không hoạt động. Phân tích bộ gen có thể cung cấp một phép đo định lượng
về số lượng bản sao gen và số lượng nhiễm sắc thể hoặc thể bội, cũng như sự hiện diện
của các khác biệt base đơn lẻ trong trình tự chính của DNA. Những thay đổi cơ bản duy
nhất được di truyền thường được gọi là đa hình, trong khi những thay đổi có được trong
vòng đời của một sinh vật thường được gọi là đột biến. Theo một quan điểm nào đó, phân
tích bộ gen cung cấp một bức tranh chi tiết về tiềm năng di truyền của một sinh vật bằng
cách phác họa trình tự nucleotide chính xác của tất cả các gen và vùng điều hịa gen. Phân
tích bộ gen ở cấp độ DNA thì không, tuy nhiên, không cung cấp thước đo biểu hiện gen,
là quá trình tổng hợp các bản sao RNA và protein của các trình tự mã hóa. Tuy nhiên,
khơng cung cấp thước đo biểu hiện gen, là quá trình tổng hợp các bản sao RNA và protein
của các trình tự mã hóa.

7


Bảng 1. Nội dung thông tin của bộ gen
Thông tin

DNA

RNA

Protein

Thiết kế di truyền

Hồn chỉnh

Khơng hồn chỉnh

Khơng hồn chỉnh

Đại diện gen a

100%

3%

3%

Loại

Mã hóa và không

Mã hóa

Mã hóa

mã hóa
Dạng

Sợi kép

Đơn sợi

Cuộn gập

Thành phần

Nucleic acid

Nucleic acid

Amino acid

Lai tạo

Có

Có

Không

Base

A,G,T,C

A,G,C,U

Không áp dụng

Bội thể b

Có

Có

Có

Phiên mã b

Không

Có

Có

Tịnh tiến

Không

Không

Có

Biến đổi sinh hóa

Methyl hóa

Polyadenyl hóa

Acyl hóa
Phosphoryl hóa

Thử nghiệm micoarray
a

Con người

b

Loại trừ các hiệu ứng

Có

Có

Không c

phụ
c

Đã được công bố

8


II.2. ARN
Bộ gen DNA bao gồm các vùng chức năng rời rạc được gọi là gen. Bộ gen của các
sinh vật đơn giản như vi khuẩn chứa 1000-3000 gen [7]. Trong khi bộ gen của con người
được ước tính chứa 50.000-100.000 gen [33]. Các sinh vật đa bào bao gồm nấm men, ruồi
và giun chứa 5000-25000 gen [33].
Biểu hiện gen là q trình RNA thơng tin (mRNA) và cuối cùng là protein được tổng
hợp từ khuôn mẫu DNA của mỗi gen. mRNA là một phân tử sợi đơn bao gồm bốn cơ sở
DNA được buộc vào một xương sống glucose- phosphate (Bảng 1). Phần của mỗi gen được
biểu diễn dưới dạng mRNA được gọi là trình tự mã hóa cho gen đó. Khoảng 3% bộ gen của
con người dưới dạng trình tự mã hóa.
Bởi vì mRNA là một bản sao chính xác của các vùng mã hóa DNA, phân tích mRNA

