Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô

Bộ Giáo dục
và Đào tạo
Viện Khoa học
và Công nghệ Việt nam


Viện Công nghệ Sinh học
********


Phạm thị lý thu



Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh
từ phôi non v xác định phơng pháp
chuyển gen thích hợp ở ngô


Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật
Mã số : 62.42.30.05





Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học

Hà Nội-2007
Công trình đợc hoàn thành tại:
- Viện Công nghệ Sinh học, VAST
- Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS




Ngời hớng dẫn khoa học:
PGS. TS. Lê Huy Hàm
PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh



Phản biện 1: GS. TS. Ngô Hữu Tình, Viện Nghiên cứu Ngô

Phản biện 2: GS. TSKH. Trần Đình Long, Hội Giống cây trồng Việt Nam

Phản biện 3: PGS. TS. Vũ Đức Quang, Viện Di truyền Nông nghiệp





Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc, họp tại Viện
Công nghệ Sinh học vào hồi 09 giờ 00 ngày 26 tháng 09 năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại th viện:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Công nghệ Sinh học

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
& CS và cộng sự
2,4- D Dichlorophenoxy acetic acid
Act1
Rice actin promoter: đoạn gen khởi động tách từ cây lúa
AS Acetosyringone
BAP 6-Benzylaminopurine
bar / pat
Phosphinothricin acetyltransferase gene = gen mã hoá
phosphinothricin acetyltransferase
bp base pair = cặp bazơ
CaMV35S Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter: đoạn gen khởi
động tách từ virus khảm xúp lơ
CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide
EC Embryogenic callus = mô sẹo phôi hoá
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
EPSPS

Gen tổng hợp 3-enolpyruvylshikimate-5-phos-phate
kháng glyphosate

Et-Br Ethidium bromide
gfp
Green fluorescent protein: gen chỉ thị mã hoá cho protein

phát huỳnh quang màu xanh
GMC Genetic Modification Crop =Cây trồng chuyển gen
gus
- Glucuronidase gene = gen mã hoá -glucuronidase
IAA 3-Indolyl acrylic acid
ISAAA International Service for the Acquisition of the AgriBiotech
Applications = Tổ chức Dịch vụ Quốc tế về tập hợp các ứng
dụng Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp
nptII
Neomycin phosphotransferase II gene = Gen mã hoá
neomycin
PCR Polymerase Chain Reaction
PPT Phosphinothricin
STF Tần số chuyển gen bền vững
T-ADN Transfer-DNA = ADN chuyển
Ti-plasmid Tumor inducing plasmid= plasmit gây khối u thực vật
TE Biểu hiện gen tạm thời
Ubi
Maize ubiquitin promoter: đoạn gen khởi động tách từ cây
ngô
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Lê Huy Hàm - Viện trởng,
và PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh - Phó Viện trởng Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, là những ngời thầy đã tận tình hớng dẫn, tạo
mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành
bản luận án này!
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Phòng Quản lí tổng hợp và cô Ngô Bích Liên - Chuyên viên phụ trách đào tạo

Viện Công nghệ Sinh học, đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt,
mọi thủ tục cần thiết trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành
luận án!
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Hinrich Harling, Trởng Bộ phận
R&D của Công ty Giống cây trồng KWS (CHLB Đức), TS. Reinhard Nehls, Giám
đốc điều hành Trung tâm nghiên cứu Planta; TS. Hong Wang, TS. Josef Kraus,
bà Magritta Wolter và các bạn đồng nghiệp Barbara Sellig, Heike Lehmann đã
hỗ trợ nhiệt tình và cho tôi những lời khuyên, ý kiến đóng góp rất bổ ích để tôi có
thể hoàn thành bản luận án này!
Trong thời gian qua, tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ nhiệt tình và những ý kiến
đóng góp bổ ích của các cán bộ, các bạn đồng nghiệp Phòng Thí nghiệm
Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật và Viện Di truyền Nông nghiệp. Nhân
dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả ngời thân trong gia đình
đã luôn luôn bên tôi, quan tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng vô cùng cám ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè
đã giành cho tôi.
H Nội, ngy 28 tháng 09 năm 2007
Phạm Thị Lý Thu

Những công bố của tác giả có liên quan
đến luận án
1. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), Đánh giá
khả năng sinh trởng, phát triển và tái sinh cây từ phôi non hai dòng
ngô nhập nội HR8 và HR9 trong điều kiện Việt Nam, Tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 9/2003, tr. 1154-1156.
2. Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh
(2003), ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng và tuổi phôi đến
khả năng tái sinh cây từ phôi non dòng ngô nhập nội HR8, HR9,
Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, 3/2003, tr. 39-43.

3. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), ảnh
hởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen ở ngô thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens", Tạp chí Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, 10/2005, 28-31.
4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2006), Hoàn
thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen, Tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 8/2006, 31-35.
5. Lê Huy Hàm, Phạm Thị Lý Thu, Nguyễn Thị Khánh Vân, Đỗ Năng
Vịnh, (2006), Một số thành tựu và ứng dụng của công nghệ sinh
học trong chọn tạo giống ngô ở Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị tổng
kết khoa học và công nghệ nông nghiệp 2001-2005 (Bộ Nông
nghiêp & PTNT, Viện Khoa học Nông nghiệp VN), Nhà Xuất bản
Nông nghiệp, tr.34-47.



1
Mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất đợc sử dụng làm
thức ăn cho ngời và gia súc. ở Việt Nam, ngô là cây lơng thực chính,
đứng thứ hai sau lúa. Trong thời gian qua, công tác chọn tạo giống ngô đã
có những chuyển biến hết sức tích cực, nhng nhìn chung công nghệ sinh
học vẫn cha đợc áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực này, đặc biệt là việc tạo
ra các giống ngô có đặc tính mới bằng kỹ thuật di truyền.
Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo đợc giống cây trồng
chuyển gen nói chung và cây ngô chuyển gen nói riêng thì việc xây dựng
quy trình biến nạp hiệu quả cao là một trong những đòi hỏi cần thiết (Vasil
& CS., 1992). Một yếu tố khác có ảnh hởng rõ rệt đến quá trình chuyển
gen vào cây ngô là tần số tái sinh cây thấp. Chỉ có một số ít dòng ngô có

khả năng tái sinh tốt nh A188, H99, Pa91, hầu hết các dòng ngô khác
không có khả năng này. Mặt khác, các dòng ngô có khả năng tái sinh cao
lại không mang các đặc tính nông học quý và thờng có nguồn gốc ôn đới
(Amrstrong & Green, 1985), rất khó thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt
đới nh ở nớc ta, vì vậy cần phải có những nghiên cứu để thích ứng các
quy trình tái sinh trong điều kiện của Việt Nam.
Có thể nói rằng, những hạn chế làm giảm khả năng ứng dụng công nghệ
gen trong chọn tạo giống ngô ở nớc ta là: i) Cha có hệ thống tái sinh
hiệu quả sử dụng cho chuyển gen; ii) Cha có nguồn gen và các vật liệu sử
dụng cho chuyển gen; iii) Cha có cán bộ lành nghề trong lĩnh vực tạo cây
trồng chuyển gen. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta cần
phải làm chủ đợc công nghệ ADN tái tổ hợp, xây dựng hệ thống chuyển
gen và đánh giá biểu hiện của gen chuyển.
Xuất phát từ những đòi hỏi thực tiễn của hớng nghiên cứu này, chúng
tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non
và xác định phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô.
2. Mục đích nghiên cứu


