Nghiên cứu định danh tác nhân bệnh đốm lá vi khuẩn cây cải ngọt docx

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008

14

Nghiên cứu định danh tác nhân
bệnh đốm lá vi khuẩn cây cải ngọt
IDENTIFICATION PATHOGEN CAUSED BACTERIAL LEAF SPOT DISEASE
ON CHINENSISE CABBAGE (
Brassica sinensis
)

Hoàng Xuân Quang
1
, Trần Văn Kỳ
(1)
,
Nguyễn Văn Lẫm
2
, Lê Đình Đôn
2


Abstract
Bacterial leaf spot was one the most important disease which caused severely
loss to yield of chinensise cabbage (Brassica sinensis) in Hồ Chí Minh city. The
disease symptom is often water-soaked spot on lesion margin of abaxial leaf
surface. The identification of bacterial strains was followed by Schaad (1988)
including experiments of Gram stain, color colonies on YDC medium and MS
medium, growth at 35
o
C, gelatin hydrolysis, protein digestation on skimmed-milk,

acid production from arabinose, mannose, and glucose. The result indicated that
bacteria were belong to negative Gram group. Colonies were convex, entire margin
and yellow on YDC medium and. The bacteria were fast growth between 25-35
o
C
but not growth above 35
o
C and slow growth below 20
0
C. The bacteria were able to
growth on MS medium with blue colonies, gelatin hydrolysis, protein digestation
with clear zone around the colonies. Yellow color around colonies on medium C of
dye was a consequence of acidification activities of bacteria on arabinonse, manose
and glucose. The causal agent of leaf spot disease on chinensise cabbage caused by
Xanthomonas campestris.
I. ĐặT VấN đề
Cải ngọt (Brassica sinensis L.)
được coi là cây rau ăn lá chủ lực ở
Tp.HCM và một số tỉnh phụ cận.
Bệnh đốm lá vi khuẩn là nguyên nhân
chính gây tổn thất đến năng suất rau
của những năm gần đây. Triệu chứng
của bệnh là các đốm bệnh xuất hiện
trên rải rác trên lá (hình bìa 2-1). Tác
nhân gây bệnh đốm lá trên cải bắp, cải
rổ ở Mỹ được xác định là do các dòng
vi khuẩn Xanthomonas campestris pv.
armoraciae (Lowell, 2001; Gaetan và
Lopez, 2005). Youfu và ctv (2002)
cho rằng bệnh đốm lá cây súp lơ ở Mỹ

do Psedomonas syringae pv.
maculicola. Theo Vicente và ctv
(2006), bệnh đốm lá vi khuẩn họ hoa
thập tự là do các vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. raphani
và Xanthomonas campestris pv.
armoraciae, Xanthomonas campestris

1.

Viện KHKTNN Miền Nam;
2
.
Đại học Nông Lâm Tp. HCM

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008

15
pv. campestris gây nên. Phạm Văn
Biên và Mai Thị Vinh (1985) đã xác
định bệnh đốm lá súp lơ ở Bình
Chánh (Tp.HCM) là do vi khuẩn
Pseudomonas sp. gây nên. Nghiên
cứu này là xác định tên loài của tác
nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải
ngọt ở Tp. HCM.
II. VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu bệnh đốm lá được thu thập từ
Củ Chi, Hoóc Môn và quận 12

Tp.HCM. Vi khuẩn từ các mẫu bệnh
mới được phân lập trên môi trường
PDA. Xác định vi khuẩn gây bệnh
theo quy tắc Koch. Việc định danh đến
giống và loài vi khuẩn gây bệnh bằng
các phản ứng sinh lý, sinh hóa được
thực hiện theo phương pháp của
Schaad (1988). Cụ thể: nhuộm Gram,
đặc tính khuẩn lạc trên môi trường
YDC agar, môi trường MS, sự hóa
lỏng Gelatin, sự phân giải sữa mất chất
béo trên môi trường YNA, phản ứng
tạo axít từ nguồn hyđrat carbon trên
môi trường Dye’s C và khoảng nhiệt
độ sinh trưởng, nhiệt độ tối cao, tối
thấp của vi khuẩn gây bệnh.
III. KếT QUả Và THảO LUậN
Phân lập vi khuẩn gây bệnh
Trên môi trường PDA, khuẩn lạc
của vi khuẩn từ mẫu lá bệnh có mầu
vàng tròn, hơi lồi, bề mặt nhẵn bóng
và rìa nhẵn (hình bìa 2-2).
Phản ứng nhuộm Gram của
khuẩn lạc phân lập từ đốm lá cải
ngọt
Kết quả nhuộm Gram cho thấy khuẩn
lạc có màu đỏ tươi (hình bìa 2 - 3A),
khác biệt rõ so với mầu tím của vi
khuẩn Gram dương Bacillus subtilis
(Hình bìa 3 - 3B). Theo Schaad (1988),

