Phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải cellulose ứng dụng trong xử lý rác thải hữu cơ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.65 MB, 47 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
PHÂN LẬP XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE ỨNG DỤNG
TRONG XỬ LÝ RÁC THẢI HỮU CƠ
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP
GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh
ThS. Dương Nhật Linh
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
PHÂN LẬP XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE ỨNG DỤNG
TRONG XỬ LÝ RÁC THẢI HỮU CƠ
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt khóa học tại khoa Cơng nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp Hồ Chí
Minh tơi đã nhận được nhiều sự quan tâm, dạy dỗ từ các thầy cơ. Chính nơi này đã để
lại cho tơi rất nhiều kỉ niệm đẹp chắc chắn sẽ rất khó quên. Tôi được hướng dẫn và thực
hiện đề tài này trong một khoảng thời gian đặc biệt bởi dịch covid 19 đang bùng phát.
Để thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự giúp đỡ từ rất nhiều người. Vì vậy tơi xin
gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả những người đã giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian
qua.
Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu nhà trường đã
tạo điều kiện để em được vào trường thực hiện đề tài trong tình hình dịch bệnh chưa ổn
định. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Minh và cô
Dương Nhật Linh. Thầy và cô là người đã đánh thức sự u thích, tìm tịi về các vi sinh
vật trong em. Cảm ơn thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ em để em có thể
thực hiện đề tài này. Em xin cảm ơn đến các thầy cô của khoa đã truyền đạt những kiến
thức bổ ích cho em trong suốt những năm vừa qua.
Em gửi lời cảm ơn đến sự giúp đỡ, chia sẻ và động viên trong lúc gặp khó khăn
của chị Trần Thị Á Ni, chị Nguyễn Thị Thảo Nguyên và các bạn ở Phịng thí nghiệm
Cơng nghệ vi sinh. Cảm ơn chị và các bạn đã luôn bên cạnh.
Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ, cảm ơn ba mẹ đã dành
tình yêu thương cho con, nuôi nấng và tạo điều kiện để con học tập và rèn luyện. Cảm
ơn ba mẹ đã luôn bên cạnh ủng hộ để con vượt qua những khó khăn cho đến ngày hôm
nay.
Một lần nữa, Xin chân thành cảm ơn!
i
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
ii
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. v
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 3
1.
TỔNG QUAN VỀ TÌNH TRẠNG Ơ NHIỄM MƠI TRƯỜNG TẠI
VIỆT NAM........................................................................................................... 4
1.1 Thực trạng về môi trường.................................................................. 4
1.2 Một số thiệt hại gây ra bởi vấn đề ô nhiễm ...................................... 6
2.
TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT ......................................... 7
2.1 Vị trí phân loại, phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên ......................... 7
2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ..................................................... 8
3.
TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE ......................................... 9
3.1 Sơ lược về enzyme cellulase ............................................................... 9
3.2 Ứng dụng của enzyme cellulase ....................................................... 11
3.3 Cơ chế phân giải cellulose ................................................................ 12
4.
Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải
cellulose .............................................................................................................. 13
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 14
1.
VẬT LIỆU ............................................................................................... 15
ii
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................... 15
1.2 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 15
1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường ..................................... 15
2.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 15
2.1 Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 15
2.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu.................................................... 17
2.3 Phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt ............................................................. 17
2.4 Sàng lọc và xác định khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn ưa
nhiệt ........................................................................................................... 18
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 19
1.
Kết quả phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt .................................................... 20
2.
Kết quả thử khả năng phân giải cellulose trên môi trường bổ sung
CMC…………………………………………………………………………...23
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 27
1.
Kết luận: .................................................................................................. 28
2.