2
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh từ
phôi non, tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình biến nạp gen ở ngô.
Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào phôi ngô non sử dụng
súng bắn gen và vi khuẩn A. tumefaciens. Trên cơ sở đó, xác định đợc
phơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô, góp phần phát triển lĩnh vực
chọn tạo giống ngô bằng công nghệ sinh học.
3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng và hoàn thiện hệ thống tái sinh cây từ phôi ngô non.
Nâng cao hiệu quả tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phơng
pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh in vitro.

Cải tiến và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen.
Tạo dòng ngô chuyển gen.
Xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô thông qua A.
tumefaciens. Tạo dòng ngô chuyển gen
4. Những đóng góp mới của luận án
Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau:
1. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi
non ở ngô có hiệu quả cao. Đây là quy trình tái sinh cây từ phôi non đầu
tiên đợc nghiên cứu khá đầy đủ và tối u hoá, có thể áp dụng để tái sinh
các dòng ngô khác nhau trong điều kiện Việt Nam.
2. Tạo đợc 5 dòng ngô có khả năng tái sinh cao từ vật liệu nhập nội và
trong nớc, thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam, có thể sử dụng làm
nguồn mẫu ban đầu cho các nghiên cứu biến nạp di truyền trong điều kiện
nớc ta.
3. Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã nghiên cứu và hoàn thiện quy
trình chuyển gen vào ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
và súng bắn gen. Các quy trình này sẽ là những quy trình kỹ thuật nền về
chuyển gen vào cây trồng nói chung và chuyển các gen mang các đặc tính
có giá trị vào cây ngô nói riêng, góp phần đ
a công nghệ tạo cây chuyển
gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền


3
thống, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại
trong tạo giống cây trồng.
4. Các dòng ngô chuyển gen tạo ra đã và đang đợc đánh giá nhằm mục
đích sử dụng làm nguồn vật liệu cho việc chọn tạo các giống ngô mang đặc
tính mới có giá trị kinh tế cao.
5. Bố cục của luận án

Luận án gồm 146 trang, 36 bảng và 36 hình.
Mở đầu (4 trang)
Chơng 1. Tổng quan tài liệu (40 trang)
Chơng 2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu (14 trang)
Chơng 3. Kết quả và thảo luận (65 trang)
Kết luận và đề nghị (2 trang)
Tài liệu tham khảo (25 tài liệu tiếng Việt và 182 tài liệu tiếng Anh)
Phụ lục (2 trang)
Chơng 1. Tổng quan ti liệu
1.1. Hệ thống nuôi cấy tế bào và tái sinh in vitro ở cây ngô
Một số hệ thống nuôi cấy in vitro đã đợc nghiên cứu khá đầy đủ và có
tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học cũng nh trong cải tạo giống
ngô bao gồm:
1.1.1. Nuôi cấy phôi hợp tử
1.1.1.1. Nuôi cấy phôi non
Nuôi cấy phôi non nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu
gây đột biến, chọn dòng vô tính, nuôi cấy tế bào trần, chuyển gen và phân
lập gen. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy phôi non phụ thuộc vào: kiểu
gen, tuổi phôi, thành phần môi trờng và điều kiện nuôi cấy.
1.1.1.2. Nuôi cấy phôi trởng thành
Nuôi cấy phôi trởng thành có nhiều u điểm hơn so với nuôi cấy phôi
non: phôi dễ tách, có thể có số lợng lớn và luôn chủ động về nguồn vật
liệu ban đầu.
1.1.2. Nuôi cấy bao phấn


4
Trong số các cây trồng quan trọng thì ngô thuộc loại cây rất khó ứng
dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy bao
phấn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu gen, môi trờng nuôi cấy, các biện

pháp kỹ thuật tác động nhằm tăng phản ứng của bao phấn đối với môi
trờng nuôi cấy, điều kiện sinh trởng của cây cho bao phấn.
1.1.3. Nuôi cấy hạt phấn tách rời
Tơng tự kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy hạt phấn tách rời cũng
gặp các khó khăn nh: sự hình thành cấu trúc phôi phụ thuộc vào kiểu gen,
tần suất xuất hiện phôi thấp. Ngoài ra, hệ thống nuôi cấy này đòi hỏi kỹ
thuật tách hạt phấn, thao tác vô trùng.
1.1.4. Nuôi cấy tế bào trần
Việc nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trần ở cây ngô có
ý nghĩa rất lớn cho công tác chọn tạo giống. Hai yếu tố quyết định đến sự
thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần là kiểu gen và thời gian nuôi
cấy dịch huyền phù tế bào.
1.1.5. Nuôi cấy noãn
Nuôi cấy noãn cha thụ tinh là một trong những hớng nghiên cứu để
tạo dòng thuần. Phản ứng tạo mô sẹo của noãn ngoài phụ thuộc vào kiểu
gen còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trởng của cây mẹ, yếu tố sinh thái
vùng, môi trờng và kỹ thuật nuôi cấy.
1.1.6. Nuôi cấy mô phân sinh chồi đỉnh
Hệ thống nuôi cấy này có u điểm là ít phụ thuộc vào kiểu gen, thao tác
tách mô phân sinh nhanh và đơn giản hơn so với việc tách phôi non. Mô
phân sinh chồi đỉnh là hệ thống nuôi cấy và tái sinh tiềm năng đối với các
nghiên cứu biến nạp di truyền ở cây ngô.
1.2. Hệ thống tái sinh hiệu quả sử dụng cho biến nạp di truyền ở cây ngô
Phôi hợp tử non là hệ thống tế bào đích lý tởng cho các nghiên cứu
chuyển gen ở ngô.
1.2.1. Sự phát triển của phôi hợp tử in vitro và các yếu tố ảnh hởng
Phát sinh hình thái các giai đoạn phát triển của phôi trong điều kiện in
vitro cũng tơng tự với quá trình phát triển của phôi ở trong cây. Mùa vụ
đã ảnh hởng đến sự phát triển của các tế bào tiền phôi. Thành phần môi