có thể được sử dụng để xác định tính đa hình trong các vùng mã hóa của DNA; quan trọng
hơn, phân tích bộ gen ở cấp độ mRNA có thể được sử dụng như một thước đo biểu hiện gen.
Mức độ biểu hiện của mỗi gen được quyết định về mặt sinh lý bởi sự kết hợp của các yếu tố
di truyền và môi trường. Các yếu tố di truyền xác định hoạt động biểu hiện gen bao gồm
trình tự DNA chính xác của các vùng điều hịa gen như vùng khởi động, vùng tăng cường và
vị trí nối. Do đó, tính đa hình trong DNA được cho là sẽ đóng góp một số khác biệt trong
biểu hiện gen giữa các cá thể cùng loài. Mức độ biểu hiện cũng bị ảnh hưởng bởi một số
lượng lớn các yếu tố môi trường, bao gồm nhiệt độ, căng thẳng, ánh sáng và các tín hiệu
khác, dẫn đến thay đổi mức độ hormone và các chất báo hiệu khác. Vì lý do này, phân tích
RNA cung cấp thơng tin khơng chỉ về tiềm năng di truyền của một sinh vật, mà còn về
những thay đổi năng động trong trạng thái chức năng.
Mỗi tế bào của con người có thể được xem như một đơn vị chức năng chứa 50.00010.0000 biến gen, mà mức độ biểu hiện của chúng quyết định trạng thái chức năng của tế
bào [33]. Đối với hầu hết các gen, mức mRNA ở trạng thái ổn định xấp xỉ mức protein và do
đó, việc theo dõi biểu hiện định lượng ở cấp độ mRNA cung cấp manh mối quan trọng về
chức năng. Giả thuyết rằng nhiều hoặc tất cả các bệnh ở người có thể đi kèm với những thay
đổi cụ thể trong biểu hiện gen [24] đã tạo ra nhiều mối quan tâm trong việc theo dõi biểu
hiện gen ở cấp độ toàn bộ bộ gen. Việc dễ dàng thu được các mẫu dò huỳnh quang từ
mRNA và sự dễ dàng mà các mẫu dò này có thể được phân tích bằng các xét nghiệm dựa

9


trên lai tạo [24] đã đưa việc theo dõi mRNA trở thành một hoạt động nổi bật trong bộ gen
chức năng.
II.2.1. Protein
Bước thứ hai trong biểu hiện gen là tổng hợp protein từ mRNA. Một protein duy nhất
được mã hóa bởi mỗi mARN sao cho cứ ba nucleotide của mARN mã hóa một acid amin
của chuỗi polypeptide. Do đó, một mARN 999 nucleotide sẽ tạo thành một protein có 333
axit amin, với thứ tự tuyến tính của các nucleotide được biểu diễn dưới dạng một chuỗi acid
amin tuyến tính. Sau khi được tổng hợp, protein này có một cấu trúc ba chiều duy nhất được

xác định chủ yếu bởi trình tự acid amin chính. Sau khi được gấp lại, protein truyền đạt các
hướng dẫn chức năng của bộ gen bằng cách thực hiện một loạt các hoạt động sinh hóa bao
gồm các vai trò trong điều hòa gen, chuyển hóa, tế bào cấu trúc và sao chép DNA.
Các cá thể trong một quần thể dự kiến sẽ có sự khác biệt trong hoạt động của protein
do tính đa hình làm thay đổi trình tự acid amin chính của protein hoặc gây nhiễu mức
protein ở trạng thái ổn định bằng cách thay đổi biểu hiện gen. Tương tự như mức độ mRNA,
mức độ protein cũng có thể thay đổi để đáp ứng với những thay đổi của môi trường. Hơn
nữa, mức protein cũng chịu sự kiểm soát tịnh tiến và sau dịch mã không ảnh hưởng trực tiếp
đến mức độ mRNA (Bảng 1). Do đó, hiểu hoạt động của protein đòi hỏi thơng tin ngồi
những gì thu được bằng cách nghiên cứu DNA hoặc RNA (Bảng 1).
Một mức độ kiểm soát sau dịch mã quan trọng liên quan đến sự biến đổi cộng hóa trị
của protein, theo đó các nhóm thế có trọng lượng phân tử nhỏ như phosphate, nhóm acyl và
các nhóm tương tự được gắn bằng enzym vào chuỗi bên acid amin (Bảng 1). Biến đổi cộng
hóa trị có thể làm thay đổi sinh hóa chịu sự kiểm soát tịnh tiến và sau dịch mã không ảnh
hưởng trực tiếp đến mức độ mRNA (Bảng 1). Biến đổi cộng hóa trị có thể làm thay đổi hoạt
động sinh hóa của protein và do đó làm thay đổi trạng thái chức năng của tế bào. Bởi vì
protein cuối cùng truyền đạt các hướng dẫn của bộ gen, nên việc đánh giá hoạt động của
protein là trọng tâm để hiểu chức năng của bộ gen. Tuy nhiên, không giống như DNA và
RNA, hoạt động của protein không thể đo được bằng phân tích lai (Bảng 1). Thơng lượng
cao, phân tích protein song song với microarrays đặt ra một thách thức kỹ thuật ghê gớm mà
cho đến nay đã được chứng minh là khó nắm bắt.