Đề nghị: ................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 29
PHẦN 5: PHỤ LỤC .......................................................................................... 35
iii
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
cs: Cộng sự
CMC: carboxymethyl cellulose
CFU: Colony Forming Unit- Đơn vị hình thành khuẩn lạc
iii
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ở 50oC .......................... 20
Bảng 3. 2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của các chủng xạ khuẩn .................. 21
Bảng 3. 3. Khả năng phân giải cellulose của các chủng đã phân lập qua 3 lần lặp lại
........................................................................................................................................ 24
iv
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
DANH MỤC HÌNH
Hình 3. 1. Kết quả phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt ở 50oC của mẫu đất suối nước nóng
Bình Định trên mơi trường Gause I ........................................................................... 20
Hình 3. 2. Hình thái đại thể (A) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ĐN2 được phân lập
trên môi trường Gause I ở 50oC và vi thể (B) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ĐN2 ở
vật kính 100X ................................................................................................................ 22
Hình 3. 3. Hình thái đại thể (A) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ĐN1 được phân lập
trên môi trường Gause I ở 50oC và vi thể (B) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ĐN1 ở
vật kính 100X ................................................................................................................ 22
Hình 3. 4. Hình thái đại thể (A) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt BĐ1 được phân lập
trên môi trường Gause I ở 50oC và vi thể (B) của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt BĐ1 ở
vật kính 100X ................................................................................................................ 23
Hình 3. 5. Kết quả thử khả năng phân giải cellulose của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt
ĐN2 bằng phương pháp cấy chấm điểm (A) và đục lỗ thạch (B) trên mơi trường
Gause I ........................................................................................................................... 25
Hình 3. 6. Kết quả thử khả năng phân giải cellulose của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt
BĐ1 bằng phương pháp cấy chấm điểm (A) và đục lỗ thạch (B) trên môi trường
Gause I ........................................................................................................................... 25
Hình 3. 7. Kết quả thử khả năng phân giải cellulose của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt
ĐN1 bằng phương pháp cấy chấm điểm (A) và đục lỗ thạch (B) trên môi trường
Gause I ........................................................................................................................... 26
v
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
ĐẶT VẤN ĐỀ
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thật thuộc lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales.
Hầu hết xạ khuẩn là các vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh. Xạ khuẩn ưa nhiệt là các vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp để phát triển tốt
từ khoảng 55-60oC, chúng phát triển trong phân chuồng ủ, trong các suối nước nóng,
trong pha sinh nhiệt của đống ủ compost. Đóng vai trị quan trọng trong việc tái chế
nguồn cơ chất từ phế phẩm nông nghiệp (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2012). Đặc biệt, xạ
khuẩn có khả năng phân giải cellulose - thành phần cấu tạo thành tế bào thực vật.
Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm môi trường dần trở thành một vấn đề
nghiêm trọng cần được quan tâm kể cả các nước đã và đang phát triển. Và việc ứng dụng
vi sinh vào xử lý ô nhiễm đang dần được triển khai rộng rãi. Việc sử dụng vi sinh vật
phân giải cellulose để sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý ô nhiễm môi trường đã và đang
được các nhà khoa học ở Việt Nam và thế giới ứng dụng. Trong số nhiều phương pháp
được sử dụng thì ủ phân do các vi sinh vật ưa nhiệt làm trung gian trở nên phổ biến và
đem lại hiệu quả bền vững trong việc xử lý chất thải hữu cơ (Leow và cs., 2018). Chế
phẩm vi sinh gồm 4 chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh tổng hợp cellulase đã
được Zhao Y và cộng sự (2016) sàng lọc từ các mẫu phân ủ để bổ sung vào các giai đoạn
khác nhau của quá trình ủ phân. Kết quả cho thấy việc bổ sung chế phẩm vào đống ủ đã
có hiệu quả tích cực, giúp đẩy nhanh quá trình phân hủy cellulose, làm tăng hàm lượng
các chất mùn và có ảnh hưởng đến quần xã vi sinh vật trong đống ủ, so với đống ủ không
được bổ sung chế phẩm.
Ở Việt Nam, 2 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đã được bổ sung vào chế
phẩm vi sinh Sagi Bio-1 sử dụng để xử lý chất thải chăn ni (Hai, V. T., 2017). Trần
Hồng Dũng và cộng sự cũng đã nghiên cứu tuyển chọn được các chủng vi sinh vật phân
3
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
giải cellulose thuộc cả 3 nhóm là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc để ứng dụng xử lý rác
thải giàu cellulose (Trần Hoàng Dũng và cs., 2018)
Một số lượng lớn các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh đã
được cơng bố, trong đó chi Streptomyces chiếm tỷ lệ nhiều nhất. Priyanka SB và cs.,
(2019) đã thu cellulase và pectinases từ việc lên men chủng xạ khuẩn chịu nhiệt
Streptomyces thermocarboxydus IS -1 để sử dụng cho công nghiệp xử lý rác thải hữu cơ.