5
trờng nuôi cấy cũng rất quan trọng đối với sự phát triển của phôi. Việc
xác định đúng vị trí đặt phôi trên môi trờng nuôi cấy là rất cần thiết. Kiểu
gen có ảnh hởng nhiều đến sự phát triển của phôi.
1.2.2. Hình thái và các dạng mô sẹo tạo thành trong nuôi cấy phôi non
Hầu hết các dòng ngô đều có khả năng tạo mô sẹo dạng I từ phôi non nuôi
cấy. Mô sẹo dạng II thờng đợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào huyền phù,
chỉ đợc hình thành và áp dụng trong chuyển gen ở các dòng ngô mô hình.
1.2.3. Các yếu tố chính ảnh hởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh
cây từ phôi non
Bao gồm các yếu tố sau: kiểu gen, kích thớc phôi, môi trờng nuôi cấy:
chất điều hoà sinh trởng, đờng, axit amin, chất tạo giá thể
1.3. Các phơng pháp chuyển gen ở thực vật
1.3.1.Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
1.3.1.1. Hệ thống chuyển gen in vitro
Hệ thống chuyển gen in vitro đòi hỏi phải có đợc sự kết hợp giữa sự
xâm nhiễm của A. tumefaciens và khả năng tái sinh của tế bào thực vật sau
khi lây nhiễm với vi khuẩn.
1.3.1.2. Hệ thống chuyển gen in vivo
Phơng pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi
cấy mô và tái sinh sau biến nạp.
1.3.2.Chuyển gen trực tiếp
Phơng pháp chuyển gen trực tiếp đợc áp dụng với nhiều kỹ thuật nh:
Biến nạp bằng súng bắn gen
Biến nạp bằng hoá chất
Biến nạp bằng xung điện
1.3.3. Các phơng pháp chuyển gen khác
Phơng pháp vi tiêm, vĩ tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen
nhờ kỹ thuật siêu âm, silicon carbide, agrolistic.

1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens


6
Đối với phơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens thì tần số biến nạp
phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. Các yếu tố
liên quan đến vi khuẩn: chủng, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt
tính của gen vir, loại vectơ, khả năng xâm nhiễm. Các yếu tố liên quan đến
thực vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của tế
bào đích, môi trờng nuôi cấy.
Cây ngô, một loài cây trồng khó tính trong chuyển gen thông qua
Agrobacterium, tần số chuyển gen đã đợc cải thiện bằng việc tối u hoá
một số yếu tố: thành phần môi trờng, điều kiện nuôi cộng sinh và phục
hồi Mặc dù vậy, các công trình chuyển gen thành công ở ngô vẫn bị giới
hạn bởi việc sử dụng vật liệu là dòng ngô A188 hoặc dòng lai trong đó
dòng A188 là bố hoặc mẹ.
1.5. Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen vào cây một lá mầm
Nhìn chung, ở các cây một lá mầm, do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào có
khả năng phôi hoá vì thế mà sau quá trình bắn gen các tế bào bị tổn thơng
nặng, làm giảm khả năng tái sinh cây, cây tái sinh thờng bất thụ và mất
hoạt tính của gen chuyển nạp. Hơn nữa, các cây tái sinh thờng có độ kết
hạt thấp, già hoá sớm, cây còi cọc.
Cây ngô chuyển gen hữu thụ cũng đã nhận đợc bằng phơng pháp bắn
gen, với tần số chuyển gen vào phôi non dòng A188 đạt trung bình 1%.
Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy có khá nhiều dòng ngô chọn lọc đã đợc
chuyển gen bằng phơng pháp này, phôi non là dạng mô đích thích hợp
nhất cho chuyển gen bằng súng bắn gen.
1.6. Một số đặc tính đã đợc cải thiện ở cây ngô bằng kỹ thuật di
truyền

Kỹ thuật di truyền đợc áp dụng đối với một số cây ngũ cốc quan trọng
và đã thu đợc những kết quả rất khả quan. Nhiều gen quy định các đặc tính
quan trọng đã chuyển vào các loài cây ngũ cốc. Hầu hết các dòng chuyển
gen này đợc trồng khảo nghiệm ngoài đồng ruộng, nhiều giống đã đợc
thơng mại hoá.
Đối với cây ngô, một số đặc tính đã đ
ợc cải thiện, bao gồm: Kháng
thuốc diệt cỏ; Kháng sâu bệnh; Chịu lạnh; Chín sớm; và cải thiện chất
lợng hạt


7
1.7. Tình hình nghiên cứu và thơng mại hoá cây trồng chuyển gen
1.7.1. Tình hình nghiên cứu ở nớc ngoài
Năm 2006 đánh dấu năm đầu tiên của thập niên thứ hai của cây trồng
chuyển gen (2006-2015). Trong vòng 11 năm qua (1996-2006), tổng diện
tích trồng cây GMC trên toàn cầu vào khoảng 577 triệu ha, đạt mức kỷ lục
vào năm 2006 với diện tích trồng 102 triệu ha. Theo báo cáo của Tổ chức
ISAAA, năm 2006 cây GMC đã đợc trồng ở 22 nớc, với diện tích tăng
hơn năm 2005 là 12 triệu ha (13%). Hiện nay, Mỹ vẫn là nớc có diện tích
trồng cây GMC lớn nhất thế giới, đạt 54,6 triệu ha. Các cây GMC mang từ
hai gen trở lên đang là xu hớng quan trọng và sẽ ngày càng tăng trong
tơng lai.
1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nớc
Trong lĩnh vực chuyển gen tạo các sinh vật biến đổi di truyền, Việt Nam
vẫn còn xuất phát chậm hơn so với thế giới hàng chục năm. Nghiên cứu
chuyển gen vào cây trồng đang đợc tiếp cận, đầu t và triển khai, ứng
dụng chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của một số Viện. Tuy nhiên cũng
phải nhận thấy rằng, cho đến nay chúng ta vẫn cha tạo đợc giống cây
trồng chuyển gen, các nghiên cứu chuyển gen chỉ là những nghiên cứu lẻ

tẻ, không mang tính chất hệ thống và chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm.
Kết quả của những nghiên cứu trên là các cây chuyển gen đã tạo ra và lu
giữ in vitro và trong điều kiện nhà kính.
Chơng 2. nguyên liệu v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng, vật liệu, hoá chất và thiết bị
- 2 dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao HR8 và HR9; 9 dòng ngô
thuần Việt Nam; 11 dòng ngô lai F
1
giữa các dòng ngô Việt Nam và dòng
HR8/HR9;
- 7 plasmid, 2 chủng vi khuẩn E. coli và 3 chủng A. tumefaciens mang
vectơ chứa gen gus/gfp và nptII/pat.
Các nghiên cứu đợc thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện
KHNN Việt Nam và Trung tâm nghiên cứu Planta/KWS (CHLB Đức).
2.2. Phơng pháp