10


II.2.2. Microarrays
II.2.2.1. Chất nền
Các thử nghiệm lai tạo truyền thống được phát triển vào những năm 1970 sử dụng các
màng dẻo như nitrocellulose và nylon. Ngược lại, các thí nghiệm microarray hoặc biochip sử
dụng các bề mặt rắn như thủy tinh có ghi nhãn và phát hiện huỳnh quang. So với định dạng

vĩ mơ của các thí nghiệm dựa trên bộ lọc, định dạng chip sinh học thu nhỏ thể hiện một cuộc
cách mạng cơ bản trong phân tích sinh học. Một lợi thế của các định dạng chip là bề mặt rắn
khơng xốp vì vậy cho phép lắng đọng một lượng nhỏ vật liệu sinh hóa trong một vị trí được
xác định chính xác.

Hình 1. Thử nghiệm microarray
Nguồn: Mark schena (2002).DNA Microarrays. Oxford University Press 1999, United
States [24]
Chất nền xốp như nylon và nitrocellulose cho phép khuếch tán các vật liệu được ứng
dụng và không phù hợp với microarray. Chất nền không xốp cũng ngăn chặn sự hấp thụ
thuốc thử và mẫu vào chất nền, cho phép loại bỏ nhanh chóng các hợp chất hữu cơ và
huỳnh quang trong quá trình chế tạo và sử dụng chip sinh học. Bề mặt khơng xốp cho
phép sử dụng thể tích mẫu nhỏ (Hình 2), cho phép nồng độ mẫu cao và động học lai hóa
nhanh. Chất nền rắn cũng cung cấp bề mặt đính kèm đồng nhất làm tăng chất lượng của
các phần tử mảng (Hình 2). Độ phẳng vốn có của định dạng microarray cho phép tính
song song (Hình 1), điều không có trong tất cả các thử nghiệm dựa trên bộ lọc (Hình 2).
Phân tích song song giúp tăng đáng kể độ chính xác của dữ liệu thử nghiệm.

11


Hình 2. So sánh Thử nghiệm bộ lọc và Microarray
Nguồn: Mark schena (2002).DNA Microarrays. Oxford University Press 1999, United
States [24]
II.2.2.2. Chế tạo Microarrays
Định dạng chip sinh học tương thích với nhiều công nghệ chế tạo tiên tiến và do đó có
thể được sản xuất tự động [24]. Ba công nghệ chính được sử dụng hiện nay trong sản xuất
microarray bao gồm quang khắc. phun mực, vi điểm cơ học và các dẫn xuất của chúng. Mỗi
công nghệ đều có những ưu điểm và nhược điểm cụ thể trong chế tạo chip sinh học, mặc dù
không có công nghệ nào trong số này tương thích với các chất nền khơng xốp được sử dụng

trong các thử nghiệm lai tạo truyền thống.
Phương pháp quang khắc dựa trên việc sử dụng các công nghệ bán dẫn trong môi
trường chip sinh học. Mặt nạ quang định hướng quá trình tổng hợp DNA pha rắn, được xác
định theo không gian thông qua việc sử dụng ánh sáng để kích hoạt các phiên bản
phosphoramidite đã biến đổi của bốn cơ sở DNA để tổng hợp DNA [24]. Mỗi bước kết nối
dẫn đến việc bổ sung một cơ sở duy nhất vào các chuỗi đang phát triển.