vi khuẩn nhuộm Gram âm thường có
màu hồng hoặc đỏ tươi và vi khuẩn
nhuộm Gram dương có mầu tím hoặc
xanh đen, kết luận này cũng tương tự
Jame và ctv (1992). Như vậy vi khuẩn
khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc
nhóm Gram âm.
Phản ứng của vi khuẩn gây bệnh
đốm lá cải ngọt trên các môi trường
nuôi cấy khác nhau
Nhóm vi khuẩn Gram (-) gây bệnh
cho cây trồng gồm các giống
Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia,
và Agrobacterium. Theo Schaad
(1988), sử dụng môi trường YDC để
phân biệt các giống trên là phù hợp.
Sau cấy 48 giờ ở nhiệt độ 28
o
C thấy
rằng khuẩn lạc của các dạng vi khuẩn
có màu vàng trên môi trường này
(hình bìa 2-4). Như vậy, vi khuẩn gây
bệnh đốm lá cải ngọt có thể là
Xanthomonas hoặc Erwinia. Kết quả
này phù hợp với Vauterin và ctv
(1995) khi nghiên cứu bệnh đốm lá sắn
do vi khuẩn Xanthomonas gây nên.
Để phân biệt hai giống Xanthomonas
và Erwinia, vi khuẩn được cấy trên môi
trường MS. Đây là môi trường có tính

chọn lọc cao để phân biệt vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae (Schaad,
1988). Trong điều kiện pH của môi
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008

16

trường là 7,4 và nhiệt độ 28
o
C, sau cấy
48 giờ thì khuẩn lạc của vi khuẩn gây
bệnh đốm lá cải ngọt và vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. citri đều
có màu hơi xanh. Trong khi đó, vi
khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn
cây cải ngọt có mầu vàng da cam (hình
bìa 2-5).
Như vậy, có thể khẳng định rằng
bệnh đốm lá cải ngọt do vi khuẩn
giống Xanthomonas gây nên.
ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh
trưởng phát triển của vi khuẩn gây
bệnh đốm lá cải ngọt
Trên môi trường PDA, sau 48 giờ có
sự khác nhau về sinh trưởng của các
dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải
ngọt. Hầu hết các dòng đều sinh trưởng
phát triển mạnh ở nhiệt độ 30
o
C; ở 20

o
C
vi khuẩn mọc chậm hơn và ngừng sinh
trưởng phát triển hoàn toàn ở nhiệt độ
40
o
C trở lên. Trong thí nghiệm này, nếu
kích thước đốm khuẩn lạc lớn hơn được
xem là có sự sinh trưởng phát triển
(hình bìa 2-6b); nếu đốm khuẩn lạc
không thay đổi so với ban đầu hoặc lớn
hơn chút ít được xem là sinh trưởng
chậm (hình bìa 2-6a) và nếu đốm khuẩn
lạc không mọc thì được coi là ngừng
sinh trưởng phát triển (hình bìa 2-6c).
Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu
Mân (1999), đại bộ phận vi khuẩn có
nhiệt độ thích hợp từ 20 - 30
o
C, tối đa
khoảng 35 - 37
o
C. Như vậy, vi khuẩn
gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc nhóm
ưa nhiệt trung bình. Theo Schaad
(1988), vi khuẩn gây bệnh cây thuộc
giống Xanthomonas có 3 loài
campestris, albilineans và axonopodis
có khả năng sinh trưởng phát triển ở
nhiệt độ 35

o
C. Do đó, loài vi khuẩn
gây bệnh đốm lá cải ngọt có thể là một
trong ba loài trên.
Sự hoá lỏng Gelatin của vi khuẩn
Sau 48 giờ nuôi cấy ở điều kiện 25
o
C
và khi nhuộm môi trường bằng dung
dịch HgCl
2
thì vòng phân giải trong suốt
xuất hiện xung quanh khuẩn lạc của vi
khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và dòng
đối chứng Xanthomonas campestris pv.
citri. Như vậy, đã xảy ra phản ứng hoá
lỏng Gelatin của vi khuẩn gây bệnh đốm
lá cải ngọt (Hình bìa 2-7).
Theo Schaad (1988), trong các loài
vi khuẩn gây bệnh cây giống
Xanthomans, chỉ có 2 loài
Xanthomonas campestris và
Xanthomonas fragariae gây hoá lỏng
Gelatin. Như vậy, vi khuẩn gây bệnh
đốm lá cải ngọt là một trong hai loài
trên.
Sự phân giải sữa mất chất béo
Với phương pháp cấy vi khuẩn
thành điểm trên môi trường đặc chứa
sữa mất chất béo, ở nhiệt độ 28

o
C sau
48 giờ thì vòng phân giải hình thành
xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn
gây bệnh đốm lá cải ngọt và dòng đối
chứng Xanthomonas campestris pv.
citri. Điều này chứng tỏ có sự hoạt
động của enzyme protease của vi
khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt (hình
bìa 2-8). Theo Ahaad (1988) và
Goszczynska (2000), chỉ có vi khuẩn
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008