8
- Phơng pháp thí nghiệm đồng ruộng;
- Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào;
- Phơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN plasmid, ADN tổng số;
- Phơng pháp chuyển gen bằng súng bắn gen, thông qua A. tumefaciens
- Các phơng pháp phân tích cây chuyển gen: PCR, phép thử sinh học đối
với cây chuyển gen trong điều kiện nhà kính
Chơng 3. Kết quả v thảo luận
3.1. Xây dựng v hon thiện hệ thống tái sinh từ phôi non
3.1.1. Đánh giá khả năng sinh trởng và phát triển của 2 dòng ngô
nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện Việt Nam
Kết quả đánh giá sinh trởng, phát triển của dòng ngô HR8 và HR9 qua
các thời vụ trồng ở Việt Nam cho thấy, vụ đông là thời vụ thích hợp nhất

cho cả 2 dòng ngô HR8 và HR9. Tuy nhiên, các đặc tính nông học của
dòng HR9 biểu hiện kém hơn so với dòng HR8. Vì thế, chúng tôi đã chọn
dòng HR8 làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu tái sinh và biến
nạp gen.




3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh từ phôi non của 2 dòng ngô nhập nội
HR8, HR9 trong điều kiện Việt Nam
Dòng HR8 và HR9 có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây gần tơng tự
nhau, tần số tạo mô sẹo đạt 75,2 và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9% và
21,4% (ở dòng HR8 và HR9 tơng ứng). Tuy nhiên, khả năng sống sót và
mức độ hữu thụ của cây tái sinh dòng HR8 cao hơn so với HR9.
3.1.3. Nghiên cứu tối u hoá quy trình tái sinh cây từ phôi non
3.1.3.1. ảnh hởng của môi trờng dinh dỡng đến hiệu quả tạo mô sẹo từ
phôi non

1
2
3
4 5
6
Hình 3.1. Sinh trởng và phát
triển của dòng ngô HR8 (1-3) và
HR9 (4-6) qua các thời vụ trồng
trong điều kiện Việt Nam.


9

Phôi non dòng ngô HR8 đợc nuôi cấy trên các môi trờng tạo mô sẹo
có thành phần dinh dỡng cơ bản khác nhau. Kết quả bảng 3.4 cho thấy,
khả năng tạo mô sẹo dòng HR8 đã đợc cải thiện rõ rệt khi nuôi cấy phôi
non trong môi trờng có thành phần cơ bản N6.
Bảng 3.4. ảnh hởng thành phần khoáng và vitamin của môi trờng nuôi cấy đến khả
năng tạo mô sẹo và tái sinh dòng HR8
Ký hiệu
môi
trờng
Thành phần
môi trờng
cơ bản
Tổng số
phôi nuôi
cấy
Số mô
sẹo tạo
thành
Tỷ lệ tạo
mô sẹo
(%)
Số mô sẹo
phôi hoá
Tỷ lệ mô
sẹo phôi
hoá (%)
C1 MS 540 324 60,0 142 44,5
C2 N6 540 375 69,4 207 56,1
C3 N6 + MS 540 437 80,9 200 46,6
3.1.3.2. ảnh hởng của chất điều hoà sinh trởng (ĐHST) nhóm

auxin (2,4-D) đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non nuôi cấy
Kết quả thí nghiệm cho thấy, tần số tạo mô sẹo đạt giá trị cao nhất
(91,6%) khi bổ sung 2 mg/l 2,4-D vào môi trờng nuôi cấy. Khi tăng nồng
độ 2,4-D tới 4 mg/l, hiệu quả tạo mô sẹo giảm dần.
3.1.3.3. ảnh hởng của nitrat bạc đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
từ phôi non nuôi cấy

3.1.3.4. ảnh hởng của kích thớc và hình thái phôi nuôi cấy đến khả
năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non phụ thuộc nhiều vào
kích thớc phôi nuôi cấy. Nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng, phôi
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tỷ lệ (%)
01510152030
AgNO3 (mg/l)
Tỷ lệ tạo mô sẹo
Tỷ lệ tái sinh cây
Hình 3.3. ảnh hởng của AgNO
3
đến khả

năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non
dòng ngô HR8.
Kết quả hình 3.3 cho thấy, môi trờng
có bổ sung 10 mg/l AgNO
3
cho khả
năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ
phôi non dòng HR8 tốt nhất (90,5%
và 26,6%).


10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C16 C17 C18 C19 C20 C21
Môi trờng
T
ỷ

l
ệ

(
%)
Tỷ lệ tạo MS
Tỷ lệ MSPH
H
ình 3.
6
. Tạo mô sẹo phôi hoá từ phôi non
dòng ngô HR8 trên môi trờng có bổ sun
g
đờng khác nhau
non dòng HR8 có kích thớc 1-2 mm cho tỷ lệ tạo mô sẹo (54,4-83,3% )
và tái sinh cây cao nhất (17,7-26,6%).