12


CHƯƠNG III. NỘI DUNG
III.1. DNA microarray
DNA microarray là một công cụ được sử dụng để xác định xem DNA của một cá nhân
cụ thể có chứa đột biến gen hay không.
Các nhà khoa học biết rằng một đột biến hoặc sự thay đổi trong DNA của một gen cụ
thể có thể góp phần gây ra một căn bệnh nào đó. Tuy nhiên, có thể rất khó phát triển một thử
nghiệm để phát hiện những đột biến này, bởi vì hầu hết các gen lớn đều có nhiều vùng có
thể xảy ra đột biến. Ví dụ, các nhà nghiên cứu tin rằng đột biến gen BRCA1 và BRCA2 gây
ra 60% các trường hợp ung thư vú và ung thư buồng trứng di truyền. Nhưng không có một
đột biến cụ thể nào chịu trách nhiệm cho tất cả các trường hợp này. Các nhà nghiên cứu đã
phát hiện ra hơn 800 đột biến khác nhau chỉ trong BRCA1 . Microarray DNA là một công cụ
được sử dụng để xác định xem DNA của một cá nhân cụ thể có chứa đột biến trong các gen
như BRCA1 và BRCA2 hay không. Con chip bao gồm một tấm thủy tinh nhỏ được bọc
trong nhựa. Một số công ty sản xuất microarray bằng các phương pháp tương tự như phương
pháp được sử dụng để tạo vi mạch máy tính. Nhìn bề ngồi, mỗi con chip chứa hàng nghìn
trình tự DNA sợi đơn, tổng hợp, ngắn, cùng nhau tạo nên gen bình thường đang được đề cập
và các biến thể (đột biến) của gen đó đã được tìm thấy trong quần thể người.
III.2. Cơ chế hoạt động
Để xác định xem một cá nhân có đột biến đối với một căn bệnh cụ thể hay không,
trước tiên, một nhà khoa học lấy mẫu DNA từ máu của bệnh nhân cũng như mẫu đối chứng

- mẫu không chứa đột biến ở gen quan tâm.
Sau đó, nhà nghiên cứu làm biến tính DNA trong các mẫu - một quá trình tách hai
chuỗi DNA bổ sung thành các phân tử chuỗi đơn. Bước tiếp theo là cắt các sợi DNA dài
thành các đoạn nhỏ hơn, dễ quản lý hơn và sau đó dán nhãn cho từng đoạn bằng cách gắn
thuốc nhuộm huỳnh quang (có nhiều cách khác để thực hiện việc này, nhưng đây là một
phương pháp phổ biến). DNA của cá nhân được dán nhãn bằng thuốc nhuộm màu xanh lá
cây và DNA đối chứng hoặc bình thường được dán nhãn bằng thuốc nhuộm màu đỏ. Cả hai
bộ DNA được dán nhãn sau đó được đưa vào chip và cho phép lai - hoặc liên kết - với DNA
tổng hợp trên chip.

13


Nếu cá nhân không có đột biến gen, cả mẫu màu đỏ và màu xanh lá cây sẽ liên kết với
các trình tự trên chip đại diện cho trình tự khơng có đột biến (trình tự "bình thường").
Nếu cá nhân đó có đột biến, thì DNA của cá nhân đó sẽ khơng liên kết chính xác với
trình tự DNA trên chip đại diện cho trình tự "bình thường" mà thay vào đó sẽ liên kết với
trình tự trên chip đại diện cho DNA bị đột biến.

Hình 2. Hoạt động của DNA Microarray
Nguồn: genome.gov
III.3. Phát hiện và phân tích dữ liệu
Sau khi mẫu huỳnh quang được phản ứng với microarray, vật liệu không liên kết sẽ bị
rửa sạch và mẫu liên kết với từng phần tử trên chip được hiển thị bằng phát hiện huỳnh
quang. Các thiết bị quét đồng tiêu và camera CCD [24] đều đã được sử dụng thành cơng để
phát hiện microarray.
Cấu hình phổ biến nhất của máy quét đồng tiêu sử dụng sự kích thích bằng laser trên
một vùng nhỏ của chất nền thủy tinh (~ 100 µm), sao cho tồn bộ hình ảnh được thu thập
bằng cách di chuyển chất nền hoặc thấu kính đồng tiêu trên chất nền trong hai kích thước.
Ánh sáng phát ra từ mẫu huỳnh quang tại mỗi vị trí được tách ra khỏi ánh sáng không mong

muốn bằng cách sử dụng một loạt gương, bộ lọc và thấu kính, và ánh sáng được chuyển đổi
thành tín hiệu điện bằng ống nhân quang (PMT) hoặc máy dò tương đương. Tốc độ thu thập

