Nghiên cứu xác định nấm Aspergillus sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phản ứng pcr đặc hiệu pot

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NẤM Aspergillus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
TRÊN LẠC BẰNG PHẢN ỨNG PCR ĐẶC HIỆU
Trần Tuấn Tú, Đàm Quang Hiếu,
Hoàng Thị Ngát, Lê Huy Hàm
và Phạm Xuân Hội
Summary
Identification of Aspergillus flavus induced Aflatoxin in peanut in the orth of
Vietnam using PCR method
Aflatoxins are carcinogenic metabolites produced by several members of Aspergillus group, such
as Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius.Number of methodologies have
been developed for detection of aflatoxin in grain and food, including thin-layer chromatography
(TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC), overpressured chromatography,
polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) At least, more
than 20 genes have been determined to be involved in Aflatoxin biosynthesis pathway. In which,
genes ver-1, omt-1 and apa-2 play an important role in the pathway. In this study, we use ver as a
target gene to detect peanut contaminated aflatoxin in the North of Vietnam by employing PCR
approach. Peanut samples on the field, household and market from different area have been
collected for isolating Aspergillus flavus induced Aflatoxin strains using from a separate hypha. A
primer pair complementing the coding portion of ver gene was generated. DNA extracted from
Aspergillus flavus, Aspergillus niger strains from Nghean, Haiduong and Hanoi provinces was used
as PCR template. Positive results as designed PCR products were observed only with all DNA
templates of Aspergillus flavus from different sources, while no PCR products were observed with
DNA templates of Aspergillus niger. The results is suggesting a posibility to use PCR as selective
method for early, accurate detection of aflatoxin contaminated in peanut as well as in grains and
foods.
Keywords: Aflatoxin, Aspergillus flavus, peanut, PCR, identification.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm sinh độc tố là một trong những tác
nhân gây bệnh phổ biến làm giảm chất lượng
và giá tr sn phNm nông nghip do sinh ra
các loi c t gây hi cho sc kho con

ngưi và vt nuôi. Ph bin nht trong nhóm
nm sinh c t là nm bnh Aspergillus spp.
(A. flavus; A. parasiticus; A. fumigatus ) có
kh năng sinh c t gây ung thư Aflatoxin.
Các chng nm này có ph hot ng rt
rng vì vy có kh năng lây nhim trên nhiu
loi nông sn như ngô, lc, bông, u
tương Các loi ht có du (c bit như
lc) rt thích hp cho s phát trin ca nm
Aspergillus spp. cũng như s hình thành c
t Aflatoxin.
Xut phát t thc t trên, ã có nhiu
phương pháp ưc nghiên cu và áp dng
trên th gii nhm phát hin sm ngun
nm bnh, iu này có ý nghĩa quan trng
trong vic hn ch tác hi nm bnh trên
nông sn. Phương pháp PCR ã ưc s
dng  phát hin các loi nm và vi khuNn
gây bnh và sinh c t trên nông sn, thc
phNm và các loi thc ăn gia súc, do tin
li, d áp dng, có kh năng phát hin sm
mm bnh k c khi chúng chưa sinh c
t. Có ít nht 20 gen tham gia vào con
ưng tng hp aflatoxin, mt s gen quan
trng trong s ó ã xác nh ưc trt t
nucleotid và chc năng như apa, omt, ver,
nor Trong nghiên cu này chúng tôi s
dng gen ver - mã hoá cho enzyme chuyn
versicolorin thành sterigmatocystin (tin
cht u tiên trong nhánh sinh tng hp

Aflatoxin B
1
- cht c nht và ph bin
trong nhóm Aflatoxin) làm gen ích 
bưc u xác nh s có mt ca nm bnh
Aspergillus sinh c t trên các mu lc thu
thp  mt s tnh min Bc Vit N am.
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
Các ging lc thu thp trong nhà dân,
trên ng rung và trên th trưng  các
tnh N gh An, Hi Dương và Hà N i ưc
s dng  phân lp ngun nm bnh. Cp
mi c hiu cho gen ver, các hóa cht s
dng trong sinh hc phân t phc v vic
tách chit ADN tng s si nm và các
nguyên liu cho phn ng PCR ưc mua
ca hãng Sigma, Fermentas
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Thu thp mu lc và thu nhn
nm bnh t mu lc. Các mu lc thu v
ưc bo qun trong phòng lnh  iu
kin 4 - 8
0
C ti B môn Bnh hc phân t
thc vt.  thu ưc nm bnh, chúng tôi
tin hành theo 2 cách: (i) t ht lc trc
tip trên ĩa petri có lót giy kh trùng
sch, gi trong iu kin 28

