Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - phát minh mới về cơ chế phân tử của quá trình tổng hợp kháng thể ppt

TCNCYH 28 (2) - 2004

116
Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - phát minh
mới về cơ chế phân tử của quá trình tổng hợp kháng thể

TS. Tạ Thành Văn
Bộ môn Hóa-Hóa sinh - Trờng Đại học Y Hà Nội

Giới thiệu chung
Một trong những bt ng của sự kiện hoàn
tất bản đồ gen ngời là bộ gen ngời chỉ chứa
đựng khoảng 30.000 gen và điều đặc biệt là con
số này chỉ gấp đôi so với số gen của ruồi dấm
và côn trùng [1]. Với một lợng gen nhỏ nh vậy
rất khó lý giải cho các quá trình sinh học tinh vi
của loài ngời, đặc biệt là hoạt động của hệ
thần kinh và hệ miễn dịch. Một lời giải thích có
sức thuyết phục hơn cả cho mối tơng quan
giữa số lợng gen với các quá trình sinh học tinh
tế và phức tạp của con ngời là: Sự biến đổi các
thông tin di truyền diễn ra ngay sau khi con
ngời đợc sinh. Điều này có nghĩa rằng bộ gen
ngời không phải là bất biến mà nó tơng tự
nh một bức tranh sinh động của cuộc sống
luôn biến đổi [2].
Tại hệ miễn dịch, một loạt biến đổi về
thông tin di truyền đợc diễn ra trong suốt quá
trình biệt hóa của các tế bào lympho. Quá
trình tạo kháng thể bao gồm hai giai đoạn kế
tiếp nhau. Giai đoạn một là giai đoạn không

phụ thuộc kháng nguyên và tế bào lympho T.
Giai đoạn này xảy ra ở gan bào thai và tủy
xơng, đợc lập trình và điều hòa một cách
nghiêm ngặt bởi các cytokine. Trong quá trình
này tế bào lympho B non sắp xếp các gen
của immunoglobulin bao gồm gen V (variable
gene), gen D (diversity gene) và gen J
(joining gene) để tạo ra tổ hợp VDJ gen liên
kết với vùng gen không biến đổi Cà. Cũng
chính từ đây tổ hợp gen mã hóa quá trình sinh
tổng hợp IgM đã đợc thiết lập. Giai đoạn hai
là giai đoạn phụ thuộc kháng nguyên và tế
bào lympho T. Quá trình này xảy ra ở tổ chức
lympho ngoại vi. Sau khi tiếp xúc với kháng
nguyên, tế bào lympho B phân chia để hình
thành cấu trúc lympho ngoại vi đặc biệt
(germinal center). Chính tại siêu cấu trúc này,
hai quá trình biến đổi của gen immonoglobulin
đã xảy ra bao gồm: 1) Quá trình tái t hp
gen (class switch recombination vit tt là
CSR) và quá trình siêu t bin (somatic
hypermutation vit tt là SHM). CSR thay thế
gen C
H
của immunoglobulin tổng hợp IgM
(Cà) bằng các gen C, C hoặc C (là các
gen quy nh tng hp IgG, IgE và IgA) để
chuyển quá trình tổng hợp IgM sang tổng hợp
IgG, IgE hoặc IgA mà không thay đổi tính đặc
hiệu kháng nguyên. SMH xảy ra trên gen V

của chuỗi nặng (H chain) và chuỗi nhẹ (L
chain). Quá trình này tạo ra các đột biến điểm
với số lợng cao đến hàng triệu lần so với
bình thờng. Quá trình đột biến một cách
chọn lọc này đã tạo ra một thế hệ kháng thể
có ái lực cao với kháng nguyên. Do vậy CSR
và SHM tạo ra các sản phẩm hoàn toàn khác
hẳn nhau, từ các cơ chất là ADN cũng khác
hẳn nhau. Chính vì vậy CSR và SHM đợc coi
là hai quá trình có cơ chế phân tử hoàn toàn
khác biệt. Tuy nhiên sự phát hiện ra
activation-induced cytidine deaminase (AID),
enzyme xúc tác s loi b gốc amine ca
cytidine bởi nhóm nghiên cứu của Honjo, T.
(1999) đã xóa bỏ hoàn toàn quan niệm này.
Cho đến nay AID đợc coi là cầu nối duy nhất
giữa CSR và SHM.
AID, phát minh mới trong miễn
dịch học
1. Quá trình phát hiện ra AID
Bằng kỹ thuật thiết lập th viện ADN b
sung (cDNA library) để phân tích và so sánh
sự khác biệt giữa các gen của dòng tế bào
lympho CH12F3-2 trớc và sau khi kích thích
bởi các cytokine TGF-, IL-4 và CD40L (nhằm
tạo ra quá trình CSR), nhóm nghiên cứu của
TCNCYH 28 (2) - 2004
Honjo, T. đã phát hiện ra AID [3]. Lợng ARN
thông tin (mARN) của AID trong tế bào
CH12F3-2 có CSR cao gấp 10 lần so với các