3.1.3.5. ảnh hởng của đờng đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm
tạo mô sẹo trên môi trờng có bổ
sung 20 g/l sucrose kết hợp với một
loại đờng khác (mannitol; glucose;
sorbitol; fructose; maltose) với hàm
lợng 10 mg/l. Kết quả hình 3.6 cho
thấy, tần số tạo mô sẹo cũng nh mô
sẹo phôi hoá đạt đợc cao nhất trong
môi trờng có bổ sung 20 g/l sucrose
+ 10 g/l glucose.
3.1.3.6. ảnh hởng của chất tạo giá thể

Phôi non dòng ngô HR8 đã đợc nuôi cấy trong môi trờng sử dụng các
chất giá thể khác nhau: Gelrite (Sigma, G1910), agar (Sigma, A9915),
agarose (Sigma, typeI: low EEO, A6013) và Phytagel
TM
(Sigma, P8169).
Chúng tôi đã nhận đợc tần số tạo mô sẹo phôi hoá dạng I và II tơng
đối tốt trong môi trờng có Phytagel và agarose (75,5 và 80,8%). Tuy
nhiên, do giá thành của nguyên liệu, chúng tôi chọn phytagel làm chất tạo
giá thể trong các môi trờng nuôi cấy.
3.1.4. Quy trình tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu đợc, chúng tôi đã xây dựng và
hoàn thiện quy trình tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi ngô non. Quy trình
gồm các bớc nh sau:
i) Thu mẫu và tách phôi: sử dụng phôi có kích thớc khoảng 1-2 mm.
ii) Tạo mô sẹo
Hình 3.4. Tạo mô sẹo từ các
phôi nuôi cấy có kích thớc khác
nhau: mô sẹo tạo thành từ phôi
non có kích thớc 0,5 mm (1); 1-
2 mm (2);
>
3 mm (3); Mô sẹo
phôi hoá tạo thành từ phôi non
1-2 mm (4);

1 2
3 4


11

iii) Tạo mô sẹo phôi hoá
iv) Tái sinh chồi
v) Ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
3.2. Nâng cao hiệu quả tái sinh của các dòng ngô Việt Nam
bằng phơng pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh in vitro
Chúng tôi đã tiến hành các phép lai giữa dòng ngô Việt nam GA, GB,
G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GX2 với dòng ngô HR8/HR9 và đánh giá
khả năng tái sinh từ phôi non (FN) của các dòng lai (F
1
(FN). Lựa chọn các
dòng F
1
(FN) có khả năng tái sinh cao để tiếp tục các phép lai ngợc với các
dòng VN tơng ứng, kết hợp với tái sinh cây từ phôi non.
Bảng 3.12. Đánh giá khả năng tái sinh của các dòngngô chọn tạo bằng phơng pháp
lai hữu tính kết hợp tái sinh in vitro giữa dòng ngô Việt Nam và dòng HR8
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ tái sinh cây (%)
Dòng
lai
Thế hệ
F
1
(FN)
Thế hệ BC
1

BC
1
(FN)
Thế hệ BC

2

BC
2
(FN)
Thế hệ
F
1
(FN)
Thế hệ BC
1

BC
1
(FN)
Thế hệ BC
2

BC
2
(FN)
GAB
56,1 59,3 55,4 19,2 20,0 21,4
GA35
32,5 34,6 57,2 18,2 19,0 17,1
GCA8
75,3 58,0 74,7 22,5 20,8 20,3
GH35
52,2 49,3 59,0 21,4 19,8 19,6
GCH8

62,5 56,8 67,4 17,6 18,4 19,4
Kết quả bảng 3.12 cho thấy khả năng tái sinh cây của các dòng lai
ngợc BC(FN) giữa dòng F
1
(FN) và dòng Việt Nam cũng đã đợc cải thiện
rõ rệt so với các dòng mẹ Việt Nam ban đầu. Nhìn chung, tần số tạo mô
sẹo và tái sinh cây thay đổi không đáng kể giữa dòng lai tái sinh từ phôi
non F
1
(FN) với dòng lai ngợc thế hệ thứ 1 BC
1
(FN) và thứ 2 BC
2
(FN).
Chúng tôi đã thu đợc hạt của 5 dòng BC
2
(FN): GAB, GA35, GCA8,
GH35, và GCH8. Các dòng BC
2
(FN) này có khả năng sinh trởng tốt, thích
ứng trong điều kiện nớc ta và mang các đặc tính nông học u việt của
dòng ngô Việt Nam




12

Hình 3.14. Biểu hiện gus tạm
thời ở phôi bắn gen ngay sau

khi tách (a); phôi tiền nuôi cấy
3 ngày (b); phôi tiền nuôi cấy 5
ngày (c); phôi tiền nuôi cấy 7
ngày (d);





3.3. Xây dựng v hon thiện quy trình chuyển gen ở ngô
bằng súng bắn gen
3.3.1.Xây dựng quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen
Nhằm mục đích xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô
sử dụng súng bắn gen, chúng tôi đã nghiên cứu và tối u hoá một số yếu tố
chính ảnh hởng tới biểu hiện gen tạm thời và khả năng tái sinh của mẫu
mô sau khi bắn.
3.3.1.1. ảnh hởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến biểu hiện gen
tạm thời
Phôi non tiền nuôi cấy trong khoảng thời
gian khác nhau đã đợc sử dụng làm mô
đích bắn gen. Kết quả cho thấy, hoạt tính
gen gus đạt giá trị cao nhất khi phôi non
đợc tiền nuôi cấy 5 ngày (đạt 54,0 đốm
xanh/phôi bắn) (hình 3.14). Tơng tự, khả
năng tạo mô sẹo phôi hoá đạt đợc cao
nhất ở các phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày
trớc khi bắn (63,5%).

3.3.1.2. ảnh hởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện
gen tạm thời

Phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày đợc sử dụng làm mô đích cho bắn gen
với khoảng cách từ mô đích tới màng nổ: 6, 9, 12 cm; áp lực khí He: 900,
1100, 1350, 1550 và 1800 psi. Kết quả thu đợc cho thấy: khoảng cách từ


Hình 3.12. Các dòng ngô BC
2
(FN) đã tạo ra bằng phơng pháp lai hữu
tính kết hợp tái sinh in vitro
GH35
GCA8
GCH8
GAB
GA35


13
màng nổ tới mô đích có ảnh hởng rõ rệt tới tần số biểu hiện gen tạm thời.
Biểu hiện gen tạm thời đạt giá trị cao nhất khi bắn ở khoảng cách 9 cm với
áp lực bắn 1350 psi (đạt 53,2 đốm xanh/phôi).
3.3.1.3. Xác định đoạn gen khởi động thích hợp cho biến nạp vào phôi
ngô non bằng súng bắn gen
Phôi non tiền nuôi cấy 5 ngày đợc chuyển gen bởi các plasmid mang
đoạn gen khởi động khác nhau: Act1; Ubi và CaMV35S.
Số liệu bảng 3.15 cho thấy, biểu hiện gen tạm thời quan sát đợc cao
nhất trong thí nghiệm biến nạp với plasmid pAHC25 mang đoạn khởi động
Ubi (65,6 đốm/phôi).
Bảng 3.15. Biểu hiện gen tạm thời ở phôi non dòng ngô HR8 sau khi bắn gen với các
plasmid mang các đoạn khởi động khác nhau
Plasmid