Tăng Thị Chính (2015) cũng tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn được định danh
là S. hygroscopicus HD58 và S. arabicus C3 vừa có tác dụng phân hủy tốt chất thải chăn
ni vừa có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh
Vì vậy với mong muốn tìm các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải
cellulose và góp thêm nguồn xạ khuẩn cho việc bổ sung vào các chế phẩm xử lý chất
thải hữu cơ chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt có khả
năng phân giải cellulose ứng dụng trong xử lý rác thải hữu cơ”.
• Mục tiêu nghiêm cứu:
Phân lập các củng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải cellulose
• Nội dung nghiên cứu:
➢ Phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải cellulose từ đất ở suối
nước nóng và pha sinh nhiệt của đống ủ phân compost ở 50oC.
➢ Sàng lọc và xác định hoạt tính phân giải cellulose của xạ khuẩn ưa nhiệt.
4
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
PHẦN 1: TỔNG QUAN
TÀI LIỆU
5
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH TRẠNG Ơ NHIỄM MƠI TRƯỜNG TẠI
VIỆT NAM
1.1
Thực trạng về mơi trường
Hình 1. 1. Xử lý rác thải sinh hoạt bằng cách chôn lấp, đốt
Nguồn: Đồng bộ các giải pháp xử lý rác thải sinh hoạt
( />Hiện nay, đi đơi với q trình cơng nghiệp hóa hiện đại hóa, sự phát triển cơng
nghiệp ngày càng mạnh mẽ thì vấn đề ơ nhiễm là mối lo ngại lớn. Chúng ta không xử lý
kịp lượng rác thải và phần lớn rác thải sinh hoạt ở Việt Nam vẫn được xử lý bằng hình
thức chơn lấp.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế thì lượng chất thải cũng đang
tăng dần. Lượng chất thải rắn tại các đô thị được thu gom đạt 70% tổng lượng chất thải
rắn phát sinh. Trong khi đó, việc tái chế và tái sử dụng mới chỉ giảm khoảng 10 -12%
khối lượng rác thải. Do đó, mơi trường tại các địa phương đang ngày càng ơ nhiễm
nghiêm trọng. Bên cạnh đó sự gia tăng dân số, sự thay đổi lối sống tiêu dùng cá nhân
4
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
góp phần làm tăng về khối lượng rác thải mang lại ảnh hưởng rất lớn đến tình trạng mơi
trường (Hajilo, M và cs., 2017). Theo thống kê của Bộ Tài ngun & Mơi trường thì mỗi
năm, có 1,8 triệu tấn rác thải nhựa thải ra môi trường ở Việt Nam, trong đó có 0,28 triệu
– 0,73 triệu tấn thải ra biển (Anh, H., 2021). Rác thải nhựa đang trở thành thứ gây ơ
nhiễm mơi trường lớn nhất có ở lịng đất, trong khơng khí và cả dưới đại dương. Gây
ảnh hưởng nghiêm trọng, khi đốt sẽ làm ảnh hưởng đến mơi trường và sức khỏe của con
người.
Ngồi ra, một số dữ liệu đã chỉ ra rằng các thành phố lớn của Việt Nam (Hà Nội)
đứng trong nhóm 10 nước ơ nhiễm khơng khí hàng đầu Châu Á (Nguyen và cs., 2021).
Nguyên nhân nhân chủ yếu là do hoạt động của các nhà máy công nghiệp, đốt thải nhiên
liệu sinh ra các chất sulfur dioxide, do phương tiện giao thông đông đúc và bên cạnh đó
là hoạt động của con người (Pandey, 2016). Theo báo Cơng thương, trung bình mỗi năm
ở khu vực nông thôn phát sinh trên 13 triệu tấn rác thải sinh hoạt, nhưng tỷ lệ thu gom
chỉ đạt 40%, tỷ lệ tái chế chưa đạt đến 4%, còn những rác thải chưa được xử lý thì xả
trực tiếp ra môi trường. Vấn đề ô nhiễm rác thải sinh hoạt nông thôn đã tác động đến
môi trường sống và cả cuộc sống của con người (Thị Minh Hạnh, 2014). Trên thực tế,
tại các vùng nông thôn Việt Nam vẫn còn tồn tại những phương thức quản lý rác thải
thiếu quy hoạch thông qua hàng loạt các bãi tập kết rác tự phát, hoạt động phân loại tại
nguồn chưa được đẩy mạnh và phương thức xử lý rác thải chủ yếu là chôn lấp với kỹ
thuật đơn giản, hoặc đốt bỏ tự phát tại mỗi hộ gia đình. Mơi trường khơng chỉ bị ơ nhiễm
bởi khí thải cơng nghiệp, khói thải, rác thải nhựa và ô nhiễm nguồn nước mà rác thải hữu
cơ cũng góp phần khơng ít.