14


dữ liệu bằng máy quét đồng tiêu (1-5 phút) nhanh hơn nhiều so với kỹ thuật chụp phóng xạ
tự động với các bộ lọc phóng xạ được sử dụng trong các thí nghiệm thơng thường (từ một
đến mười ngày). Cơng nghệ phát hiện huỳnh quang nhanh là một khía cạnh mang tính cách
mạng của cơng nghệ microarray. Hình ảnh huỳnh quang với máy ảnh CCD sử dụng nhiều
nguyên tắc giống nhau như một máy quét đồng tiêu, mặc dù các chi tiết chính khác nhau ở
cả kích thích và cơng nghệ phát hiện. Một điểm khác biệt là hình ảnh dựa trên CCD thường
liên quan đến chiếu sáng và phát hiện một phần lớn chất nền. Khả năng chụp một trường
tương đối lớn có lợi thế giai đoạn loại bỏ yêu cầu đối với các giai đoạn di động và quang
học, làm giảm chi phí và đơn giản hóa thiết kế thiết bị. Một sự khác biệt quan trọng khác
giữa máy quét tiêu điểm và hệ thống phát hiện dựa trên CCD là hệ thống phát hiện sau này
thường sử dụng các nguồn ánh sáng có bước sóng liên tục như đèn hồ quang, do đó không
cần sử dụng nhiều tia laser. Khả năng lọc quang phổ phát xạ khó khăn trong các hệ thống
dựa trên CCD giúp giảm thiểu nhiễu chéo quang học giữa các kênh khác nhau.
Sau khi phát xạ huỳnh quang từ microarrays được chuyển thành đầu ra của hệ thống
phát hiện, các tệp dữ liệu (thường là TIFF 16 bit) được định lượng và giải thích. Việc định
lượng thường được thực hiện bằng cách đặt chồng lưới lên hình ảnh microarray và tính tốn
giá trị cường độ trung bình cho từng phần tử microarray bằng phần mềm tự động. Sau đó,
các giá trị cường độ có thể được chuyển đổi thành các đầu ra có liên quan về mặt sinh học,
chẳng hạn như số lượng mRNA trên mỗi tế bào, bằng cách so sánh các yếu tố thử nghiệm và
kiểm soát có trong một microarray nhất định. Biểu hiện gen định lượng, kiểu gen và các kết
quả đầu ra khác sau đó tương quan với trình tự gen được biểu thị trong microarray và có thể
xác định được các mối quan hệ bậc cao hơn như mạng lưới đồng điều hòa và điều hòa gen.
III.4. Ứng dụng microarray
Các phương pháp tiếp cận dựa trên DNA microarray để khám phá dấu ấn sinh học đã

được áp dụng để nghiên cứu một số bệnh mãn tính bao gồm tiểu đường [5], viêm khớp [6]
và bệnh tim mạch [20]. Ví dụ, các dấu ấn sinh học để chẩn đốn bệnh lupus ban đỏ hệ thống
(và viêm khớp dạng thấp, là các rối loạn viêm và tự miễn dịch mãn tính, có thể được sàng
lọc bằng cách định hình biểu hiện trong bạch cầu vì biểu hiện gen khác biệt trong bạch cầu
rõ ràng có liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống và viêm khớp dạng thấp. Viêm xương khớp,
bệnh thoái hóa khớp có thể bị nhầm lẫn với viêm khớp dạng thấp, cũng có thể được chẩn
đoán bằng cách sử dụng biểu hiện của bạch cầu [13].

15


III.5. DNA microoarray để chuẩn đoán các rối loạn di truyền
Rối loạn di truyền rõ ràng là do bất thường di truyền gây ra. Nhiễm sắc thể bất thường
và đột biến trong chuỗi DNA là hai loại rối loạn. Loại thứ hai có thể gây ra những thay đổi
trong trình tự acid amin trong protein, thiếu sản xuất protein hoặc nối khác nhau, gây ra các
kiểu hình bệnh. Ngồi những thứ này, SNPs hóa ra cũng là manh mối quan trọng để theo dõi
các gen bệnh, đặc biệt là những gen gây ra sự phát triển bệnh ở các giai đoạn khác nhau của
cuộc đời
Các phương pháp thông thường để phát hiện đột biến bao gồm giải trình tự vật liệu
khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa trên gel, đa hình độ dài đoạn giới hạn
(RFLP) và đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP). Các quy trình giải trình tự này, mặc dù có hiệu
quả, nhưng lại tốn nhiều thời gian và công sức. Để đáp ứng nhu cầu sàng lọc đột biến hiệu
quả hơn, điện di gel nhạy cảm với cấu trúc (CSGE) [1, 17] và điện di mao quản (CE) [3]
đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc số lượng lớn gen nhằm nghiên cứu các biến thể trình
tự và bệnh di truyền. Hơn nữa, DNA microarray đã được phát triển và áp dụng cho các lĩnh
vực chẩn đoán khác nhau bao gồm tư vấn di truyền, sàng lọc và đánh máy SNP. Trong thực
tế, các kỹ thuật microarray cải tiến đã mang lại nhiều thuận lợi cho việc phân tích đột biến di
truyền, và do đó việc tích lũy một lượng lớn dữ liệu đang diễn ra để sử dụng chúng trong
chẩn đoán bệnh.
III.6. Phát hiện bất thường nhiễm sắc thể