Tổng số
phôi bắn
Tổng số đốm xanh/30
phôi bắn
Số đốm xanh trung
bình/phôi bắn
pDB1 246 1599,3126,9 53,34,2
pAHC25 257 1968,366,6 65,62,2
pTH-GUSINTPAT 238 960,360,0 32,02,0


3.3.1.4. ảnh hởng của hàm lợng hạt vàng đến biểu hiện gen tạm thời
và khả năng tái sinh của phôi sau khi bắn gen
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thử bắn gen vào phôi non dòng HR8
sử dụng hạt vàng 1,0 àm với hàm lợng/đĩa bắn khác nhau (20; 40; 80; 160
và 320 àg). Kết quả cho thấy, biểu hiện gus tạm thời tăng cùng với sự tăng
của hàm lợng vàng. Tần số tạo mô sẹo phôi hoá đạt giá trị cao nhất (72%)
và biểu hiện gen tạm thời tơng đối tốt (56 đốm/phôi) khi bắn với lợng
hạt vàng 80 àg/đĩa.
Hình 3.16. Biểu hiện gus tạm thời ở
phôi ngô non sau khi biến nạp với
plasmid mang đoạn khởi động
CaMV35S
(
1
)
và ubi
q
uitin
(

2
);

1
2


14
3.3.1.5. ảnh hởng kích thớc hạt vàng đến biểu hiện gus tạm thời và
khả năng tái sinh
Hạt vàng có kích cỡ khác nhau (1,0 àm và 0,6 àm) đã đợc bắn vào
phôi non dòng HR8 với hàm lợng 80 àg/đĩa bắn. Kết quả, chúng tôi đã
nhận đợc biểu hiện gus tạm thời cao nhất sau khi bắn với các hạt vàng có
kích cỡ 0,6 àm (60,8 đốm/phôi). Xét về khả năng tái sinh, mẫu sau khi bắn
với các hạt vàng có kích cỡ 0,6 àm có tần số tạo mô sẹo phôi hoá tốt hơn
cả (đạt 83,4%).
3.3.1.6. ảnh hởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển
gen tạm thời
Để đánh giá ảnh hởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen tạm
thời, chúng tôi đã xử lý phôi non dòng HR8 trong môi trờng OsM (0,2 M
mannitol + 0,2 M sorbitol) với khoảng thời gian trớc khi bắn (0; 5 giờ) và
sau khi bắn (0; 20 giờ). Kết quả thu đợc cho thấy, việc xử lý áp suất thẩm
thấu tế bào mô đích trớc và sau khi bắn gen đã có ảnh hởng rõ rệt đến
biểu hiện gen tạm thời.




Đáng chú ý là số đốm xanh quan sát đợc nhiều nhất trên những phôi
đợc xử lý áp suất thẩm thấu 5 giờ trớc và 20 giờ sau khi bắn gen (đạt

113,4 đốm xanh/phôi (hình 3.17.B).
3.3.2. Quy trình biến nạp bằng súng bắn gen
Trên cơ sở nghiên cứu các yếu tố chính ảnh hởng đến biểu hiện gen
tạm thời và khả năng tái sinh của mô chuyển gen, chúng tôi đã xây dựng và
hoàn thiện đợc quy trình biến nạp gen vào phôi ngô non bằng súng bắn
gen nh sau:
Chuẩn bị mẫu mô đích:
Phôi non (1-2 mm) tiền nuôi cấy 5-7 ngày. Xử lý áp suất thẩm thấu (môi
trờng OsM), 5 giờ.
H
ình 3.17. Biêủ hiện gus tạm thời
ở

p
hôi non dòng HR8 không xử lý áp suấ
t

thẩm thấu (A); đợc xử lý áp suất thẩm
thấu 5giờ trớc và 20 giờ sau khi bắn
g
en
(
B
)
;
A
B


15

Chuẩn bị mẫu ADN plasmid và hạt vàng (cho 6 đĩa mẫu)
500 g hạt vàng (0,6 m) đợc bọc bởi 5 g ADN plasmid .
Bắn gen:áp lực bắn: 1350 psi; Khoảng cách bắn: 9 cm; Sau khi bắn, xử lý
áp suất thẩm thấu (môi trờng OsM) 20 giờ.
Giai đoạn phục hồi: nuôi trên môi trờng CIM, trong tối, 25
o
C , 10 ngày.
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen:
Nuôi trên môi trờng chọn lọc ECM, trong tối, 25
o
C , 20 ngày.
Tạo chồi chuyển gen:
Nuôi trên môi trờng chọn lọc SM, nuôi sáng ở 25
o
C, 20 ngày.
Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh:
Nuôi trên môi trờng chọn lọc RM, nuôi sáng ở 25
o
C, 10-20 ngày.
Chuyển cây ra đất
Phân tích cây chuyển gen: PCR, lai Southern.
3.3.3. Tạo dòng ngô chuyển gen bằng phơng pháp bắn gen
áp dụng quy trình bắn gen đã hoàn thiện, chúng tôi tiến hành 6 thí
nghiệm chuyển gen gfp và gen pat (kháng thuốc diệt cỏ basta) vào 830
phôi non dòng ngô HR8. Kết quả, chúng tôi đã nhận đợc 314 mô sẹo phôi
hoá và 71 cây tái sinh trên môi trờng chọn lọc (có bổ sung 5 mg/l PPT).
Các cây tái sinh đợc chuyển ra đất trồng, sau đó thu mẫu lá để tiến hành
các phân tích sinh học phân tử.
3.3.4. Phân tích các dòng ngô chuyển gen
3.3.4.1. Phân tích PCR

ADN tổng số đợc tách chiết từ lá non của 71 cây dòng ngô HR8 tái
sinh đã đợc chuyển gen. Để xác định sự có mặt của các gen chuyển nạp
trong hệ gen của các cây ngô tái sinh bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi sử
dụng các cặp mồi đặc hiệu T1, T2 và T3, T4 (bảng 2.5). Đây là hai cặp mồi
thiết kế để có thể nhân đoạn ADN có độ dài 730 bp từ gen gfp và 847 bp từ
gen pat (gen kháng thuốc diệt cỏ).
Kết quả phân tích PCR của một số cây tái sinh đã đợc chuyển gen
trình bày trên hình 3.19 và 3.20.