0
C và  Nm
khong 80%; (ii) Ct v ht lc t trên
môi trưng PDA c, gi  nhit  28
0
C.
Sau 3 - 5 ngày t mu, tin hành quan sát
si nm mc trên lc và v ht lc, xác
nh các im mc nm thích hp  tin
hành cy chuyn và phân lp.
2.2. Phương pháp phân lp nm: S
dng phương pháp tách si nm ơn 
làm thun các isolate. Trên ĩa môi trưng
c, tin hành cy chuyn bng cách ly
si nm ti các im ngoài rìa ca khuNn
lc  cy chuyn sang ĩa môi trưng
mi. Mi khuNn lc trên ĩa môi trưng
chn t 3 n 5 im  cy chuyn theo
nguyên tc ngu nhiên. Tin hành phân lp
nhng mu nm Aspergillus có c im
hình thái in hình trên c 2 loi môi
trưng PDA c (120 ml dch chit khoai
tây, 12 g dextrose, 10 g agar cho 1L môi
trưng - là môi trưng giàu dinh dưng) và
môi trưng Czapek c (là môi trưng
dinh dưng trung bình) cho n khi t ti
 ng u v màu sc và tc  phát
trin ca khuNn lc. Da vào các c im
nhn dng mu sc khuNn lc, hình dng
si nm, vt loang  li trên môi trưng

quan sát trên ĩa petri và kt hp vi hình
dng bào t, cung sinh bào t, th bình
quan sát trên kính hin vi chúng tôi tip
tc làm thun các isolate bng vic chn
lc và cy chuyn các mu nm trên môi
trưng c. Trên cơ s các c im nhn
dng trong quá trình phân lp, các mu
nm ưc phân thành các isolate A. flavus,
A. paraciticus hay A. niger. Sau ó, các
mu nm này ưc s dng làm nguyên
liu phc v cho các thí nghim tip sau.
2.3. Tách chit ADN tng s. Các mu
nm thu ưc trên môi trưng c ưc tip
tc nuôi cy lc 200v/p trong môi trưng
PDA và Czapek lng t 5 - 7 ngày,  28
0
C
 thu sinh khi. Sau khi ưc ra bng
nưc ct t 3 - 4 ln các mu nm ưc gi
trong t lnh sâu - 80
0
C làm nguyên liu
tách chit ADN tng s. Trong nghiên cu
này, chúng tôi ã s dng phương pháp
tách chit ADN tng s t nm Aspergillus
theo quy trình ca Eric W. Boehm. Cho 200
- 300 mg sinh khi nm ã ưc nghin nh
bng nitơ lng vào ng eppendorf 1,5 ml,
b sung 500 l dung dch tách chit
(100 mM Tris-pH 8.0, 10 mM EDTA, 2%

SDS, 1% β-mercaptoethanol),  mu 
65
0
C trong 1h, o u mu 5 phút mt ln.
B sung 300 l dung dch CTAB
(5M N aCl, 10% CTAB),  mu trong
30 phút. Tip ó, b sung thêm 450 l dung
dch chloroform-isoamyl alcohol t l 24:1
(v/v), o u và ly tâm 12000 vòng/phút
trong 15 phút. Chuyn pha dch trong phía
trên sang ng mi, b sung 600 l dung
dch isopropanol lnh và  mu  - 20
0
C ít
nht 3 h. Sau ó, ly tâm mu  12000
vòng/phút trong 10 phút. Loi b dch phía
trên và ra kt ta thu ưc bng 300 l
EtOH lnh 70%, o nh và ly tâm  12000
vòng/phút trong 5 phút. Thu li và làm khô
kt ta; hòa tan kt ta vi 50 l nưc ct
kh ion sau ó x lý loi b ARN .
Các mu ADN tng s sau ó s ưc
kim tra cht lưng bng phương pháp in
di trên gel agarose 1% và o quang ph hp
th (OD
260/280nm
)  kim tra hàm lưng và
cht lưng ADN tng s thu ưc.
2.4. Thit k Primer c hiu. Trên cơ s
trình t gen ver (Acession number: M91369)