Rối loạn di truyền có thể do bất thường nhiễm sắc thể gây ra như xóa hoặc sao chép
nhiễm sắc thể, xóa hoặc sao chép một phần nhiễm sắc thể hoặc đứt gãy, chuyển vị hoặc đảo
đoạn nhiễm sắc thể. Các bệnh do bất thường nhiễm sắc thể gây ra bao gồm một số loại như
hội chứng Down (liên quan đến nhiễm sắc thể 21), hội chứng Edwards (nhiễm sắc thể 18),
hội chứng Patau (nhiễm sắc thể 13), hội chứng Turner (XO), hội chứng Klinefelter (XXY)…
những bất thường về thể chất và tinh thần và cái chết, và thậm chí là thai lưu.
Kang và đồng nghiệp đã phát triển một microarray DNA để phát hiện các bất thường
nhiễm sắc thể gây ra các rối loạn di truyền khác nhau bao gồm hội chứng Down, hội chứng
Patau, hội chứng Edward, hội chứng Turner, hội chứng Klinefelter, chậm phát triển alphathalassemia-16, bệnh thần kinh Charcot-Marie-Tooth 1A, Cri-du hội chứng -chat, bệnh thần
kinh di truyền có liên quan đến bệnh bại liệt do áp lực (HNPP), hội chứng Prader-Willi, hội
chứng Rubinstein-Taybi, hội chứng Williams và Wolf-Hirschhoryndrome (J.-J. Kang và
16


cộng sự 2007). Họ đã sử dụng chip nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (chip BAC) để chẩn
đoán các bất thường về nhiễm sắc thể.
III.7. Phát hiện đột biến gây bệnh
Các bệnh đơn gen phần lớn được chia thành hai loại theo phân loại nguyên nhân gồm
rối loạn trội và lặn. Loạn dưỡng giác mạc do đột biến gen mã hóa BIG-H3 là một trong
những bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường. Nó bắt đầu với triệu chứng mờ ở trung
tâm giác mạc và kết thúc bằng mất thị lực khi bệnh nhân già đi. Trong trường hợp loạn
dưỡng cơ Avellino, đột biến dị hợp tử gây mất thị lực nghiêm trọng khi một người già đi,
trong khi đột biến đồng hợp tử gây mất thị lực hoàn toàn sớm hơn nhiều. Trong những năm
gần đây, căn bệnh này có tỷ lệ lưu hành 1/340-1/1.000 ở Hàn Quốc (trong trường hợp dị hợp
tử) đang được chú ý nhờ phẫu thuật LASIK [2, 10, 14, 16, 26]. Nếu một bệnh nhân mắc
chứng loạn dưỡng thể lồi Avellino dị hợp tử được phẫu thuật LASIK, độ mờ của khối mờ
bắt đầu phát triển mạnh và cuối cùng dẫn đến mất thị lực sau 2 năm [15]. Một nhóm các nhà
khoa học đã phát triển một microarray DNA để chẩn đoán bệnh loạn dưỡng giác mạc bằng
cách phát hiện các đột biến ở exon 4 và 12 của BIG-H3 (S. Y. Lee và cộng sự 2007 [37].
Con chip này đã được tối ưu hóa với nhiều yếu tố khác nhau để mang lại hiệu quả cao độ