tế bào không có CSR. Gen AID có chiều dài
1,2-kb mã hóa 198 amino acid với trọng lợng
phân tử khoảng 24 kDa. Gen AID của ngời
và chuột giống nhau đến 98%, nằm ở vị trí
12p13 trên nhiễm sắc thể và điều đặc biệt là
chúng giống gen APOBEC-1 của chuột đến
30% trong đó trung tâm hoạt động
(deaminase motif) của ba gen trên hầu nh
giống nhau hoàn toàn. Dựa trên cơ sở này
các nhà khoa học đã xác định AID có hoạt
tính deaminase để chuyển C (cytosine) thành
U (uridine) trong cấu trúc điển hình WRCY
(R=G hoặc A, Y=T hoặc C, W=A hoặc T) [3].
Từ đây một giả thuyết cho cơ chế hoạt động
của AID đã đợc đề xuất trong đó AID tác
dụng trực tiếp vào các mRNA bằng chính hoạt
tính deaminase của mình, mà các mRNA đó
thì mã hóa các protein enzyme xúc tác cho
các quá trình CSR và SHM [2].


117

Hình 1. Quá trình tái tổ hợp các gen trên chuỗi nặng của immunoglobulin.
Vị trí các gen trên chuỗi nặng của
immunoglobulin chuột bao gồm: hình ô vuông
và hình bầu dục là exons và vùng gen công
tắc (S). Quá trình tổ hợp các gen V, D và J
xảy ra ở tủy xơng trong khi SHM và CSR xảy
ra ở các tổ chức lympho ngoại vi. Quá trình tổ

hợp các gen V, D và J đã chọn lựa mỗi loại
chỉ một gen để tạo ra một gen tổ hợp (V) cho
tế bào lympho B. SHM tạo ra các đột biến
trên gen tố hợp V nhằm tạo ra dòng tế bào
lympho B có khả năng tạo ra kháng thể có ái
lực cao với kháng nguyên. CSR tái tổ hợp gen
V với các gen C khác nhau bằng cách cắt bỏ
các gen nằm giữa hai gen công tắc (S). ADN
cắt bỏ tạo thành AND vòng.
2. Giả thiết về cơ chế hoạt động của
AID trong quá trình tái tổ hợp gen
immunoglobulin
AID đợc đánh giá là lĩnh vực nóng bỏng nhất
trong các ngành Y Sinh học trong vòng ba năm
trở lại đây. Tính từ khi đợc phát hiện vào năm
1999 đến nay trên thế giới đã có trên 150 công
To hop gen VDJ
n
R)
dot bien cho
loc (SHM)
ta'i to hop gen
(CS
san pham
trung gian
gen V
dot bien
ADN vo`ng tu do
S S S S S S
V

H
D
J
H
C
à
C

C
3
C
1
C
2b
C
2aC

C

S
Tuy
xuongTo c h u c l y m
pho ng
Ty
xng
san pham gen sau ta'i to hop
T hp
gen VDJ
oai vi
Sn phm gen sau tỏi t hp

ADN vũng t do
t bin
chn lc
(SHM)
Tỏi t hp gen
(CSR)
T chc
lympho
ngoi
vi
Sn phm
trung gian
Gen V
t bin
TCNCYH 28 (2) - 2004