Theo thống kê của Bộ NN&PTNT về chăn ni, cả nước hiện có khoảng 12 triệu
hộ gia đình có hoạt động chăn ni và 23.500 trang trại chăn nuôi tập trung. Với tổng
đàn khoảng 362 triệu con gia cầm, 29 triệu con lợn và 8 triệu con gia súc. Mỗi năm khối
lượng nguồn thải ra từ chăn nuôi ra môi trường khoảng 84,5 triệu tấn/năm, trong đó, chỉ
5
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
khoảng 20% được sử dụng hiệu quả (làm khí sinh học, ủ phân, ni trùn, cho cá ăn, …),
cịn lại 80% lượng chất thải chăn ni đã bị lãng phí và phần lớn thải ra môi trường gây
ô nhiễm (Nguyễn Thế Hinh, 2017). Cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta
các loại rác thải hữu cơ cũng gây sức ép không nhỏ đối với môi trường.
Theo báo cáo hiện trạng môi trường quốc gia giai đoạn 2016- 2020 quá trình phát
triển trong ngành trồng trọt sử dụng đa số phân bón hóa học làm mất cân bằng sinh thái,
thối hóa đất gây ơ nhiễm mơi trường nghiêm trọng. Bên cạnh đó sau mỗi mùa vụ các
phụ phẩm cây trồng chỉ được sử dụng và tái chế một phần nhỏ còn lại được đốt ngay tại
đồng gây phát sinh CO, NOX, bụi mịn càng làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường.
Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn- báo cáo kế hoạch 5 năm
của ngành nơng nghiệp 2021-2025 thì năm 2019 phụ phẩm cây trồng phát sinh trên cả
nước ước tính khoảng 94.715.000 tấn. Trong đó lớn nhất chính là cây lúa chiếm
52.140.000 tấn, cây mía là 16.914.000 tấn, các loại khác như mía, ngơ, cà phê khoảng
25.661.000 tấn. Khơng chỉ riêng đối với ngàn trồng trọt mà các ngành nuôi trồng thủy
hải sản, ngành chăn nuôi, cũng mang lại sự ô nhiễm cho môi trường bởi thức ăn dư thừa
và dịch bệnh. Vấn đề ơ nhiễm ln là một bài tốn khó kể cả ở Việt Nam và trên toàn
thế giới (Phạm Anh Cường và cs., 2016).
1.2
Một số thiệt hại gây ra bởi vấn đề ơ nhiễm
Ơ nhiễm mơi trường đã và đang gây ra nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng
cũng như các thiệt hại về kinh tế và xã hội. Khi con người uống và tiếp xúc với môi
trường nước bị ô nhiễm sẽ gây ra một số bệnh liên quan đến đường tiêu hóa, mắt, da…Ơ
nhiễm đất khơng chỉ gây ảnh hưởng đến con người mà còn ảnh hưởng đến nền nông
nghiệp. Tuy nhiên các phụ phẩm dư thừa của ngành nông nghiệp bị đốt tự phát do người
dân cũng gây khơng ít hậu quả. Khí CO, NO phát sinh làm ảnh hưởng đến sức khỏe, ảnh
hưởng đến môi trường, làm con người bị bệnh hô hấp và gây sương mù (Phạm Anh
6
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
Cường và cs., 2016). Báo cáo Gánh nặng Bệnh tật Toàn cầu (IMHE, 2019) đã chỉ ra các
yếu tố nguy cơ tử vong và tàn tật tại Việt Nam trong đó ơ nhiễm mơi trường khơng khí
đứng thứ 5 trong bảng xếp hạng. Thay vì đốt các phụ phẩm dư thừa thì hiện nay người
ta đã và đang tiếp tục nghiên cứu áp dụng các phương pháp vi sinh vào để xử lý ô nhiễm.
Trong số nhiều phương pháp được sử dụng thì ủ phân do các vi sinh vật ưa nhiệt làm
trung gian trở nên phổ biến và đem lại hiệu quả bền vững trong việc xử lý chất thải hữu
cơ (Leow và cs., 2018). Đây cũng là một yếu tố quyết định và giúp cho việc xử lý các
loại rác thải hữu cơ phân hủy nhanh và giúp chúng ta tận dụng triệt để các sản phẩm
nông nghiệp.
2. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT
2.1 Vị trí phân loại, phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn thuộc ngành Actinobacteria, lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales
(Miyadoh, 1997), bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Trong tự nhiên, xạ
khuẩn phân bố rộng rãi trong đất, nước, rác, bùn, phân chuồng. Trong đất, xạ khuẩn
chiếm khoảng 20 - 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất bề mặt
(Mitra và cs, 2008; Proudyogiki, 2012). Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFUColony Forming Unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu (Nguyễn Lân
Dũng và cs., 2007). Xạ khuẩn có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc
axit yếu 6,8 - 7,5. Mặc dù xạ khuẩn có tốc độ phát triển chậm hơn nấm, nhưng chúng có
nhiều tính năng quan trọng hơn, đối với khả năng sinh sản, khả năng chịu nhiệt, khả năng
thích ứng với môi trường khắc nghiệt (Budihal và cs., 2016; Chang và cs., 2014; Saritha
và cs., 2013). Ban đầu chúng được coi là nhóm trung gian giữa vi khuẩn và nấm nhưng
hiện nay được công nhận là vi sinh vật nhân sơ (Waksman và cs., 1940). Xạ khuẩn là
các vi khuẩn Gram dương đa dạng về hình thái, hiếu khí với hàm lượng nucleotide G +
C cao (> 55%). Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy, có khả năng
7
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
hòa tan lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các
peroxidase ngoại bào (Ramachandra và cs.,1988; Pasti và cs., 1990).
2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có khuẩn lạc khơ và đa số dạng hình phóng xạ (action-), khuẩn thể có
dạng sợi phân nhánh như nấm. Khuẩn lạc xạ khuẩn có các nếp toả ra theo hình phóng xạ
(Actinomycetes). Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da,
dạng vơi, dạng nhung tơ hay dạng màng. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa dạng:
đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng...tùy thuộc vào loài và các điều kiện ngoại cảnh
(Nguyễn Lân Dũng và cs., 2007). Kích thước khuẩn lạc có thể thay đổi tùy từng loại và
điều kiện mơi trường
Hình 1. 2. Xạ khuẩn Streptomyces noursei
Nguồn: The Society for Actinomycetes Japan
( />Đa số xạ khuẩn có 2 loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn
ty cơ chất (substrate mycelium). Cũng có nhiều lồi chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng
có loại chỉ có khuẩn ty khí sinh như chi Sporichthya. Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề
8
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn và sinh ra bào tử. Sợi cơ chất
là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh
ra sắc tố thấm vào mơi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh.
Đây được xem là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Bào tử ở xạ khuẩn
được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty, các chuỗi bào tử có thể thẳng, xoắn… Các cuống
sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophrres) có thể riêng lẽ
hoặc phân nhánh (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2007).
Xạ khuẩn, đặc biệt là các loài ưa nhiệt, thành phần nổi tiếng của hệ vi sinh vật
phân trộn. Xạ khuẩn ưa nhiệt nhiệt sẽ phát triển tốt từ khoảng 55-60oC và cao hơn (Cross,
1981). Một số chủng sẽ phát triển ở nhiệt độ trung bình 28-40oC. Chúng có thể phát triển
trong phân chuồng ủ, trong các suối nước nóng, trong đống ủ phân compost. Xạ khuẩn
được biết đến với khả năng tạo ra chất kháng sinh và enzym cũng như khả năng phân
hủy các phân tử phức tạp và khó ăn mịn, đặc biệt là cellulose, lignocellulose và lignin,
điều này làm cho chúng trở nên đặc biệt quan trọng trong việc ủ phân (Crawford, 1988),
cũng như ứng dụng phân giải các loại rác thải hữu cơ. Theo nghiên cứu của Jurado và
cộng sự năm 2015 cho thấy rằng xạ khuẩn làm thúc đẩy quá trình ẩm hóa, vì vậy cúng
thường được nghiên cứu ứng dụng vào làm nguyên liệu ủ phân compost.