16








Trong 71 dòng ngô HR8 tái sinh đã đợc chuyển gen, chúng tôi thu đợc
12 dòng có kết quả PCR nhân gen dơng tính: 6 dòng với sự có mặt của
gen pat, 2 dòng có gen gfp và 4 dòng mang cả gen gfp và gen pat.
3.3.4.2. Đánh giá các dòng ngô chuyển gen trong điều kiện nhà kính
Để đánh giá biểu hiện của gen kháng thuốc diệt cỏ (pat) trong các dòng
ngô HR8 chuyển gen, chúng tôi tiến hành phun dung dịch Basta (250mg/l
PPT) lên lá của các dòng chuyển gen này ở giai đoạn 2-3 lá mới xuất hiện
sau khi chuyển ra đất. Kết quả sau 10 ngày phun, ở các cây đối chứng
(không đợc chuyển gen) tất cả lá đều héo rũ, cây chết, các cây đợc
chuyển gen pat vẫn phát triển bình thờng. Hầu hết các dòng chuyển gen
tái sinh khi chuyển ra trồng trong đất đều biểu hiện kiểu hình bình thờng.

Một số cây tái sinh biểu hiện sự thay đổi về kiểu hình, nh giảm chiều cao,
hoặc hình thành bắp lẫn với cờ (hình 3.25).




3.4. Xây dựng v hon thiện quy trình chuyển gen ở ngô nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens
3.4.1. Xây dựng quy trình biến nạp gen thông qua A. tumefaciens
Để xây dựng đợc quy trình chuyển gen vào phôi ngô non nhờ vi khuẩn
A tumefaciens, chúng tôi đã nghiên cứu một số yếu tố chính ảnh hởng đến

1
2 3
4
H
ình 3.19. Kết quả phân tích
P
CR các dòng ngô HR8 tái sinh
(đối với gen gfp)
730bp
H
ình 3.20. Kết quả phân tích PCR
các dòng ngô HR8 tái sinh
(đối với gen pat).

847b
p
Hình 3.25. Đánh giá các dòng ngô
HR8 chuyển gen pat trong nhà kính.

Biểu hiện kháng thuốc diệt cỏ basta
(1); Các dòng ngô HR8 chuyển gen
hữu thụ (2); Hạt chuyển gen R1 (3);
Cây tái sinh bị biến dị (4).


17
biểu hiện gen tạm thời và hiệu quả xâm nhiễm của vi khuẩn vào phôi non
dòng ngô HR8.
3.4.1.1. Lựa chọn chủng A. tumefaciens và vectơ thích hợp cho biến nạp
gen ở ngô
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành lây nhiễm phôi non dòng ngô
HR8 với 3 chủng vi khuẩn A. tumefaciens ATHV, LBA4404 và AGL1
mang vectơ nhị thể pBINGUSINT và pSB11-PAT-ubi-GUSINT. Kết quả
thu đợc cho thấy, trong số 3 chủng Agrobacterium mang vectơ
pBINGUSINT thì chủng ATHV xâm nhiễm có hiệu quả nhất vào phôi ngô
non dòng HR8, biểu hiện gen tạm thời đạt 49%. Xét ảnh hởng của vectơ
chuyển gen đến biểu hiện gen tạm thời: kết quả cho thấy biến nạp với vectơ
pSB11-PAT-ubi-GUSINT cho tần số biểu hiện gen tạm thời thấp hơn nhiều
so với vectơ pBINGUSINT ở cả 3 chủng Agrobacterium.




Hình 3.26. Biểu hiện gen tạm thời ở phôi non dòng ngô HR8 sau khi biến nạp
với các chủng Agrobacterium mang các vectơ khác nhau
Trên cơ sở kết quả này chúng tôi đã lựa chọn chủng ATHV mang vectơ
nhị thể pBINGUSINT để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.1.2. ảnh hởng của kích thớc phôi nuôi cấy đến mức độ xâm nhiễm
của A. tumefaciens

Phôi non đợc tách từ các bắp non dòng ngô HR8 có kích thớc khoảng
0,5-3 mm và lây nhiễm với chủng ATHV(pBINGUSINT).
Bảng 3.23. Tơng tác giữa kích thớc phôi nuôi cấy và mức độ xâm nhiễm của vi
khuẩn Agrobacterium trong biến nạp gen ở ngô
Kích thớc phôi
(mm)
Số phôi lây
nhiễm
Số phôi
nhuộm GUS
Số phôi có
đốm xanh
Biểu hiện gen
tạm thời (%)
<0,5
192 192 79 41,1
0,5 126 118 58 49,1
0,5-1 250 168 70 41,6
ATHV(pBINGUSINT) AGL1(pBINGUSINT)


18
1-1,5 186 186 134 72,0
2-3 304 304 83 27,3
Kết quả thu đợc ở bảng 3.23 cho thấy tần số chuyển gen tạm thời đạt
giá trị cao nhất (72%) ở những phôi có kích thớc từ 1-1,5 mm, Tần số
chuyển gen tạm thời đạt giá trị rất thấp ở phôi non có kích thớc lớn hơn 2
mm (chỉ đạt 27,3%). Mật độ đốm xanh cũng nh mức độ biểu hiện của gen
gus quan sát thấy nhiều nhất ở những phôi có kích thớc 1-1,5 mm.
3.4.1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào mô sẹo tạo thành từ phôi non nhờ

A. tumefaciens
Phôi non dòng ngô HR8 sau khi tách đợc nuôi cấy trên môi trờng tạo
mô sẹo với khoảng thời gian: 0, 4, 8 và 12 ngày. Mô sẹo tạo thành từ nuôi
cấy phôi non có độ tuổi khác nhau đã đợc thử lây nhiễm với chủng
Agrobacterium ATHV(pBINGUSINT). Kết quả thu đợc ở bảng 3.24.
Bảng 3.24. Lây nhiễm mô sẹo tạo thành từ phôi non nuôi cấy với Agrobacterium
Phôi non tiền nuôi cấy trên
môi trờng tạo mô sẹo (ngày)
Số phôi
lây nhiễm
Số phôi
nhuộm GUS
Số phôi có
đốm xanh
Biểu hiện gen
tạm thời (%)
0 347 148 73 49,3
4 194 154 5 3,2
8 346 220 17 7,7
12 462 280 23 8,2
Chúng tôi thấy rằng với hầu hết các phôi đợc tiền nuôi cấy trong môi
trờng tạo mô sẹo từ 8-12 ngày, không có sự xâm nhiễm hoặc mức độ xâm
nhiễm rất kém ở phần tế bào scutella. Ngợc lại, biểu hiện tạm thời của
gen gus với sự xuất hiện của nhiều đốm xanh đậm tập trung trên phần tế
bào scutella, đặc biệt là ở phần mép của các phôi đợc lây nhiễm ngay sau
khi tách đạt đợc tơng đối cao (49,3%).
3.4.1.4. ảnh hởng của acetosyringone (AS) đến hiệu quả chuyển gen
Phôi non dòng ngô HR8 sau khi tách đợc lây nhiễm và nuôi cấy cộng
sinh trên môi trờng IM và CCM có bổ sung AS ở các nồng độ 0, 50, 100,
200 và 400 mM. Chủng vi khuẩn ATHV(pBINGUSINT)đã đợc sử dụng

để lây nhiễm.