ã ưc ăng ký trong ngân hàng gen th
gii, chúng tôi s dng chuơng trình CLC
Bio 3.1  thit k cp mi VER-496F (5’-
ATGTCGGATAAT CACCGTTTAGATGGC-3’)
và VER-1391R (5’-ATGTCGGATAAT
CACCGTTTAGATGGC-3’)  nhân phân
on có kích thưc 896 bp ca gen ver-1
(Hình 1). N hng chng nm có băng ADN
kích thưc 900bp ưc khuych i bng cp
mi trên ưc xem là có kh năng sinh c t
Aflatoxin. Hưng nghiên cu trên s là cơ s
cho chúng tôi xây dng phương pháp có th
chuNn oán s nhim và nh lưng ưc
mc  nhim nm Aspergillus spp. sinh c
t Aflatoxin t các mu lc hay các cây lương
thc khác.






Hình 1. Cấu trúc gen ver và vị trí cặp mồi được thiết kế trên gen. Gen ver có kích thước
khoảng 1.76 kb, tận cùng đầu 5’ và đầu 3’ là vùng không phiên mã (5’UTS và 3’UTS) dài
khoảng 400bp và 372bp; khung đọc mở (ORF) nằm từ vị trí 400 đến vị trí 1393, mã hoá
cho 262 a.amin; trong khung đọc mở có tồn tại 3 đoạn exon và 2 đoạn intron. Cặp mồi
được thiết kế nằm trọn trong khung đọc mở, có kích thước lý thuyết 896bp (~ 900bp).
2.5. Phn ng PCR c hiu. Các mu
DN A ã tách chit ưc pha loãng v nng
 20ng/l  làm khuôn cho phn ng

PCR c hiu xác nh s tn ti ca gen
ver trong genome. Phn ng PCR ưc
tin hành  th tích 20 l cha 0,2 l Taq
5’UTS
5’
3’
3’UTS
Exon 1

Exon 2

Exon 3

400 - ATG
1393 - GAT
Ver –496F

Ver –1391R

1765 bp
896 bp
Intron
polymerase (5 u/l) ca Promega, 2 l
buffer 10X, 0,2 mM dNTPs và 20 pmol
mỗi mồi. Phản ứng PCR được thực hiện
bằng máy nhân gen Genius trong 35 chu
kỳ với chương trình nhiệt được thiết lập
như sau: Biến tính 94
0
C trong 45 giây, gắn

mồi ở 55
0
C trong 45 giây và kéo dài ở
72
0
C trong 1 phút. Các phân đoạn sản
phNm ưc in di kim tra trên gel
agarose 1% và ghi nhn hình nh bng h
thng máy nh N ikon.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Phân lp nm bnh Aspergillus
spp. t mt s mu lc ca Vit N am. S
dng c 2 phương pháp thu thp nm:
(i) t ht lc lên ĩa petri có lp giy
thm kh trùng ưc làm ưt (5 - 6
ht/ĩa) và (ii) t v la ht lc lên môi
trưng PDA c (5 - 6 ming v/ĩa) chúng
tôi ã thu ưc các chng nm Aspergillus
spp. nh vào các c im hình thái bên
ngoài như màu sc và vt loang ca
khuNn lc trên môi trưng (Hình 2). Kt
qu nhn thy bng phương pháp t v
lc trên ĩa môi trưng PDA c, 
nhim khuNn và ln nhiu loi nm khác
(nhim 40%) là thp hơn nhiu so vi
phương pháp t c ht lc trên giy
thm kh trùng (nhim 70%).