Ngoài ra các loài thuộc chi Streptomyces được xem là nguồn sản xuất chất kháng
sinh nhiều nhất (Qin và cs, 1994). Cho tới nay, trong khoảng hơn 8.000 chất và 657
kháng sinh được biết trên thế giới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra (Dhanasekaran và cs,
2012). Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng
nấm bệnh cây (Fusarium spp., Phytophthora spp., Botryosphaeria spp., Sclerotium
hydrophylum) có thể góp phần vào cơng tác bảo vệ cây trồng và xây dựng nền nơng
nghiệp an tồn và bền vững.
3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE
3.1
Sơ lược về enzyme cellulase
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
9
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
Cellulase là hệ enzyme xúc tác chuyển hóa cellulose thành cellobiose và cuối
cùng là glucose thông qua sự cắt đứt các liên kết -1,4-glucoside. Theo nghiên cứu của
Martin (2000), cellulase là phức hệ gồm hai nhóm enzyme là endoglucanase (EC 3.2.1.4)
và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) thủy phân liên kết -1,4-O-glycoside trong phân tử
cellulose theo hai cơ chế đảo ngược và giữ lại (Martin S, 2000)
Về cấu trúc cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit
amin, các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-. Cellulase từ các
nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể
hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các
amino acid trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc hồn chỉnh của các loại enzyme nhóm
endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi,
gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm
xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đi là vùng gắn kết với cellulose
(CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trị tạo liên kết với cellulose tinh thể.
Trong q trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân
giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nửa, hoạt
tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose.
Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự
có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết
trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông
thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến
hoạt tính xúc tác của enzyme (Watanabe and Tokuda, 2001).
Enzyme cellulase được chia thành 3 loại: Endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4),
Exo- β -1,4-glucanase: chia thành 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrodase (EC 3.2.1.74);
1,4-β-D-glucan cellobiohydrodase (EC.3.2.1.91) và β -glucosidase. Đối với Endo-β-1,4glucanase chúng hoạt động tốt nhất ở pH 5,5, nhiệt độ 55oC, bền ở 30 - 45oC, hoạt tính
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
10
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
cao ở pH = 6. Các dung môi hữu cơ ít ảnh hưởng tới enzyme này, nhưng với n-butanol
thì sẽ bị ảnh hưởng.
Hệ enzyme cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật:
dịch tiết dạ dày bị, các nhóm thân mềm. Cellulase có trong thực vật, trong hạt ngũ cốc
nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mạch, lúa mì…, và trong vi sinh vật như xạ khuẩn,
vi khuẩn, nấm sợi và nấm men (Watanabe and Tokuda, 2001).
Trên thế giới và cũng như ở Việt Nam đã tìm được nhiều chủng vi sinh vật có khả
năng sinh cellulose như Bacillus megaterium, cellulomonas flavigena (Võ Văn Phước
Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011) Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, Bacillus pumilis
(Nguyễn Đức Lượng, 2004; Ariffin và cs., 2006), Bacillus licheniformis (Aygan và cs.,
2011). Nguồn thu cellulase phong phú và hiệu quả nhất là từ vi sinh vật bởi quá trình thu
nhận và bảo quản enzyme cellulase từ động, thực vật khá phức tạp. Người ta thường thu
nhận enzyme cellulase từ xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli vi khuẩn:
Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…
3.2
Ứng dụng của enzyme cellulase
Các enzyme cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành cơng nghiệp
như: có trong các sản phẩm bổ sung, nước uống bổ sung. Trong công nghiệp sản xuất
rượu, cellulase được bổ sung vào để đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase,
dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng. Sản xuất bánh mì, thực phẩm chức năng. Cellulase
từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp
cho bánh mì (Saranraj P và cs., 2012).
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, cellulase cung cấp năng lượng cho
gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất
chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột. Vì thế, việc bổ sung cellulase
trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa
động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
11
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
Khi sử dụng chế phẩm A. niger có hoạt tính pectinase và cellulose hạt cà phê được
bóc vỏ bằng chế phẩm khơng cịn bị nhớt và hiệu suất bóc vỏ khá cao (Nguyễn Đức
Lượng và cs, 1999). Trong nhiều năm qua trên thế giới và cả ở Việt Nam, các chủng vi
sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để
xử lý rác thải sinh hoạt. Nguyễn Lan Hương và Hồng Đình Hòa (2003) đã phân lập và
tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung
vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều
chế phẩm vi sinh trong đó chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu
và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác
thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối
chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao
hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình
xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành
phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nơng nghiệp đã góp phần nâng cao năng
suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường (Lý Kim
Bảng và cs, 1999).