19
Kết quả thu đợc ở bảng 3.25 cho thấy việc bổ sung AS vào môi trờng
đã có tác động rất rõ rệt đến khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn
Agrobacterium vào mô thực vật, tần số biểu hiện gen tạm thời dao động từ
31,6-54,9%.
Bảng 3.25. ảnh hởng của acetosyringone (AS) đến biểu hiện gen tạm thời
Nồng độ AS
(mM)
Số phôi lây
nhiễm
Số phôi quan
sát
Số phôi có
đốm xanh
Tần số biểu hiện gen
tạm thời (%)
0 285 285 0 0
50 351 351 111 31,6
100 366 366 182 49,7
200 333 333 183 54,9
400 283 283 107 37,8
Chúng tôi đã thu đợc tần số biểu hiện gen tạm thời cao nhất ở môi
trờng lây nhiễm và đồng nuôi cấy có bổ sung 200 mM AS (đạt 54,9%).
Tuy vậy, khi tăng nồng độ AS tới 400 mM thì tần số biểu hiện gen tạm thời
bắt đầu giảm (37,8%).
3.4.2. Quy trình biến nạp gen ở ngô thông qua A. tumefaciens
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu đợc, chúng tôi đã hoàn thiện quy

trình biến nạp gen vào ngô thông qua A. tumefaciens nh sau:
Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn
Cấy Agrobacterium (-20
0
C) trên đĩa môi trờng LB đặc có bổ sung
kháng sinh thích hợp, nuôi ở 21
0
C trong 2-3 ngày.
Lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trờng LB lỏng có bổ sung
kháng sinh thích hợp, nuôi lắc 160 vòng/phút, 28
0
C, qua đêm.
Ly tâm dịch vi khuẩn nuôi cấy (5000 vòng/phút, ở 4
0
C, 5 phút).
Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong môi trờng IM và điều
chỉnh OD
600
0,5-1,0.
Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và nuôi cộng sinh
Lây nhiễm phôi non ngay sau khi tách với dịch vi khuẩn vừa chuẩn bị,
lắc nhẹ ở 25
0
C, thời gian 1 giờ. Nuôi cộng sinh trong môi trờng CCM,
nuôi tối ở 21
o
C trong 4 ngày.
Nuôi phục hồi

20
Chuyển phôi sang môi trờng ReM, nuôi tối ở 25
o
C , 7 ngày.
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành đợc cấy chuyển sang môi trờng SeM có bổ sung
kháng sinh chọn lọc thực vật tơng ứng, nuôi tối ở 25
o
C, 20 ngày.
Tạo chồi chuyển gen
Mô sẹo phôi hoá tạo thành đợc cấy chuyển sang môi trờng chọn lọc
SeM mới, nuôi sáng ở 25
o
C, 20 ngày.
Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh đợc cấy chuyển sang môi trờng RM có bổ sung kháng
sinh chọn lọc thực vật thích hợp, nuôi sáng ở 25
o
C , 10-20 ngày.
Chuyển cây ra đất
Cây tái sinh có 2-3 lá, 3-4 rễ đợc chuyển ra đất trồng.
Phân tích cây chuyển gen
Tiến hành thu mẫu lá để thực hiện các phân tích sau: PCR; lai Southern;
3.4.3. Tạo dòng ngô chuyển gen bằng phơng pháp biến nạp nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens
áp dụng quy trình biến nạp đã đợc hoàn thiện, chúng tôi tiến hành 7
thí nghiệm chuyển gen vào 955 phôi non dòng HR8 với chủng
ATHV(pBINGUSINT) chứa gen gus và nptII (kháng kanamycin).
Chúng tôi đã nhận đợc 745 mô sẹo từ 955 phôi lây nhiễm. Các mô sẹo
này tiếp tục đợc nuôi cấy chọnlọc trên môi trờng có bổ sung 100 mg/l

paromycin. Cuối cùng, 80 cây đã đợc tái sinh trong môi trờng chọn lọc.
Các cây chuyển gen tái sinh đợc chuyển ra đất trồng, sau đó thu mẫu lá để
tiến hành các phân tích sinh học phân tử.
3.4.4. Phân tích các dòng ngô HR8 chuyển gen
3.4.4.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng ngô HR8 chuyển
gen
Lấy chồi và rễ cây tái sinh đã đợc chuyển gen ngâm vào dung dịch X-
Gluc, ủ ở 37
o
C trong 24 giờ. Kết quả cho thấy chồi và rễ của các cây đợc
chuyển gen gus đều chuyển màu xanh, còn chồi và rễ của cây tái sinh bình
thờng không có màu xanh (hình 3.31).


21

Hình 3.31. Biểu hiện của gen gus ở chồi (1) và rễ cây ngô tái sinh (2) từ phôi non đã
đợc chuyển gen; chồi (3) và rễ (4) cây ngô tái sinh từ phôi non không đợc chuyển gen
trong dung dịch X-Gluc.
3.4.4.2. Phân tích PCR
Tách chiết ADN tổng số từ lá non của 80 dòng ngô HR8 chuyển gen tái
sinh và tiến hành phân tích PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu T5, T6; T7,
T8, và T9, T10 đã đợc thiết kế để có thể nhân đoạn ADN có độ dài 1231
bp từ gen gus, 550 bp từ gen nptII và 224 bp từ gen vir.





Kết quả phân tích PCR cho thấy, tất cả 80 dòng ngô HR8 chuyển gen tái

sinh đều không mang gen vir (hình 3.34), trong số đó chúng tôi thu đợc
15 dòng có kết quả dơng tính: 3 dòng mang gen gus (hình 3.32), 8 dòng
với sự có mặt của gen nptII (hình 3.33), và 4 dòng mang cả gen nptII và
gen gus.







Hình 3.32. Kết quả phân tích PCR các
dòn
g
n
g
ô HR8 đã đ
ợ
c chu
y
ển
g
en
g
us
1231b
p
H
ình 3.
3

3. Kết quả phân tích PCR các
dòng ngô HR8 đã đợc chuyển gen nptII
550b
p
H
ình 3.34. Kết quả phân tích PCR
các dòng ngô HR8 đã đợc chuyển
gen thông qua A. tumefaciens (kiểm
tra sự có mặt của gen vir)
1
3
2
4