118
trình khoa học liên quan đến AID đã đợc công
bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng nhất. Các
nhà khoa học đang cố gắng tìm ra cơ chế phân
tử của AID trong việc điều hòa hai quá trình CSR
và SHM đồng thời tìm hiểu nguồn gốc và cơ chế
của một số bệnh miễn dịch bẩm sinh liên quan
đến AID để từ đó nghiên cứu ứng dụng trong
điều trị. Hiện nay có hai giả thuyết về cơ chế hoạt
động của AID. Honjo, T. và cộng sự cho rằng
AID đóng vai trò nh APOBEC-1, trong đó AID
tác động trực tiếp lên các mRNA mà các mARN
này mã hóa tổng hợp các protein enzyme xúc
tác hai quá trình CSR và SHM [2, 4, 7]. Một số

nhóm khác lại chứng minh rằng AID tấn công
trực tiếp lên ADN bằng hoạt tính deaminase để
chuyển C thành U tại vùng gen S (switch gene),
tại điểm này chuỗi ADN bị bẻ gẫy và sau đó nhờ
hệ thống enzyme sửa chữa (N.H.E.J.) để nối lại
hai đầu gen tự do [5, 6]. Các nhóm đều đa ra
các bằng chứng thuyết phục để chứng minh cho
giả thuyết của mình. Tuy nhiên có một điểm
chung mà cả hai giả thuyết đều khẳng định là vai
trò quyết định của AID trong CSR và SHM thông
qua hoạt tính deaminase.
3. Đột biến gen AID gây hội chứng tăng
IgM bẩm sinh trên ngời
Vai trò của AID trong hội chứng tăng IgM
bẩm sinh type 2 ở ngời lần đầu tiên đợc
công bố bởi công trình nghiên cứu phối hợp
giữa nhóm nghiên cứu của Honjo, T và các
cộng sự ngời Pháp. Các dạng đột biến của
gen AID bẩm sinh bao gồm các đột biến
điểm, cắt hoặc thêm đoạn nucleotide. Các
bệnh nhân này đều nhập viện với các triệu
chứng lâm sàng của nhiễm trùng kéo dài nh
viêm phổi, ỉa chảy. Xét nghiệm máu của các
bệnh nhân này thấy lợng IgM tăng cao hàng
chục, hàng trăm lần so với bình thờng trong
khi nồng độ IgA, IgE và IgG lại rất thấp, thậm
chí không phát hiện đợc. SHM của gen
immunoglobulin giảm đáng kể hoặc không có.
Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy lách to, các
hạch lympho phì đại và không có cấu trúc

lympho siêu vi. Tạ Thành Văn và cộng sự đã
đa các gen AID đột biến này vào hệ
retrovirus vector sau đó gây nhiễm vào tế bào
lympho B của chuột nhắt đã bị loại bỏ gen
AID (AID knock out mice) và dòng tế bào sợi
NIH3T3 mang gen cơ chất cho SHM (mutated
GFP gene) để nghiên cứu quá trình CSR và
SHM in vitro [7]. Kết quả cho thấy đại đa số
các gen AID đột biến mất cả hai hoạt tính
CSR và SHM. Tuy nhiên gen AID đột biến tại
17 acid amin đầu C tận vẫn duy trì hoạt tính
SHM trong đó CSR hoàn toàn bị loại bỏ [7, 8].
Sử dụng kỹ thuật tủa miễn dịch (immuno-
precipitation) kết hợp với Western blot, tác giả
đã đa ra bằng chứng khẳng định thể hoạt
động của AID là dimer hoặc multimer. Bằng
siêu ly tâm phân tích sử dụng dòng tế bào
NIH3T3 chuột tổng hợp AID của ngời đợc
kết hợp với một phần của estrogen receptor
(ER) trong đó quá trình tổng hợp và hoạt hóa
AID-ER đợc điều hòa bởi tetracycline
promoter và 4-hydroxytamoxifen thông qua
estrogen receptor, Tạ Thành Văn và cộng sự
lần đầu tiên đã chứng minh thể hoạt động của
AID là một phức hợp có trọng lợng phân tử
rất lớn (3000 kDa) mà trong thành phần có
mRNA và HS 90 (heat shock protein 90) các
co-factor và các protein khác. Phát hiện này
có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu
cơ chế hoạt động phân tử của AID.