Hình 2. Phương pháp thu nhận và phân lập
mẫu nấm bệnh từ hạt lạc trên giấy thấm

khử trùng được làm ướt (A) và từ vỏ hạt lạc
trên môi trường PDA đặc (B).
Qua theo dõi và thng kê chúng tôi
nhn thy t l các ht lc b nhim nm là
rt cao (dao ng t 80 - 100%) và không
có s khác bit ln v t l nhim nm ca
lc thu thp trong dân (sau khi thu hoch)
so vi ngun lc trên th trưng. iu ó
cho thy ngun nm bnh ã ưc lây
nhim t ng rung n kho bo qun và
ngưc li. Hu ht các mu lc b nhim
nm A. flavus (có khuNn lc màu xanh
vàng, mt sau màu vàng - Hình 3A1) và
A. niger (khuNn lc màu en, mt sau màu
trng hoc vàng - Hình 3A2) và không thu
nhn ưc bt kỳ mu nm nào có c im
hình thái ca nm A. paraciticus. iu này
cho thy nm bnh Aspergillus spp. sinh
c t Aflatoxin ph bin trên lc  Vit
N am là chng A. flavus.
Trên hai môi trưng PDA và Czapek
c ưc s dng, có s khác bit v hình
thái khuNn lc và tc  phát trin ca nm
khi nuôi cy (Hình 3). Tc  phát trin ca
nm Aspergillus spp. trên môi trưng
Czapek chm hơn so vi trên môi trưng
PDA. Trên môi trưng PDA, ưng kính
khuNn lc nm t trung bình là 6 - 7 cm qua
7 ngày nuôi cy và t mc ti a 9 cm sau
khong 20 ngày. Trên môi trưng Czapek,

qua 7 ngày nuôi cy, ưng kính trung bình
ca khuNn lc ch t ưc là 3,5 - 4 cm, ti
a t ưc là 7 cm sau 20 ngày. Xét riêng
vi 2 loài nm A. flavus và A. niger, chúng tôi
nhn thy mc  nhim nm trên lc cũng
như tc  phát trin ca nm loài A. flavus là
cao hơn so vi loài A. niger, t ó có th thy
A
B
nguy cơ ln ca vic nhim nm cũng như
nhim c t Aflatoxin cao trên các mu lc
ưc kho sát  Vit N am (Hình 3).


Hình 3. Hình thái nấm Aspergillus spp. phân lập được từ mẫu lạc. A. Mẫu nấm A. flavus:
trên môi trường PDA (A1) khun lạc phát triển nhanh và vùng nấm mới phát triển có màu
vàng nhạt, vùng nấm bên trong có màu xanh. Trên môi trường Czapek (A2) nấm sinh
trưởng chậm hơn, màu sắc đậm hơn và có xuất hiện các hạch nấm màu đen. A3: Hình ảnh
thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A.flavus quan sát dưới kính hiển vi (X 1600).
A4: ấm A. flavus trong nuôi cấy lỏng. B. Mẫu nấm A. niger: Trên môi trường Czapek (B1)
khun lạc phát triển chậm hơn và màu của khun lạc cũng đậm hơn và có xuất hiện một số
“hạch nấm” trên khun lạc - có thể do môi trường Czapek nghèo dinh dưỡng hơn;
B2: Hình ảnh sợi nấm A. niger quan sát dưới kính hiển vi (X 1600).
Các mu nm Aspergillus thu ưc sau
khi làm thun s ưc cy chuyn sang môi
trưng PDA và Czapek lng  nuôi cy
thu sinh khi. Kt qu cho thy, không có
s khác bit nào áng k khi nuôi cy nm
Aspergillus trên 2 môi trưng lng này, sau
khong 5 ngày, s thu ưc lưng sinh khi

nấm đủ để tách chiết ADN tổng số. Điều
kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy này là
200 v/p, ở 28 - 30
0
C (Hình 3A4). Chúng tôi
cũng tiến hành làm các tiêu bản nấm
Aspergillus phân lập được bằng hai cách,
làm tiêu bản với mẫu nấm nuôi cấy trên
môi trường đặc và làm tiêu bản với mẫu
nấm nuôi cấy lỏng để quan sát hình dạng
bào tử, cuống sinh bào tử, thể bình , so
sánh để khẳng định chính xác hơn các loài
nấm đã phân lập (Hình 3).
2. Kết quả tách chiết ADN. Trong thí
nghiệm này chúng tôi đã khảo sát một số
phương pháp tách chiết ADN tổng số ở nấm
men, nấm sợi cũng như nấm Aspergillus spp.
đã được công bố. Tuy nhiên, sau khi thử
nghiệm chúng tôi nhận thấy phương pháp
tách chiết dựa trên quy trình của Eric W.
A
B
A1 A2 A3 A4
B1 B2
Boehm vi các mu nm nuôi cy trong
môi trưng lng là hiu qu nht.
Vì th chúng tôi quyt nh s dng
phương pháp này  tách chit cho các mu
nm ã ưc làm thun mang các c im
hình thái c trưng ca nm A. flavus và

nm A. niger. Kt qu chúng tôi thu ưc
15 mẫu ADN tổng số nấm A. flavus với
hình ảnh điện di trên gel agarose 1% rõ nét
với hàm lượng ADN trung bình từ 300 -
500 ng/µl (Hình 4) và 5 mẫu ADN tổng số
nấm A. niger sử dụng làm đối chứng cho
phản ứng PCR. Các mẫu ADN tổng số
được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng
PCR đặc hiệu với cặp mồi đã thiết kế.

