Nghiên cứu tách dòng gen sh2 từ dòng ngô h14 và thiết kế vector chuyển gen pcambia 1301 ubi sh2

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC
GVHD: GS.TS. Nguyễn Văn Cách


ĐỀ TÀI
Nghiên cứu tách dòng gen Sh2
từ dòng ngô H14 và thiết kế
vector chuyển gen pCAMBIA
1301-Ubi-Sh2


TỔNG QUAN VỀ GEN SHRUNKEN 2 (Sh2)

• Gen Shrunken 2 (Sh2) đã được chứng minh là gen mã hoá cho tiểu phần lớn của enzyme
ADP-glucosse pyrophosphorylase nội nhũ, một enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp
tinh bột ở nội nhũ.

• Đoạn gen này đã được nghiên cứu chuyển thành công vào cây ngô làm tăng hàm lượng
tinh bột lên đáng kể so với cây đối chứng khơng chuyển gen.

• Với mục tiêu tạo các dịng ngơ có năng suất, chất lượng cao, tiến hành nghiên cứu, tách
dòng gen Sh2 và thiết kế vector phục vụ việc chuyển gen Sh2 vào một số dịng ngơ trồng
ở Việt Nam.


CÁC BƯỚC TÁCH DÒNG GEN


• Truy cập trang NCBI, vào mục Nucleotide, tìm kiếm Shrunken.
• Hiện ra hàng loạt kết quả, ta chọn trong số những kết quả đấy những đối tượng sinh vật
chứa gen đó mà gần gũi với đối tượng ta đang tìm kiếm.

• Từ đó, ta chọn được 3 đối tượng chính.


ZEA MAYS (NGÔ)


ARABIDOPSIS THALIANA (MỘT LỒI CÂY CĨ HOA NHỎ THUỘC
HỌ CẢI)


BRASSICA NAPUS (CẢI DẦU)


•
•

Truy cập chương trình Clustal Omega, tìm các vùng tương đồng giữa 3 đối tượng kể trên.
Chọn ra các vùng bảo thủ để thiết kế mồi


•
•

Truy cập Primer – Blast để thiết kế mồi.
Điền các thơng tin cần thiết để chạy chương trình.


• Chạy chương trình tìm ra được 3 cặp mồi.
• Chọn cặp mồi đầu tiên vì nó cho ra sản phẩm có chiều dài gần nhất với chiều dài của
đoạn gen Sh2.

• Sử dụng chương trình SMS PCR để chạy PCR ảo tạo ra sản phẩm PCR ảo.


• Chạy chương trình Blast nhằm tìm kiếm chuỗi tương đồng nhất với chuỗi kiểm tra.
• Khai thác thơng tin về đặc điểm, đặc tính đã biết của các chuỗi trong ngân hàng để dự
đốn đặc tính của chuỗi kiểm tra.


PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN


• Thiết kế mồi bằng chương trình Primer Blast dựa trên trình tự gen Sh2.
• Đoạn gen sau đó được gắn vào vector tách dòng pBT tạo plasmid tái tổ hợp sử dụng T4
DNA ligase. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. Coli DH5α bằng phương pháp α bằng phương pháp
sốc nhiệt

• Các dịng khuẩn được chọn lọc bằng PCR clony sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân Sh2.
Các vi khuẩn sau khi chọn lọc có chứa các đoạn gen mục tiêu được nuôi trong môi
trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/ml và tách plasmid tái tổ hợp

• Plasmid được cắt kiểm tra bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và SacI
• Gen Sh2 từ dịng ngơ H14 sau đó được gắn với cấu trúc vector biểu hiện pCambia1301
cùng với promotor Ubiquitin (Ubi) đã được tách dòng để tạo vector chuyển gen mang gen
Sh2: pCambia1301-Ubi-Sh2.

• Để làm việc này, các enzyme BamHI và SacI được sử dụng để cắt đồng thời vector tách
dòng pBT-Sh2 và vector pCambia 1301 và gắn gen Sh2 vào vector pCambia 1301 bằng
T4 DNA ligase để tạo plasmid pCambia 1301-Sh2 rồi biến nạp vào vi khuẩn E. Coli DH5α bằng phương pháp α

và ni trên mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 5α bằng phương pháp 0 mg/ ml.


• Các dịng vi khuẩn được kiểm tra sự có mặt của đoạn gen Sh2 bằng PCR clony. Cấu trúc
pCambia 1301-Sh2 sau đó được gắn thêm promoter Ubi cho việc tạo cấu trúc biểu hiện
pCambia 1301-Ubi-Sh2 bằng việc sử dụng enzyme BamHI và PstI cắt đồng thời cả hai
cấu trúc vector pCambia1301-Sh2 và cấu trúc pBT-Ubi và gắn pCambia 1301-Sh2 vơi
promoter Ubi bằng enzyme T4 DNA ligase để tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301- UbiSh2 phục vụ chuyển gen. Cấu trúc này được biến nạp vào vi khuẩn E. Coli DH5α bằng phương pháp α. Sau khi
kiểm tra sự có mặt bằng PCR clony và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn PstI và BamHI,
cấu trúc pCambia 1301- Ubi- Sh2 được chuyển vào các dòng vi khuẩn Agrobacterium
tumerfaciens EHA105α bằng phương pháp và C5α bằng phương pháp 8 bằng phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích
chuyển gen.

• Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, gen Sh2 nhân bản thành
cơng?

• Sau khi gen Sh2 được gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào vi khuẩn E. coli
DH5α bằng phương pháp , điện di sản phẩm clony PCR cho thấy ở các dịng khuẩn có kích thước tương ứng
với đoạn gen mục tiêu.

• Kết luận dịng khuẩn mang plasmid chứa đoạn gen có kích thước phù hợp với đoạn gen
mong muốn và gen Sh2 đã được tách dòng thành công.