4. Hớng nghiên cứu hiện nay về AID
và triển vọng
Sự phát minh ra AID thực sự đã tạo ra một
bớc đột phá trong miễn dịch học. AID đóng
vai trò nh là một enzyme chìa khóa trong
quá trình sinh tổng hợp các kháng thể. Do vậy
việc nghiên cứu tìm ra cơ chế điều hoà hoạt
động của AID, thông qua đó điều hoà quá
trình tổng hợp các kháng thể sẽ đem lại một
ích lợi vô cùng lớn trong Y học. Chính vì vậy
các nhà khoa học trên thế giới đang đi sâu
nghiên cứu nhằm tìm ra:
- Cơ chế hoạt động phân tử của AID, cụ
thể nghiên cứu xác định cơ chất mà AID xúc
tác là ADN hay ARN.
- Co-factor tham gia vào quá trình xúc tác
của AID.

TCNCYH 28 (2) - 2004

119
- Liệu pháp điều trị gen cho các bệnh nhân đột
biến AID (hội chứng tăng IgM bẩm sinh type 2).
- Thể bất hoạt của AID (dominant negative
form) có tác dụng ức chế AID in vivo thông
qua đó ức chế quá trình sinh tổng hợp từng
dòng kháng thể khác nhau. iu ny cú th
a n vic nghiờn cu ứng dụng trong lâm
sàng (ví dụ ức chế sự tổng hợp IgE trong điều
trị các bệnh dị ứng).

Tài liệu tham khảo
1. Venter, J. C., Adams, M. D., Myers,
E. W. et al. The sequence of the human
genome. Science 291, 1304-1351, (2001).
2. Honjo, T., Kinoshita, K., Muramatsu,
M. Molecular mechanism of class switch
recombination: linkage with somatic
hypermutation. Ann. Rev. Immunol. 20, 165-
196 (2002).
3. Muramatsu, M., Sankaranand, V. S.,
Anant, S. et al. Specific expression of
activation-induced cytidine deaminase (AID),
a novel member of the RNA-editing
deaminase family in germinal center B cells.
J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
4. Doi, T., Kinoshita, K., Ikegawa, M.,
Muramatsu, M. & Honjo, T. De novo protein
synthesis is required for the activation-
induced cytidine deaminase function in class-
switch recombination. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100, 2634-2638 (2003).Petersen-Mahrt,
S. K., Harris, R. S. & Neuberger, M. S. AID
mutates E. coli suggesting a DNA
deamination mechanism for antibody
diversification. Nature 418, 99-103 (2002).
5. Dickerson, S. K., Market, E., Besmer,
E. & Papavasiliou, F. N. AID mediates
hypermutation by deaminating single
stranded DNA. J. Exp. Med.197, 1291-1296
(2003).

6. Van-Thanh, T., Nagaoka, H., Honjo,
T. et al. AID mutant analyses imply
requirement of class switch specific
cofactor(s). Nature Immunology 4, 843-848
(2003).
7. Van-Thanh, Ta and Honjo, T.
Response to Domain organization of
activation-induced cytidine deaminase.
Nature Immunology 4 (12), 1154 (2003).
(Bi vit c thc hin ti B mụn Húa Y
hc v Sinh hc phõn t, Khoa Y, Trng i
hc Kyoto, Nht Bn).
Summary
Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - a new discovery
of molecular mechanism for immunoglobulin synthesis

The immune system takes advantage of genetic alteration to amplify its diversity. During early
states of T and B lymphocyte differentiation, V(D)J recombination takes place to assemble variable
(V), diversity (D) and joining (J) segments of the V exon of the T cells receptor and immunoglobulin
gene. In the later states, antigen stimulation of mature IgM B lymphocytes induces two additional
genetic alteration events, namely class switch recombination (CSR) and somatic hypermutation
(SHM) in which
activation-induced cytidine deaminase (AID) has been known to be essential. Human
AID gene is mapped to chromosome 12p13 and encodes 198 amino acids. AID deficiency causes the
hyper-IgM syndrome (HIGM2) characterized by normal or elevated serum IgM levels with absence of
IgG, IgA and IgE. Studies on AID mutations in HIGM2 syndrome have revealed that loss-of-function
mutations are scattered in the entire 198 residues. The mutations of the C-terminal domain of human
AID resulted in loss-of-function of CSR, but retained SHM and E-coli mutagenesis activities. In
TCNCYH 28 (2) - 2004

120
addition, active AID forms multimer and huge complex including target mRNA, co-factors and some
other proteins.