Hình 4. Ảnh điện di AD tổng số các mẫu nấm trên gel agarose 1%.
M: Marker λ HindIII; 1 - 4: ấm A. flavus ghệ An, 5 - 7: ấm A. flavus Hải Dương;
8 - 10 nấm A. flavus Hà ội; 11 - 13: ấm A. niger ghệ An; 14: ấm A. niger Hải Dương
và 15: ấm A. niger chun.
3. Kt qu phân tích bng phn ng
PCR c hiu. Từ 15 mẫu ADN tổng số
thu được của isolate A. flavus chúng tôi
chọn ra 7 mẫu ADN tổng số để làm khuôn
cho thí nghiệm tối ưu hoá điều kiện phản
ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi VER. Điều
kiện cho phản ứng PCR như đã trình bày ở
phần vật liệu và phương pháp. Nồng độ
khuôn ADN tổng số được thay đổi từ 1 ng,
2 ng, 10 ng, 20 ng, 100 ng và 200 ng cho
thể tích phản ứng là 20 µl để tối ưu hoá
nồng độ khuôn ADN. Kết quả phân tích
cho thấy khoảng nồng độ thích hợp cho
mồi VER dao động từ 2 - 20 ng, tuy nhiên
ở nồng độ 20 ng các phân đoạn ADN được
khuyếch đại tốt nhất và nồng độ 20 ng

được chúng tôi duy trì để tối ưu hoá nhiệt
độ gắn mồi. Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi
là rất quan trọng và trong thí nghiệm này
chúng tôi nhận thấy ở nhiệt độ gắn mồi
50
0
C các băng cần khuyếch đại đều xuất
hiện tuy nhiên có xuất hiện những băng
không đặc hiệu. Ở nhiệt độ gắn mồi 55
0
C,
hiệu suất gắn mồi và khuyếch đại gen vẫn
được duy trì và các băng không đặc hiệu
đã biến mất.
Sau khi đã thiết lập được điều kiện
thích hợp cho phản ứng mồi đặc hiệu,
chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với
tất cả các mẫu ADN tổng số của các mẫu
nấm phân lập được và đối chứng được sử
dụng trong thí nghiệm này là mẫu ADN
tổng số của mẫu A. niger. Kết quả thu
được các băng ADN khuyếch đại có kích
thước xấp xỉ 900bp, tương đồng với kích
thước lý thuyết đã tính toán là 896bp ở tất
cả các phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là
ADN tổng số nấm A. flavus. Các isolate
A. flavus phân lập được ở các vùng sinh
thái khác nhau đều cho kết quả dương tính
với các mồi đặc hiệu, trong khi các chủng
A. niger sử dụng làm đối chứng đều cho

kết quả âm tính với các mồi đặc hiệu (Hình
5). Điều này chứng tỏ cặp mồi đã thiết kế
và điều kiện phản ứng PCR chúng tôi thiết
lập được là có thể sử dụng phân biệt loài
A. flavus và A. niger. Điều đó cũng có
nghĩa là phương pháp của chúng tôi hoàn
toàn có thể nhận biết được các nấm có khả
năng sinh độc tố Aflatoxin với các nấm
không sinh độc tố, bởi các nấm A. flavus
được coi là loài sinh độc tố Aflatoxin rất
mạnh trong khi nấm A. niger là loài hoàn
toàn không sinh độc tố.