17
loài X. campestris có khả năng thuỷ
phân protein, các loài khác thuộc
giống Xanthomonas gây bệnh cây
không thuỷ phân protein.
Như vậy, vi khuẩn gây bệnh đốm lá
cải ngọt thuộc loài Xanthomonas
campestris. Phản ứng của vi khuẩn tạo
axít từ các hyđrat carbon
Phản ứng tạo axít từ các hyđrat
carbon là quá trình lên men dưới sự
xúc tác của nhóm enzyme nội bào để
tạo ra năng lượng cho hoạt động sống
của vi khuẩn. Trong quá trình này đã
hình thành một số sản phẩm trao đổi
chất và chúng được tế bào tiết ra ngoài
môi trường. Dựa vào các chất tiết ra

môi trường để xác định được các
enzyme đặc trưng và từ đó định danh
được vi khuẩn gây bệnh (Jame, 1992).
Vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt
được thực hiện các thí nghiệm tạo axít
từ các đường đơn như glucose,
arabinose, manose. Dưới tác dụng của
men catalase ở vi khuẩn, đường bị lên
men tạo ra axít acetic, axít lactic
khuyếch tán vào môi trường tạo thành
mầu vàng. Thí nghiệm cho thấy vi
khuẩn gây bệnh đốm lá ở cải ngọt và vi
khuẩn đối chứng X. campestris pv. citri
đều xuất hiện vòng phân giải mầu vàng
xung quanh khuẩn lạc trên môi trường:
có phản ứng dương tính tạo axít từ
đường glucose (hình bìa 2-9a),
arabinose (hình bìa 2-9b) và manose
(hình bìa 2-9c). Trong khi đó, dòng đối
chứng với Pseudomonas spp. không
hình thành vòng phân giải mầu vàng,
tức là không sinh axít từ các đường
này.
Theo Schaad (1988), trong các loài
vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas
gây bệnh cây chỉ có loài vi khuẩn
Xanthomonas campestris tạo axít trên
từ cả ba loại đường arabinose, glucose
và manose. Các loài Xanthomonas
fragariae, X. albilineans, X.

axonopodis không tạo axít từ đường
arabinose, loài X. ampelina tạo axít từ
đường arabinose, nhưng không tạo axít
từ đường glucose và manose.
Kết quả của các phản ứng sinh lý và
sinh hóa khẳng định vi khuẩn gây
bệnh đốm lá cải ngọt có triệu chứng
như mô tả phần (1) là do Xanthomonas
campestris gây nên.
IV. KẾT LUẬN
Bệnh đốm lá cải ngọt là do vi khuẩn
Xanthomonas campestris gây nên,
thuộc nhóm Gram âm, khuẩn lạc tròn,
lồi, rìa nhẵn, màu vàng trên môi
trường PDA và YDC. Hóa lỏng
Gelatin, phân huỷ protein, tạo axít từ
các đường glucose, arabinose và
manose. Vi khuẩn thuộc nhóm ưa
nhiệt trung bình, nhiệt độ thích hợp từ
25-35
o
C, sinh trưởng chậm dưới 20
o
C,
ngừng sinh trưởng từ 40
o
C trở lên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gaetan, S. and Lopez. N., 2005.

First outbreak of bacterial leaf spot
caused by Xanthomonas campestris on
Canola in Argentina. Plant Disease
89: 683.
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008

18

2. Goszczynska, T., Serfontein. J. J.,
and Serfontein, S., 2000. Introduction
to practical phytobacterology. A
safrinet manual for phytobacteriology,
sponsored by SDC, Switzerland. 83
pages.
3. James, G., Cappuccino and
Sherman, N., 1992. Microbiology a
laboratory manual. Third edition. The
Benjamun/Cummings publishing
company. 462 pages.
4. Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân,
1999. Bệnh vi khuẩn và vi rút hại cây
trồng. NXB Giáo dục Hà Nội, trang
99-100.
5. Lowell, L. B., 2000. Crucifer
diseases. Vegetable diseases a
practical guid. AVRDC publication,
15-28.
6. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên,
1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng
rau ngoại thành Tp. Hồ Chí Minh. Báo

cáo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ
Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, 15
trang.
7. Schaad, N. W., 1988. Laboratory
guide for identification of plant
pathogenic bacteria. Second edition.
APS Express. 164 pp.
8. Vicente, J. G., Everett, B. and
Robert. S. J., 2006. Identification of
isolates that cause leaf spot of brassica
as Xanthomonas campestris pv.
raphani and pathogenic and genetic
comparison with related pathovars.
Phytopathology 96: 735-745.
9. Youfu, Z., John, P. D., and Carol
L. B., 2002. Detection survival and
sources of inoculation for bacterial
diseases. Plant Disease 8: 883-888.