3.3
Cơ chế phân giải cellulose
Phân giải cellulose cơ bản là q trình sinh học được tạo ra và kiểm sốt bởi các
enzyme cellulase. Endoglucanase chịu trách nhiệm trong sự phân cắt ngẫu nhiên liên kết
β-1, 4-glycosidic dọc theo chuỗi cellulose. Exoglucanase cần thiết cho sự phân cắt đoạn
cuối chuỗi không biến đổi và phân tách các sợi cơ bản của tin thể cellulose và β-1, 4glucosidase thủy phân cellobiose và cellodextrin hòa tan thành glucose (Shewale, 1982;
Wiseman, 1983)
Trên thực tế, mặc dù đều sử dụng cơ chất cellulose nhưng cơ chế phân giải
cellulose của các loài vi sinh vật rất khác nhau (Wilson, 2008).
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
12
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
Cellulase có hoạt tính rất thấp đối với cellulose dạng tinh thể nhưng chúng có sự
tăng cường xúc tác rất cao là do chu kỳ bán rã dài của tinh thể cellulose.
Enzyme này cũng rất khác biệt so với hầu hết các enzyme khác, vì chúng phân
giải cơ chất khơng hòa tan. Điều này buộc chúng phải khuếch tán đến cơ chất và mang
những mẫu cơ chất khơng hịa tan ấy đến tâm hoạt động, trong khi các cơ chất hịa tan
thì khuếch tán và gắn vào tâm hoạt động của những enzyme khác.
4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải
cellulose
Việt Nam là một quốc gia có mức độ đa dạng vi sinh vật cao nên vấn đề khai thác
hiệu quả nguồn tài nguyên quý báu này đã và đang được quan tâm.
Trần Hoàng Dũng và cộng sự (2018) đã nghiên cứu tuyển chọn được các chủng
vi sinh vật phân giải cellulose thuộc cả 3 nhóm là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc để ứng
dụng xử lý rác thải giàu cellulose (Trần Hoàng Dũng và cs., 2018).
Đỗ Thị Tuyến (2021) đã phân lập được chủng XM6 thuộc lồi Streptomyces
thermocarboxydus có khả năng chịu được nhiệt độ lên tới 55oC, sinh trưởng tốt nhất ở
30oC - 45oC, có khả năng phát triển trong dải pH 5 - 9, nồng độ muối NaCl từ 0,5 - 7%
(Đỗ Thị Tuyến, 2021).
Tăng Thị Chính 2015, đã bổ sung 2 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces vào
chế phẩm vi sinh Sagi Bio-1 sử dụng để xử lý chất thải chăn ni (Tăng Thị Chính,
2015).
Y Zhao và cộng sự (2016) đã nghiên cứu cấy xạ khuẩn Streptomyces sp. và
Micromonospora sp. vào quá trình ủ phân gà. Kết quả cho thấy việc cấy ở các giai đoạn
khác nhau của quá trình ủ phân đã cải thiện hoạt động của cellulase, đẩy nhanh quá trình
phân hủy cellulose (Zhao, Y., 2016).
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
13
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
Việc sử dụng vi sinh vật phân giải cellulose sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý ô
nhiễm môi trường đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam nghiên
cứu và ứng dụng.
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
14
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
14
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
1. VẬT LIỆU
1.1
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 03 năm 2022 tại phịng thí
nghiệm Cơng nghệ vi sinh – cơ sở III, Trường Đại học Mở Tp. Hồ chí Minh.
1.2
Đối tượng nghiên cứu
➢ Mẫu đất suối nước nóng được thu tại Hội Vân - Bình Định
➢ Mẫu đất của pha sinh nhiệt của đống ủ phân compost thu tại La Ngà - Đồng Nai
1.3
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
❖ Thiết bị và dụng cụ
✓ Thiết bị: tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ni, máy vortex, máy ly tâm,
máy lắc, lị vi sóng, …
✓ Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, becher, que cấy, đèn cồn, các loại
micropipette và đầu típ tương ứng (100 - 1000 µL, 20 - 200 µL), …
❖ Hóa chất: Lugol, nalidixic acid, nystatin.
❖ Môi trường: Nước muối sinh lý 0,85%, Gause I + CMC
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1
Bố trí thí nghiệm
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tơi bố trí thí nghiệm như sơ đồ:
SVTH: PHẠM THỊ MỸ TIÊN
15