Hình 5. Hình ảnh điện di sản phm khuyếch đại với mồi Ver trên gel agarose 1%
M: Marker; 1 - 3: A. flavus ghệ An; 4 - 6: A. flavus Hải Dương; 7: A. flavus Hà ội;
C: Đối chứng A. niger chun. Các mẫu có đặc điểm hình thái điển hình của A. flavus đều
cho băng đặc hiệu ~ 900bp còn mẫu đối chứng là mẫu A. niger chun không có băng đặc
hiệu (Hình ảnh thu nhận bằng máy chụp ảnh ikon)
IV. KẾT LUẬN
Con đường sinh tổng hợp Aflatoxin ở
nấm bệnh Aspergillus đã được nghiên cứu
khá chi tiết ở mức độ phân tử. Ít nhất có 20
gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào
con đường này và một số gen quan trọng đã
được giải trình tự và nghiên cứu chức năng
đầy đủ. Trong các gen quan trọng tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, ver,
omt và apa đang được quan tâm và sử dụng
làm gen đích trong các nghiên cứu xác định

nấm Apergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng
kỹ thuật PCR (Hình 6).
Trong nghiên cứu có tính chất bước đầu
thử nghiệm khả năng sử dụng phương pháp
PCR đ chNn oán nm Apergillus sinh c
t Aflatoxin. Chúng tôi ã thit lp ưc
phương pháp ti ưu phân lp nm A. flavus,
phương pháp ti ưu tách chit ADN tng s
và c bit là chúng tôi ã ti ưu ưc iu
kin cho phn ng PCR  có th chNn oán
s có mt ca nm A. flavus vi cp mi gen
ver. ây là cơ s cho phép chúng tôi tip tc
M 1 2 3 4 5 6 7 M C
900bp
1500bp
1000bp
800bp
hoàn thin phương pháp  có th xác nh
các chng nm Apergillus có kh năng sinh
c t Aflatoxin nh phn ng PCR c
hiu vi các gen khác như ver, omt, apa
trc tip trên các mu lc nghiên cu, to
mt phương pháp b sung có hiu qu
nhm chNn oán nhanh và chính xác nm
bnh Aspergillus spp. sinh c t Aflatoxin
trên lc cũng như các loi nông sn khác
của Việt Nam

Hình 6. Sơ đồ minh họa con đường sinh tổng hợp Aflatoxin B
1

ở nấm bệnh Aspergillus.
Gen apa là gen điều khiển liên quan đến việc chuyển averufin thành versiconal hemiacetal
acetate, dẫn đến sự tập trung acetate cần thiết trước khi bước vào con đường sinh tổng
hợp Aflatoxin. Gen ver mã hoá cho enzyme chuyển hoá versicolorin A thành
sterigmatocystin và gen omt mã hoá cho enzyme chuyển hoá sterigmatocystin thành
O- methylsterigmatocystin là tiền chất của Aflatoxin B
1
.
TÀI LIU THAM KHO
1. Kurtzman C.P., et al., 1987. Antonie
Leeuwenhoek 53:147-157.
2. Yu J., et al., 2005. Rev. Iberroem.Miccil.
22:194-202.
3. Kolosova A.Y., et al., 2006. Anal.
Bioanal.Chem. 384:286-94.
4. Jarvis B., D.A.L.Seiler., A.J.L.Ould and
A.P.William, 1983. J.Appl.Bacteriol.
55:325-336.
5. Stroka J., Van O. R. and Anklam E,
2000. J.Chromatoqr.A. 904(2):251-6.
6. Jaimez J., Fente CA., Vazquez BI.,
Franco CM., Cepeda A., Mahuziez G.,
and Pronqnon P, 2000. J.Chromatoqr
A. 882(1-2):1-10.
7. Bintvihok, A., Y. Adachi, and K. Hirano,
1992. Toxicon 30:492-497.
8. Cheng, R., J. Tsay, Y. Huang, and R. Y.
Chiou, 2002. J. Food Prot., 65:840-844.
9. Farber, P., R. Geison, and W. H.
Holzapfel, 1997. Int. J. Food Microbiol.

36:215-220.
10. Geisen, R, 1996. Syst. Appl. Microbiol.
19:388-392.
11. ostate-
pueblo.edu/biology/dcaprio/351L/Proje
ct1351L.html
12. />TAB%20Method.pdf
13. tocol-
online.org/prot/Protocols/Fungal-
Genomic-DNA-Extraction-1200.html
14. />g/protocols/yeast_genomic_DNA.html
15. www.fgsc.net/fgn37/borges.html
gười phản biện: gô Vĩnh Viễn
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
10