đặc hiệu và độ nhạy: nồng độ của đầu dò bắt giữ (100, 50, 30 và 10 µM), độ dài của đầu dị
bắt giữ nằm trong khoảng từ 11 đến 17 mers và thời gian lai (1, 2, 3, 4, 6 và 24 giờ) .
Microarray DNA này đã được xác thực về hiệu suất của nó bằng cách sử dụng các mẫu máu
của 98 bệnh nhân, cho kết quả chính xác 100%.
Nói chung, đột biến dị hợp tử không gây bệnh. Tuy nhiên, những người mang gen
bệnh mất điều hòa giãn mạch (AT), một rối loạn gen lặn, cho thấy tuổi thọ giảm, nguy cơ
ung thư cao (đặc biệt là ung thư vú) và tăng độ nhạy cảm với bức xạ ion hóa [4, 28, 29].
Thật không may, gen liên quan đến AT có kích thước lớn (khoảng 150 kb) và khơng có đột
biến phổ biến nên rất khó chẩn đoán AT [8, 9, 12, 36]. Do đó, để xác định những người
mang dị hợp tử mắc các rối loạn lặn tự phát, Cheung et al. đã phát minh ra một microarray
cDNA thể hiện các dấu hiệu di truyền khác nhau từ những người mang đột biến dị hợp tử và
những người bình thường (V. G Cheung et al. 2005). Bệnh Wilson (WD) cũng gặp vấn đề
tương tự về khó khăn trong việc tìm kiếm và phát hiện đột biến gen liên quan đến WD
(ATP7B) kéo dài hơn 80 kb. Do đó, việc phát triển một phương pháp hiệu quả hơn để phát
hiện đột biến WD là rất cần thiết [11, 22, 23, 30, 31, 34]. Lee và cộng sự. (S. Y. Lee và cộng

17


sự 2004) đã phát triển một microarray DNA chẩn đoán để phát hiện các đột biến gây ra bệnh
WD bằng cách sử dụng thuật toán quét codon (COSA), tạo điều kiện thuận lợi cho thiết kế
đầu dò oligonucleotide. COSA là một phương pháp thiết kế mẫu dò trong đó các mẫu dò đặc
hiệu với alen được thiết kế bằng cách thay đổi ba bazơ liên tiếp trong trình tự codon của gen
liên quan đến bệnh. Sử dụng phương pháp này, một microarray DNA đã được chế tạo để bao
gồm tất cả 16 đột biến thay thế được báo cáo gây ra WD. Nó đã được sử dụng để chẩn đoán
thành cơng chín bệnh nhân WD, đồng thời phân biệt được ba người bình thường
Trong một báo cáo khác, một bộ dụng cụ chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh
(CAH) đã được phát triển bởi Jin (D. K. Jin. 2003). Ở người, CAH là một trong những
khiếm khuyết bẩm sinh phổ biến nhất của quá trình chuyển hóa (sinh tổng hợp cortisol) và
được quan sát thấy với tần suất khá cao là 1 trên 10.000. Khi trẻ sơ sinh bị CAH bị mất

muối, nhiễm toan tăng kali máu và mất nước xảy ra và trẻ sơ sinh cuối cùng có thể tử vong
trừ khi được điều trị bằng hormone thay thế steroid. Vì vậy, chẩn đốn sớm là rất quan trọng
[21, 25, 35]. Jin đã sử dụng 7 bộ đoạn cDNA song song của gen 21-hydroxylase bình
thường và của bệnh nhân (exon 1, intron 2 và exon 4) để phát hiện các đột biến điểm trong
gen này (D. K. Jin. 2003)
III.8. Phát hiện các thay đổi đa hình
Những thay đổi đa hình (được gọi là SNP) là những biến thể di truyền xảy ra với tần
suất khoảng một trong mỗi 1.000 cơ sở trong bộ gen. SNPs có thể thể hiện tính nhạy cảm
của một cá nhân đối với một căn bệnh cụ thể. Gần đây, nhiều nỗ lực đã được thực hiện để
tìm ra các dấu hiệu liên quan đến bệnh bằng cách sử dụng SNP.
Những thay đổi đa hình (được gọi là SNP) là những biến thể di truyền xảy ra với tần
suất khoảng một trong mỗi 1.000 cơ sở trong bộ gen. SNPs có thể thể hiện tính nhạy cảm
của một cá nhân đối với một căn bệnh cụ thể. Gần đây, nhiều nỗ lực đã được thực hiện để
tìm ra các dấu hiệu liên quan đến bệnh bằng cách sử dụng SNP.

18